Результат интеллектуальной деятельности: БИОПРЕПАРАТ С ПРОБИОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ УСВОЕНИЯ КОРМОВ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ ДЛЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ И ПТИЦЫ

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и может быть использовано при приготовлении кормов для сельскохозяйственных животных и птицы.

Известен штамм Bacillus firmus ВГНКИ "СК", используемый для изготовления пробиотического препарата, предназначенного для профилактики и лечения бактериальных кишечных инфекций молодняка сельскохозяйственных животных, RU №2190016 C1, C12N 1/20, А23К 35/74, 27.09.2002.

Известен штамм бактерий Bacillus licheniformis BKM В-2414Д, используемый для получения компонента пробиотической кормовой добавки, предназначенной для производства высококачественных кормов, повышающих продуктивность и снижающих риск желудочно-кишечных заболеваний животных, птицы и рыб, RU №2398872 C1, C12N 1/20, А23К 35/74, А23К 1/165, 10.09.2010.

Известен штамм Bifidobacterium gallinarum ГБ, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к кормам, ферментированных и неферментированных кормов, предназначенных для профилактики и лечения кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственной птицы, RU №2301828 C1, C12N 1/20, А61К 35/74, А23К 1/165, 27.06.2007.

Известен пробиотический штамм Bacillus subtilis 8130, на основе которого создана кормовая добавка пробиотического действия «Пробиоцел», оказывающая влияние на кишечную микрофлору, секреторную и ферментативную активность желудочно-кишечного тракта животных и в целом активизирующая функциональную активность, улучшая обмен веществ, dissercat. com/content/izuchenie..... RU №2346463 C2, A23K 1/165, 20.02.2009.

Известен пробиотический препарат, предназначенный для лечения и профилактики гастроэнтерита поросят-отъемышей, на основе штамма Bacillus subtilis ТПИ и штамма Bacillus lichemformis, представляющий собой смесь культуральных жидкостей, содержащих продукты микробного синтеза данных штаммов, с концентрацией микробных клеток 5 млрд м.к./см³ в объемном соотношении указанных штаммов 1:1, в которую внесено равное по массе количество смеси отрубей и дикальцийфосфата, RU №2399662 C1, C12N 1/20, А23К 1/16, 20.09.2010; RU №2399661 C1, C12N 1/20, А23К 1/16, 20.09.2010.

Известны пробиотическая композиция для животных и птицы, содержащая бактерии Rhuminococcus albus. Bacillus subtilis, взятые в равных количествах, и способ получения пробиотической композиции, RU №2266747 C1, A61K 35/66, A23K 1/165, 27.12.2005; RU №2266126 C1, A61K 35/66, A23K 1/165, 20.12.2005.

Известна пробиотическая добавка, содержащая биомассу спорообразующих бактерий Bacillus subtilis и носитель гидрофильный марки А и гидрофобный марки AM, RU №2252956 C2, C12N 1/20, A23K 1/165, А23К 35/66, 27.05.2005.

Известны пробиотическая кормовая добавка, включающая смесь биомассы бактерий штаммов Bacillus subtilis ВКПМ 10172 и Bacillus licheniformis ВКПМ 10135 в равных соотношениях в споровой форме при их суммарном количестве не менее 2-10⁸ спор/г, и углеводный протектор, RU №2437563 С1, А23К 1/00, 27.12.2011.

Известные препараты индивидуальны, в которых штаммы культивированы в различных средах и при определенных условиях.

Известен биопрепарат профилактики и лечения инфекционных болезней и дисбиоза различной этиологии, содержащий микробную массу штамма бактерий рода Bacillus, взятую в эффективном количестве, RU №2264454 С2, C12N 1/20, А23К 35/66, 20.11.2005.

Данное техническое решение принято в качестве ближайшего аналога настоящего изобретения.

Биопрепарат в ближайшем аналоге содержит микробную массу штаммов Bacillus subtilis ВКПМ № В-8611, Bacillus licheniformis ВКПМ №В-8610, характеризующихся широким спектром антагонистической активности, высокой протеолитической и амилазной активностью.

Однако использование в биопрепарате ближайшего аналога двух штаммов усложняет биотехнолигический процесс его получения.

В основу настоящего изобретения положено решение задачи, позволяющей выявить новый биопрепарат с высокой пробиотической активностью при простом биотехнолигическом процессе его получения.

Технический результат настоящего изобретения заключается в использовании штамма бактерий Bacillus cereus 1-79 в качестве основы биопрепарата с высокой пробиотической активностью.

Согласно изобретению эта задача решается за счет того, что биопрепарат с пробиотической активностью для оптимизации усвоения кормов, предназначенных для сельскохозяйственных животных и птицы, содержит микробную массу штамма бактерий рода Bacillus, взятую в эффективном количестве.

В качестве штамма взят штамм бактерий Bacillus cereus 1-79.

Штамм бактерий Bacillus cereus 1-79 депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов под регистрационным номером штамм Bacillus cereus 10.09.63 ДЕП и хранится в коллекции микроорганизмов ООО «БИОТРОФ».

Штамм бактерий Bacillus cereus 1-79 состоит из микробной массы спорообразующих бактерий Bacillus cereus 1-79 с титром 3,5×10⁹ КОЕ/г -4,0×10⁹ КОЕ/г и суспендирован в питательной среде.

Заявителем не выявлены источники, содержащие информацию о технических решениях, идентичных настоящему изобретению, что позволяет сделать вывод о его соответствии критерию «новизна».

За счет реализации отличительных признаков изобретения (в совокупности с признаками, указанными в ограничительной части формулы) достигаются важные новые свойства объекта.

Выявление нового штамма бактерий Bacillus cereus 1-79 позволяет получить биопрепарат с высокой пробиотической активностью.

Заявителю не известны какие-либо публикации, которые содержали бы сведения о влиянии отличительных признаков изобретения на достигаемый технический результат. В связи с этим, по мнению заявителя, можно сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «изобретательский уровень».

Настоящее изобретение осуществляют следующим образом.

Видовая идентификация штаммов микроорганизмов

Образцы биопрепаратов анализировали молекулярно-генетическим методом секвенирования.

ДНК из биопрепаратов выделяли согласно стандартному протоколу «Набора для выделения геномной ДНК из различных источников».

Установлена ключевая часть последовательности ДНК штамма бактерий Bacillus cereus.

Штамм бактерий Bacillus cereus является основой биопрепарата с пробиотической активностью для оптимизации усвоения животных кормов.

Bacillus cereus partial 16S rRNA gene, strain В 203 (100%).

Отбор штаммов бактерий для использования в качестве основы биопрепаратов с пробиотической активностью

Критерием отбора штамма бактерий Bacillus cereus как основы биопрепарата с пробиотической активностью является высокая антагонистическая активность к тест-культурам гнилостных бактерий и плесневых грибов.

Результаты отбора штаммов бактерий Bacillus cereus по антагонистической активности представлены в Таблице 1.

Из Таблицы 1 видно, что штамм бактерий Bacillus cereus 1-79 обладает высокой антагонистической активностью по отношению к гнилостным бактериям, плесневым грибам и дрожжам.

Штамм бактерий Bacillus cereus 1-79 был проверен на патогенные свойства.

В соответствии с ГОСТ 12.1.007-76 проведены исследования штамма бактерий Bacillus cereus 1-79 на патогенные свойства: вирулентность, токсичность, токсигенность, способность вызывать дессиминации во внутренних органах теплокровных животных.

Испытания проведены на беспородных белых крысах и беспородных белых мышах.

Вирулентность и диссеминацию штамма бактерий Bacillus cereus 1-79 изучали при однократном введении суточной агаровой культуры в физиологическом растворе в желудок белым мышам и белым крысам в дозах по 10⁶, 10⁷, 10⁸ и 10⁹ и внутрибрюшинно по 10⁶, 10⁷, 10⁸ и 10⁹ микробных клеток (м.к.) на животное. В опыте использовали по 12 животных на дозу (6 самцов и 6 самок). В период наблюдения клинических симптомов заболевания у животных не наблюдалось, гибель отсутствовала. Через 30 суток после введения культуры микроорганизмов животных умерщвляли ингаляцией СО₂ и методом отпечатков делали посев из крови и внутренних органов (легких, печени, почек и селезенки) на чашки Петри с агаризованной средой. Рост культуры в высевах из органов животных при обоих способах введения не обнаружен.

Токсичность штамма бактерий Bacillus cereus 1-79 оценивали путем внутрибрюшинного введения мышам взвеси агаровой культуры микроорганизмов, приготовленной на стерильном физиологическом растворе и инактивированной нагреванием при 60°С в течение 30 минут в концентрациях 10 и 10 (м.к.) на животное (по 6 особей на дозу). В течение срока наблюдения - первые двое суток - гибели мышей не было.

Токсигенность штамма бактерий Bacillus cereus 1-79 изучали на мышах путем внутрибрюшинного и внутрижелудочного введения стерильного фильтрата культуральной жидкости (фильтрация через фильтр Мillipor с размером пор 0,45 мкм) 3-х и 7-суточных культур в дозах 0,3 мл, 0,6 мл и 1,0 мл (по 6 особей на дозу). Животным контрольных групп вводили стерильную жидкую питательную среду в таких же объемах. Гибели мышей не было. ЛД50 не установлена, при обоих способах введения она превышала 1,0 мл на животное для 3-х и 7-суточных культуральных жидкостей.

Результаты представлены в Таблице 2.

Из Таблицы 2 видно, что штамм бактерий Bacillus cereus 1-79 по показателям вирулентности, диссеминации, токсичности и токсигенности не патогенен для теплокровных животных и относится к 4 классу опасности (малоопасен), что удовлетворяет требованиям, предъявляемым к промышленным микроорганизмам.

Дополнительные исследования выявили у штамма бактерий Bacillus cereus 1-79 высокую целлюлозолитическую активность. По этому критерию указанный штамм был сделан основой для биопрепарата с пробиотической активностью.

Штамм бактерий Bacillus cereus 1-79 - основа биопрепарата с пробиотической активностью.

Определение оптимальных условий роста штамма бактерии Bacillus cereus 1-79 биопрепарата с пробиотической активностью.

Результаты отбора приведены в Таблице 3, где

- Среда 1 - меласса 1,5%; кукурузный экстракт 0,9%; кормовые дрожжи 2%.

- Среда 2 - кукурузный экстракт 5%; лактоза 1%.

- Среда 3 - соевая мука 3%, нитрат натрия 0,3%, калий фосфорнокислый двузамещенный 0,1%, калий фосфорнокислый однозамещенный 0,1%, сульфат магния 0,02%, калий хлористый 0,02%.

Из Таблицы 3 видно, что наилучшим условиям роста штамма бактерии Bacillus cereus 1-79 соответствует среда 3.

В среде 3 спорообразующие бактерии Bacillus cereus 1-79 имеют титр 3,5×10⁹ КОЕ/г - 4,0×10⁹ KOE/г.

Приготовление биопрепарата на основе штамма бактерий Bacillus cereus 1-79

Штамм бактерии Bacillus cereus 1-79 используют для получения маточной культуры.

Выращивают маточную культуру от 2 до 5 суток в термостате на качалочной платформе при температуре 32°С.

Состав производственной среды приведен в Таблице 4.

Питательную среду готовят в ферментере, тщательно перемешивая и стерилизуя горячим паром при давлении 1,6 атм и температуре 128°С в течение 1 часа. После стерилизации среду охлаждают до температуры 38-40°С, при перемешивании стерильно вносят маточную культуру и выращивание ведут в течение 24-48 часов.

Культуральную жидкость из ферментера смешивают со шротом и высушивают в шкафах сушильных РТ-ШС при температуре от 40 до 60°С в течение 9 часов до конечной влажности 7,0-7,2%.

Далее высушенную кормовую добавку измельчают до размера частиц не более 2 мм с титром бактерий 10⁶-10⁹ клеток/г кормовой добавки.

С учетом оптимальных условий роста был наработан биопрепарат на основе штамма бактерий Bacillus cereus 1-79 с высокой пробиотической активностью.

Установлены характеристики биопрепарата:

- внешний вид и цвет: крупка светло-коричневого цвета;

- биопрепарат состоит из штамма микроорганизмов Bacillus cereus 1-79, не подвергавшихся генно-инженерным модификациям;

- титр бактерий, не являющихся молочнокислыми бактериями, составляет 3,5×10⁹ КОЕ/г - 4,0×10⁹ KOE/г;

- отмечена целлюлозолитическая активность - 11,9% по методу Хендерсона, Хорвата и Блока в модификации Чюрлиса;

- посторонняя микрофлора отсутствует.

Из коллекции производственных штаммов выявлен штамм бактерий Bacillus cereus 1-79 с пробиотической активностью для оптимизации усвоения кормов для сельскохозяйственных животных и птицы.

Штамм Bacillus cereus 1-79 депонирован 18 апреля 2011 г. во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (123022, г.Москва, Звенигородское шоссе, 5).

Штамм Bacillus cereus 1-79 депонирован под регистрационным номером штамм Bacillus cereus 10.09.63 ДЕП.

Штамм Bacillus cereus 1-79 предложен для использования в составе кормовых добавок и лекарственных средств для животных.

Штамм Bacillus cereus 1-79 хранится в коллекции микроорганизмов ООО «БИОТРОФ» (196608, Санкт-Петербург, г.Пушкин, ш. Подбельского, 9).

Экспериментальные исследования по использованию биопрепарата на основе штамма бактерий Bacillus cereus 1-79 подтверждают примеры 1-3.

Пример 1. Использование биопрепарата - ферментативного пробиотика на основе штамма бактерий Bacillus cereus 1-79 в птицеводстве

Опыт проводили в период с апреля по июль 2010 г. на базе ФГУП Загорское ЭПХ ВНИТИП Россельхозакадемии на бройлерах кросса Кобб Авиан 48 с суточного до 35-дневного возраста по схеме, представленной в Таблице 5.

Птица содержалась в клеточных батареях фирмы «Big Dutchman» (размеры Г×Ш×В - 150×120×50 см). В период опыта учитывали основные зоотехнические показатели, были проведены балансовые опыты, в конце выращивания был произведен убой птицы с последующей анатомической разделкой. Поголовье в группах составляло по 35 голов.

Из Таблицы 5 видно, что в 3-й опытной группе в основной рацион птицам вводили биопрепарат на основе штамма бактерий Bacillus cereus 1-79.

Результаты опыта представлены в Таблице 6.

Результаты свидетельствуют, что живая масса птицы опытных групп была близка к контролю с незначительной тенденцией к повышению.

Учитывая, что в группах было разное количество курочек и петушков анализ полученных данных по живой массе проведен по средней арифметической величине между массой курочек и петушков.

За счет добавок препарата на основе штамма бактерий Bacillus cereus l-79 в 3-й опытной группе средняя живая масса птицы превышала контроль на 1,53%.

Во 2-й контрольной группе (с целлобактерином) средняя живая масса птицы превышала контроль на 0,8%.

На фоне более дешевых комбикормов различия в живой массе значительные.

Пример 2. Использование биопрепарата - ферментативного пробиотика на основе штамма бактерий Bacillus cereus 1-79 при откорме свиней

Научно-производственный опыт проводили на свиноферме ОАО ПЗ «Пламя» Ленинградской обл. Было отобрано 86 голов свиней 120-дневного возраста породы мясная скороспелая, распределенные по принципу аналогов (с учетом возраста, живого веса и среднесуточных привесов в подготовительный период) на две группы.

Содержание свиней было групповое по 15 голов в станке. Кормление животных было двухразовое. Продолжительность опыта составила 92 дня до достижения живого веса 90-100 кг.

В опытной группе в комбикорм вводили биопрепарат на основе штамма бактерий Bacillus cereus 1-79 (из расчета 2 кг на 1 тонну комбикорма).

В течение опыта проводили ежемесячное взвешивание, вели наблюдение за состоянием здоровых животных и процессом пищеварения.

Полученные результаты представлены в Таблице 7, откуда видно, что введение в рацион свиней биопрепарата на основе штамма бактерий Bacillus cereus 1-79 пробиотика благоприятно сказывается на здоровье животных, снижаются затраты кормов на единицу продукции, увеличивается прирост живой массы, повышается сохранность поголовья свиней, снижается применение антибиотиков и других лекарственных средств.

Пример 3. Использование биопрепарата - ферментативного пробиотика на основе штамма бактерий Bacillus cereus 1-79 при откорме поросят

Научно-производственный опыт проводили на поросятах-отъемышах на свиноферме ОАО ПЗ «Пламя» Ленинградской обл. в период с 1 марта по 30 апреля 2011 г. Продолжительность опыта 60 дней.

В опытной группе в комбикорм вводили биопрепарат на основе штамма бактерий Bacillus cereus 1-79 (из расчета 1 кг на 1 тонну комбикорма). Животные охотно поедали такой комбикорм.

Полученные результаты представлены в Таблице 8, откуда видно, что введение в рацион поросят-отъемышей биопрепарата на основе штамма бактерий Bacillus cereus 1-79 пробиотика способствовало повышению иммунитета, нормализации процессов пищеварения, повышению переваримости и усвояемости питательных веществ рациона, поросята всегда были бодрыми и с аппетитом поедали предложенный корм. В опытной группе среднесуточные привесы у поросят-отъемышей были выше на 6,3%.

На основании Примеров 1-3 установлено, что сухой биопрепарат на основе штамма бактерий Bacillus cereus 1-79 с пробиотической активностью соответствует усвоению кормов у птицы и при откорме свиней и поросят-отъемышей.

Полученные результаты подтверждают целесообразность использования нового биопрепарата на основе штамма бактерий Bacillus cereus 1-79, обладающего высокой пробиотической активностью.

Предложенный биопрепарат с пробиотической активностью для оптимизации усвоения животного корма получен по известным биотехнологиям, имеющим широкое применение в сельском хозяйстве, и проведенные опытные работы на базе ФГУП Загорское ЭПХ ВНИТИП Россельхозакадемии, на свиноферме ОАО ПЗ «Пламя» Ленинградской обл., обусловливают, по мнению заявителя, его соответствие критерию «промышленная применимость».

Предложенный биопрепарат обладает высокой пробиотической активностью и способствует оптимизации усвоения животного корма. Биотехнология получения биопрепарата на основе штамма бактерий Bacillus cereus 1-79 проста.

Подбор штаммов бактерий Bacillus cereus по антагонистической активности

Результаты исследования штамм бактерий Bacillus cereus 1-79 на патогенные свойства

Подбор оптимальных условий роста штаммов бактерий Bacillus cereus 1-79 биопрепарата с пробиотической активностью (рост через 24 часа, КОЕ/мл)

Состав производственной среды для получения биопрепарата на основе штамма бактерий Bacillus cereus 1-79

Схема опыта по использованию биопрепарата пробиотика в птицеводстве на основе штамма бактерий Bacillus cereus 1-79

Зоотехнические показатели по использованию биопрепарата пробиотика в птицеводстве на основе штамма бактерий Bacillus cereus 1-79

Показатели по использованию биопрепарата на основе штамма бактерий Bacillus cereus 1-79 пробиотика при откорме свиней

Показатели по использованию биопрепарата на основе штамма бактерий Bacillus cereus 1-79 пробиотика при откорме поросят