Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОСКА И СТЕРИНОВ ИЗ МОРСКОЙ ЗВЕЗДЫ Patiria pectinifera

Изобретение относится к технологии переработки природных объектов и касается способа получения воска и стеринов из морской звезды Patiria pectinifera.

Воски представляют собой сложные эфиры высших жирных кислот и высших высокомолекулярных спиртов и могут быть минерального, животного, растительного и морского происхождения. Воски устойчивы к действию света, окислителей, нагреванию. Они применяются для уплотнения мазевых основ, кремов [RU 2277410 С2, 20.01.2006; RU 2290170 С1, 27.12.2006; RU 2480199 С2, 20.01.2013], повышают вязкость жиров и углеводов [RU 2167536 С1, 27.05.2001]. Воски используются в составе пищевых композиций [RU 2100938 С2, 10.01.1998; RU 2302743 С2, 20.07.2007; RU 2476076 С2, 27.02.2013], в составе фармацевтических и лечебно-профилактических средств [RU 2396081 С1, 10.08.2010; RU 2497376 С2, 10.11.2013], в составе сельскохозяйственной композиции в качестве кондиционирующего агента [RU 2291847 С2, 20.01.2007].

Среди животных восков одним из наиболее значимых является спермацет, который добывали из черепных полостей и тела кашалота и некоторых других видов китов [Wellendorf М. // Nature. 1963. V. 198. Р. 1086-1087]. Спермацет широко используется в парфюмерно-косметической промышленности. Он оказывает противовоспалительное, регенерирующее, ранозаживляющее, защитное действие, входит в состав биологически активных добавок [RU 2102062 С1, 20.01.1998; RU 2238092 С2, 20.10.2004; RU 2161887 С1, 20.01.2001]. В связи с запретом на китобойный промысел природный спермацет в составе кремов и мазей чаще всего заменяют импортными синтетическим цетилпальмитатом или киталаном.

Стерины - гидроароматические нейтральные спирты, являющиеся производным стероидов. Известны зоостерины, фитостерины и микостерины. Значительное количество стеринов содержится в гидробионтах: моллюсках, голотуриях, а также в спермацете кашалотов [Drazen J.C. // Comp. Biochem. and Physiol. 2008. V. 151 В. P. 79-87; Кандюк Р.П. // Экологические проблемы Черного моря: Сб. научн. ст./ ОЦНТЭИ; Одесса: ОЦНТЭИ. 1999. с. 330; Morris R.J. // Deep-Sea Research. 1973. V. 20. P. 911-916], и в ряде растительных объектов [RU 2015150 С1, 30.06.1994; RU 2238291 С1, 20.10.2004]. Стерины используются для приготовления медицинских, косметологических препаратов, БАД к пище [RU 2271820 С1, 20.03.2006; RU 2283318 С1, 10.09.2006; RU 2205015 С2, 27.05.2003; RU 2188563 С2, 10.09.2002; RU 2303373 С2, 27.07.2007; RU 2426452 С2, 20.08.2011].

Известен способ получения липидов, стеролов и жирно-кислотных композиций из голотурий и офиур [Drazen J.C. // Comp. Biochem. and Physiol. 2008. V. 151 В. P. 79-87]. Сущность способа состоит в следующем. У всех образцов удаляют внутренности, образцы лиофильно высушивают, измельчают, экстрагируют системой метанол-хлороформ-вода (2:1:0,8), фазы разделяют добавлением смеси хлороформ-вода. Экстракт концентрируют при температуре 40°C. Фракции разделяют методом двумерной бумажной хроматографии, получают воски, стеролы, свободные жирные кислоты и фосфолипиды. Фракции анализируют спектрофотометрическими методами.

Известен способ получения цетилпальмитата из кораллов Madrepora cervicornis [Lester D. et al. // J. Org. Chem. 1941. V. 6. P. 120-122]. Кораллы измельчают, экстрагируют в аппарате Сокслета ацетоном в течение 24 часов. Экстракт концентрируют и охлаждают. Выпавший кристаллический осадок фильтруют, промывают разбавленным ацетоном и высушивают в вакууме, затем перекристаллизовывают из ацетона.

Вышеописанные способы являются лабораторными и для промышленного производства непригодны (используются токсичные и пожароопасные реактивы). Полученные продукты применяют в лабораторных структурных исследованиях.

Среди морских гидробионтов перспективным источником биологически активных веществ являются морские звезды. Наличие в их пищевом рационе широкого диапазона различных субстратов обеспечивает возможность накопления в организме этих иглокожих разных по природе биологически активных соединений, не являющихся продуктом их собственного биосинтеза.

Известен способ получения ненасыщенных жирных кислот и стерола (эргоста-7, 22-диен-3-ола) из морской звезды Marthasterias glacialis [Pereira D.M. et al. // PLoS ONE. 2014 V. 9. N. 2. P. е8834]. Сущность этого способа состоит в следующем. Образцы замораживают, лиофильно высушивают и измельчают. Порошок экстрагируют системой ацетон-метанол (7:3) до полного обесцвечивания порошка. Экстракт помещают в делительную воронку с равным количеством смеси эфир-гексан (1:1). Добавляют 5% раствор NaCl в эквивалентном объеме. Смесь разделяют на две фазы. Верхнюю органическую фазу промывают водой и упаривают досуха. Состав фракций определен методом хромато-масс-спектрометрии с использованием газовой хроматографии. Метод лабораторный, для промышленного производства непригоден.

Способов одновременного получения восков и стеринов из морских звезд в доступной патентной и другой научно-технической литературе не обнаружено.

Одним из наиболее распространенных видов морских звезд залива Петра Великого Японского моря является Patiria pectinifera. Эти хищные иглокожие в массовом количестве скапливаются возле марикультурных огородов. Известно использование этого вида морских звезд для производства каротиноидных препаратов [RU 2469732 С1, 20.12.2012] и коллагена [RU 2509775 С1, 20.03.2014].

Технический результат, обеспечиваемый изобретением, заключается в расширении спектра биологически активных веществ, получаемых из Patiria pectinifera.

В результате осуществления изобретения получают три продукта.

1. Комплекс воска и стеринов, который может служить основой для разработки новых фармацевтических и лечебно-профилактических средств, а также новых БАД к пище.

2. Воск - основа для уплотнения мазевых основ, кремов, смягчения и улучшения эластичности пищевых композиций.

3. Стерины - биологически активные вещества в составе фармацевтических композиций и БАД к пище, применяемые для профилактики и в комплексной терапии атеросклероза и сердечно-сосудистых заболеваний.

Заявляемый способ получения воска и стеринов из морской звезды Patiria pectinifera характеризуется простотой, технологичностью, использованием стандартного оборудования, доступных недорогих реактивов, воспроизводимостью, наличием достаточного количества возобновляемых сырьевых ресурсов.

Способ заключается в следующем.

В качестве сырья используют свежевыловленных или замороженных, или законсервированных морских звезд Patiria pectinifera. Сырье сортируют, отделяют от посторонних примесей и морских гидробионтов других видов, помещают на сетчатый фильтр, промывают морской или пресной технической водой от песка и ила, подсушивают потоком воздуха при температуре 18-24°C. Замороженных морских звезд предварительно размораживают, сортируют, промывают, водой на сетчатом фильтре и подсушивают.

Подготовленное сырье заливают 96% этиловым спиртом при соотношении сырье : экстрагент 1:(1-1,2), оставляют на экстракцию в течение 18-24 ч. Экстракцию повторяют трижды. Экстракты объединяют, упаривают в вакууме при температуре 60°C. Полученный концентрат разводят дистиллированной водой до содержания этилового спирта 20-30%. Затем водно-этанольный раствор фильтруют через тканевой фильтр и наносят на ионообменную колонку с DEAE-целлюлозой, уравновешенную 30% этиловым спиртом. Колонку предварительно отмывают от сопутствующих примесей градиентом этанола (40→55%). Затем элюируют липидную фракцию градиентом этанола (65→96%). Полученный раствор (элюат) упаривают в вакууме при температуре 60-70°C до полного удаления растворителя. Остаток растворяют в 96% этиловом спирте, раствор фильтруют через бумажный фильтр или центрифугируют и помещают в холодильник при -18 - -20°C на 24 ч для вымораживания из этанольного раствора соединений липидной природы (восков, стеринов). Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием при -18 - -20°C, промывают холодным 96% этиловым спиртом и сушат от остатка этанола на воздухе. Получают белый порошок - суммарный препарат восков и стеринов. Выход продукта составляет 3% от веса исходного сырья.

Полученный белый порошок наносят сухим способом на хроматографическую колонку с силикагелем. Колонку промывают гексаном, а затем градиентом гексан → ацетон в соотношении (8:2→7:3). Фракция, элюируемая гексаном, содержит природный воск. Методом хромато-масс-спектрометрии с использованием газовой хроматографии установлено, что полученный природный воск морской звезды P. pectinifera преимущественно имеет молекулярный ион с молекулярной массой 518 Да (С₃₅Н₆₆О₂), что соответствует гептадеканолу линолевой кислоты.

Фракция, элюируемая градиентом гексан → ацетон, содержит смесь стеринов. Анализ полученных соединений выполняли методом хромато-масс-спектрометрии с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЖХ). Определен качественный состав фракции стеринов: холеста-2,4-диен; эргоста-7,22-диен-3-ол; ацетат стигмаста-5,22-диен-3-ола; стигмаст-5-ен-3-ол.

Хромато-масс-спектрометрию с использованием газовой хроматографии (ГХ/МС) проводили на газовом хроматографе НР-6890 с масс-спектрометрической приставкой НР-5973, капиллярной колонкой HP-5MS 5% Phenyl Methyl Siloxane 30m. Хромато-масс-спектрометрию с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЖХ/МС) проводили на LS-MS 2010 Shimadzu.

На фиг. 1 представлена хромато-масс-спектрометрия суммарного препарата воска и стеринов морской звезды P. pectinifera.

A. ГХ спектр суммарного препарата воска и стеринов. Пики со временем удерживания 15.29, 18.12, 18.78, 21.93 мин соответствуют стеринам; пик 30.86 мин - воска.

B. МС спектр пика воска со временем удерживания 30.86 мин.

На фиг. 2 представлена хромато-масс-спектрометрия с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЖХ спектр фракций стеринов морской звезды P. pectinifera).

На фиг. 3 представлены МС спектры фракций стеринов морской звезды Р. pectinifera (пики 1-4 фиг. 2). 1. Холеста-2,4-диен; 2. Эргоста-7,22-диен-3-ол; 3. Ацетат стигмаста-5,22-диен-3-ола; 4. Стигмаст-5-ен-3-ол.

Изобретение иллюстрируется следующим примером.

ПРИМЕР

Сырье - свежевыловленных морских звезд вида Patiria pectinifera в количестве 1,0 кг очищают от посторонних примесей, помещают на сетчатый фильтр, промывают морской или технической пресной водой от песка и ила и подсушивают, при необходимости, потоком воздуха при температуре 18-24°C.

Подготовленное сырье загружают в эмалированный реактор, или полимерную емкость, или другую, разрешенную для контакта с пищевыми продуктами, и заливают 96% этиловым спиртом «под зеркало» (1-1,2 л). Экстракция происходит в течение 20 ч. Полученный этанольный экстракт сливают в накопительную емкость. Повторяют процесс экстракции трехкратно. Объединенный этанольный экстракт упаривают в вакууме при температуре 60°C. Отгон этилового спирта возвращают на повторное экстрагирование сырья.

Концентрат доводят дистиллированной водой до содержания этилового спирта 25%. Водно-этанольный раствор фильтруют через тканевой фильтр и наносят на ионообменную колонку с DEAE-целлюлозой, уравновешенную 30% этиловым спиртом. Колонку последовательно отмывают от сопутствующих примесей ступенчатым градиентом этанола (40→55%). Фракцию, содержащую воск и стерины, элюируют с сорбента градиентом этанола (65→96%). Полученный элюат упаривают в вакууме при температуре 60-70°C. Концентрированный остаток растворяют в небольшом количестве 96% этилового спирта. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр или центрифугируют и помещают в холодильник при -19°C на 24 ч. Выпавший на холоде осадок, содержащий воск и стерины, отделяют центрифугированием при -19°C, промывают холодным 96% этиловым спиртом (-19°C) и высушивают на воздухе. Получают белый порошок, содержащий суммарную фракцию воска и стеринов (30 г).

Для разделения воска и стеринов полученный белый порошок (30 г) наносят сухим способом на хроматографическую колонку с силикагелем. Колонку промывают гексаном, элюат упаривают в вакууме. Получают 17 г природного воска. Затем колонку элюируют градиентом гексан → ацетон в соотношении (8:2→7:3). После упаривания получают смесь стеринов в количестве 10 г.