ЭФИР L-НИТРОАРГИНИНА КАТИОННОГО ТИПА КАК ИНГИБИТОР МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ СИНТАЗЫ ОКСИДА АЗОТА

Изобретение относится к области медицины, касается средства, ингибирующего митохондриальную синтазу оксида азота.

В настоящее время сформировались взгляды в отношении функционального дуализма свободных радикалов, прежде всего кислорода, в процессах повреждения клетки и регуляции метаболических процессов [1]. Известно, что активные формы кислорода являются универсальными повреждающими агентами как при непосредственном окислении биосубстратов, так и вследствие изменения редокс-статуса системы. Свободные радикалы кислорода могут также выступать в качестве естественных метаболитов клетки, оказывающих позитивное действие на многие метаболические процессы посредством, прежде всего, тиол-дисульфидных конформаций биологически активных молекул [2]. В этой связи, для достижения протективного эффекта принципиальное значение имеет направленное воздействие на короткоживущие свободные радикалы, в особенности на гидроксильный радикал, обладающий наибольшей окислительной способностью. Образование гидроксильного радикала в организме возможно при протекании следующих биохимических процессов: реакции Фентона, реализация которой осуществляется в присутствии металлов переменной валентности, а также протекающей в кислой среде реакции декомпозиции пероксинитрита, обладающего высокой пенетрантной способностью. Именно пероксинитрит вследствие его физико-химических свойств может рассматриваться в качестве наиболее опасного повреждающего агента, продукция которого может стать объектом фармакологической регуляции [3]. Образование предшественника пероксинитрита - оксида азота (NO) - катализируется синтазой оксида азота при определенных условиях насыщения энзима тетрагидробиоптерином [4].

За короткий период, прошедший с момента открытия ангиотропной функции оксида азота (одного из ключевых звеньев в патофизиологии окислительного стресса), накоплен огромный экспериментальный и клинический материал, позволивший установить субстраты, ферменты и изоферменты, принимающие участие в биосинтезе оксида азота, их тканевую специфичность. Изучены молекулярные механизмы физиологического и патофизиологического эффектов оксида азота, а также разработаны и внедрены в практику препараты, активирующие и ингибирующие функцию различных изоферментов синтазы оксида азота [5, 6].

Сравнительно недавно в митохондриях была выявлена конституитивно экспрессируемая синтаза оксида азота (NO-синтаза, NOS). По основным характеристикам митохондриальная NOS (mtNOS) сходна с нейрональной NOS (nNOS) [7, 8]. Сравнивая скорости продукции NO интактными митохондриями, митохондриальным гомогенатом и субмитохондриальными частицами (1,4 нмоль/мин, 4,9 нмоль/мин и 7,1 нмоль/мин на мг белка, соответственно), можно сделать вывод, что mtNOS фиксирована на внутренней мембране митохондрий, тогда как индуцибельная NOS (iNOS) является цитозольным ферментом. В настоящее время mtNOS рассматривают как сплайс-вариант nNOS, локализованный и функционирующий в митохондриях и получивший вследствие этого название митохондриальной NO синтазы, однако вопрос о том, что представляет собой митохондриальная NOS - отдельную изоформу фермента или же модифицированную во время трансляции или после нее нейрональную NOS - остается открытым [9]. Подобно конституитивным изоформам mtNOS также является кальцийзависимой [10]. Продуцируемый ею оксид азота угнетает клеточное дыхание при связывании с цитохром С оксидазой и может конъюгировать с супероксидным анион-радикалом, образующимся при утечке электронов с комплексов дыхательной цепи, с образованием пероксинитрита (ONOO^-). Расположенные в матриксе митохондрий ферменты цикла Кребса являются поставщиками протонов в межмембранное пространство через комплексы I, III и IV дыхательной цепи, необходимых для инициации декомпозиции пероксинитрита с образованием гидроксильного радикала. В этой связи, ингибирование mtNOS может стать тем решающим фактором, который позволит повысить эффективность реакций дыхательной цепи и предотвратить дезинтеграцию митохондрий с последующей индукцией апоптоза [11, 12].

Ингибиторы синтазы оксида азота различаются по своей специфичности в отношении различных изоформ фермента: индуцибельной и двух конституитивных форм - эндотелиальной и нейрональной NO-синтаз. В настоящее время описано большое количество соединений, обладающих способностью угнетать активность энзима посредством воздействия на его синтазный домен. Ингибиторы оксидазного центра фермента, активные in vitro, оказались весьма токсичными и не рассматривались.

В процессе терапии ряда заболеваний, характеризующихся избыточной продукцией оксида азота, в комплексную терапию все чаще включаются препараты, ингибирующие активность индуцибельной синтазы оксида азота. Так, известно клиническое применение препаратов, являющихся аналогами L-аргинина: метилового эфира L-нитроаргинина (L-NAME), N-монометил-L-аргинина (L-NMMA) [13], а также дефетура, представляющего собой производное нитрозомочевины [14]. Высокую терапевтическую активность при состояниях, характеризующихся гиперпродукцией оксида азота, обеспечивают глюкокортикоиды (преднизолон, дексаметазон), которые ингибируют транскрипцию индуцибельной синтазы оксида азота, в результате чего снижается содержание конечных метаболитов оксида азота в крови [15].

Проблема ингибирования mtNOS связана с наличием мембранных барьеров, которые не могут преодолеть известные ингибиторы фермента. Соединения, избирательно ингибирующие митохондриальную изоформу NOS, в настоящее время не известны.

При решении задачи направленной доставки фармакологических средств в митохондрии определенный интерес представляют соединения на основе трифенилфосфониевого катиона (иона Скулачева), включающие фрагменты витамина Е (mitoE) [16]. Однако данных об использовании трифенилфосфония и других катионных фрагментов для транспорта в митохондрии ингибиторов синтазы оксида азота при анализе доступной информации не выявлено. То есть, не ясно, может ли ион Скулачева применяться при создании ингибиторов митохондриальной изоформы синтазы оксида азота и могут ли для векторной доставки фармакофорного фрагмента в митохондрии быть использованы катионные ионы другой структуры.

Учитывая схожесть митохондриальной синтазы оксида азота с нейрональной изоформой фермента, в качестве средства-прототипа использовали 6-нитроиндазол, ингибиторная активность которого по отношению к ферменту считается доказанной [17].

При применении в качестве средства терапии 6-нитроиндазол имеет ряд недостатков, которые сводятся, прежде всего, к тому, что данный ингибитор nNOS обладает низкой пенетрантной способностью относительно митохондриальных мембранных барьеров. Кроме того, как 6-нитроиндазол, так и его натриевая соль имеют низкую водорастворимость, что существенно снижает биодоступность препарата, а также создает трудности с его стабилизацией в растворе, требующем сильно щелочную среду.

Указанные негативные свойства средства-прототипа определили необходимость поиска селективных ингибиторов митохондриальной синтазы оксида азота, избирательно снижающих активность mtNOS.

Таким образом, цель изобретения состоит в изыскании средств, ингибирующих митохондриальную синтазу оксида азота.

Поставленная цель достигается за счет вновь синтезированного средства, представляющего собой эфир L-нитроаргинина катионного типа (холиновый, карнитиновый, трифенилфосфониогексиловый) общей формулы:

где (для холинового эфира L-нитроаргинина)

(для карнитинового эфира L-нитроаргинина)

(для трифенилфосфониогексилового эфира L-нитроаргинина)

Синтезировали эфир L-нитроаргинина катионного типа (холиновый, карнитиновый, трифенилфосфониогексиловый) с использованием коммерчески доступных химических реактивов и применением наиболее распространенных методов синтеза сложных эфиров карбоновых кислот, предусматривающих взаимодействие спиртов с кислотами в присутствии водоотнимающих агентов (реакция этерификации), а также солей кислот с галоид-производными [18, 19].

Так, для синтеза холинового эфира L-нитроаргинина предпочтительным оказался метод взаимодействия эквимолярных количеств натриевой соли кислоты L-нитроаргинина и N-(β-хлорэтил)триметиламмоний хлорида (хлорхолин хлорид). Карнитиновый эфир L-нитроаргинина получен взаимодействием карнитина и L-нитроаргинина. Трифенилфосфониогексиловый эфир L-нитроаргинина получен в две стадии: полученный на первой стадии со-хлор-гексиловый эфир L-нитроаргинина превращали в трифенилфосфониогексиловый эфир L-нитроаргинина взаимодействием ω-хлоргексилового эфира L-нитроаргинина с трифенил-фосфином.

После очистки полученных продуктов выхода составили около 30%.

Контроль за ходом реакции осуществляли методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на хроматографических пластинках марки «Silufol» UV-254 в системе 4-бутанол-вода-уксусная кислота (5:4:1). Процесс взаимодействия считали законченным, когда после нанесения реакционной массы на пластинку и хроматографирования исчезало пятно L-нитроаргинина (R_f=0,2±0,01).

Эфир L-нитроаргинина катионного типа (холиновый, карнитиновый, трифенилфосфониогексиловый) получали в виде гидрохлоридов, выделяемых в виде масла, которое при растирании с абсолютным эфиром и выдерживании в вакуум-эксикаторе над Р₂О₅ превращали в гигроскопичный кристаллический продукт. Все синтезированные соединения хорошо растворимы в воде и спирте.

Строение и чистоту полученного эфира L-нитроаргинина катионного типа (холинового, карнитинового, трифенилфосфониогексилового) доказывали данными элементного анализа, ТСХ, ИК- и УФ-спектроскопии.

При ТСХ полученного эфира L-нитроаргинина катионного типа (холинового, карнитинового, трифенилфосфониогексилового) в количестве 100-200 γ в вышеуказанной системе обнаруживали одно пятно (R_f=0,7±0,05).

ИК-спектры эфира L-нитроаргинина катионного типа (холинового, карнитинового, трифенилфосфониогексилового) сравнивали с ИК-спектром исходного L-нитроаргинина.

ИК-спектр L-нитроаргинина (наиболее значимые пики): 3396 (NH₃ ⁺, цвиттер-ион); 2144 (цвиттер-ион); 1658 (С=O кислота); 1598 (C=N); 1516 (N-NO₂); 1414 (N-CH₂); 1322 (N-NO₂); 1240 (-С-С-аминокислота).

ИК-спектр холинового эфира L-нитроаргинина: 3248 (NH₃ ⁺, гидрохлорид); 1735 (С=O, сложный эфир); 1602; 1510; 1409; 1350; 1234.

ИК-спектр карнитинового эфира L-нитроаргинина: 3180; 1734 (сложный эфир); 1652; 1600; 1502; 1420; 1314; 1248.

ИК-спектр трифенилфосфониогексилового эфира L-нитроаргинина: 3228; 2932; 1741 (сложный эфир); 1652; 1600; 1530; 1416; 1258.

Основное отличие ИК-спектров сложного эфира L-нитроаргинина от ИК-спектра L-нитроаргинина заключается в исчезновении в спектрах эфиров поглощения, соответствующего цвиттер-иону и кислотной группе, и появление поглощения карбонильной группы сложных эфиров (1741-1734 см^-1) [20, 21].

Эфир L-нитроаргинина катионного типа (холиновый, карнитиновый, трифенилфосфониогексиловый) дает в УФ-свете в интервале длин волн от 200 до 400 нм характерный максимум поглощения при 265 нм.

Для синтезированного эфира L-нитроаргинина катионного типа (холинового, карнитинового, трифенилфосфониогексилового) были определены молярный и удельный показатели поглощения, исходя из закона Бугера-Ламберта-Бера D=нсв, где D - оптическая плотность, н - показатель поглощения, с - концентрация раствора, в - толщина слоя. Для этого готовились водные растворы в концентрации 5·10^-5 М/л и 0,0015%. Измерялась оптическая плотность D при 265 нм этих растворов в кювете с толщиной слоя 1 см. Вычислялись ε и для холинового, карнитинового и трифенилфосфониогексилового эфира L-нитроаргинина. Исходя из формулы находили молекулярный вес М_н [22]. Найденный молекулярный вес соответствовал истинному (разброс ±5%).

Таким образом, физико-химические исследования синтезированных соединений, выполненные с использованием элементного анализа, ТСХ, а также ИК- и УФ-спектроскопии, подтвердили, что полученные вещества представляют собой холиновый, карнитиновый, трифенилфосфониогексиловый эфир L-нитроаргинина с чистотой около 95%.

Возможность достижения цели изобретения доказывается результатами проведенных экспериментальных исследований, представленными в следующих примерах. Достоверность различий средних значений контролируемых показателей в группах оценивали по t-критерию Стьюдента.

Пример 1. Исследование влияния средства-прототипа и заявляемого средства на кальций-индуцированную продукцию оксида азота в митохондриях и их набухание

Снижение продукции нитритов (стабильного конечного продукта окисления оксида азота кислородом) и степень набухания митохондрий служили критериями влияния средства-прототипа и заявляемого средства на активность митохондриальной синтазы оксида азота.

Для получения митохондрий методом градиентного центрифугирования использовали гомогенат головного мозга крыс-самцов линии Wistar массой 180-220 г. Выделение фракции, обогащенной митохондриями, осуществляли последовательным центрифугированием по схеме, предложенной Г.Н. Крыжановским, при помощи холодовой утрацентрифуги [23]. Полученную суспензию митохондрий разводили охлажденным раствором Хенкса с аргинином, помещали в пробирки, термостатировали при температуре 37°С и затем насыщали кислородом посредством барботажа через капилляр. Стимуляцию активности митохондриальной синтазы оксида азота осуществляли внесением в среду хлорида кальция в конечной концентрации 0,16 мкМ. После внесения индуцирующего агента в среду вносили средство-прототип (6-нитроиндазол) или заявляемое средство (эфир L-нитроаргинина катионного типа (холиновый, карнитиновый, трифенилфосфониогексиловый). Контролем служили пробы, в которые вносили раствор Хенкса. Через 1 час после инкубации в реакции с реактивом Грисса-Илосвая регистрировали количество нитритов с использованием фотометрического метода [24]. Степень набухания митохондрий оценивали нефелометрически, причем о степени набухания митохондрий судили по снижению степени рассеивания света суспензией.

Результаты экспериментов, приведенные в таблице 1, доказывают существенные преимущества заявляемого средства перед средством-прототипом. Применение 6-нитро-индазола незначительно снижает количество нитритов и не оказывает существенного влияния на процессы набухания митохондрий, что доказывает низкую вероятность его проникновения в матрикс. В то же время эфир L-нитроаргинина катионного типа (холиновый, карнитиновый, трифенилфосфониогексиловый) значимо ограничивает продукцию нитритов и снижает степень набухания митохондрий. Таким образом, установлено, что заявляемое средство оказывает существенное влияние на активность митохондриальной синтазы оксида азота и ограничивает дезинтеграцию митохондрий.

Пример 2. Исследование влияния средства-прототипа и заявляемого средства на выживаемость крыс и активность синтазы оксида азота после экспериментального инсульта

В ходе эксперимента проводили гистохимическое определение активности синтазы оксида азота в нейронах после поэтапной перевязки сонных артерий и последующей терапии с применением средства-прототипа или заявляемого средства.

Эксперименты выполнены на крысах-самцах линии Wistar массой 180-220 г. Формировали 3 группы животных: контрольную (16 особей) и две опытные группы (первая опытная (16 особей) и вторая опытная (48 особей)).

Для моделирования острого ишемического инсульта у крыс применяли методику двустадийной перевязки общей сонной артерии с реперфузией [25]. В ходе эксперимента подопытным животным вначале выполняли одностороннюю перевязку сосуда, а через 30 сут после этого проводили вторую операцию, состоящую в том, что общую сонную артерию на контралатеральной стороне пережимали на 10 мин и, сняв лигатуру, восстанавливали нарушенный кровоток. Затем рану ушивали и животным первой и второй опытных групп в течение 3 сут вводили, соответственно, средство-прототип (6-нитроиндазол в виде суспензии на Твин-80) в дозе 50 мг/кг или заявляемое средство (эфир L-нитроаргинина катионного типа (холиновый, карнитиновый, трифенилфосфониогексиловый)) в дозе 25 мг/кг. Применяемые в ходе эксперимента средства вводили внутрибрюшинно один раз в сутки. Выживших животных подвергали аутопсийному исследованию.

Гистохимическое определение активности синтазы оксида азота в пирамидных нейроцитах сенсомоторной коры проводили в соответствии с методикой [26], предусматривающей оценку НАДФН₂-диафоразной активности фермента путем обработки исследуемого препарата растворами солей тетразолия в присутствии НАДФН₂ после выдержки препарата в течение 10 мин в 4% водном растворе нейтрального формалина и проведение комплекса гистохимических реакций, включающего оценку сопряжения функционирования каталитических центров фермента в ходе НСТ-теста путем окрашивания препарата в течение 30 мин в 0,2% растворе нитросинего тетразолия в забуференном физиологическом растворе (рН 7,4) и выявления нитритов путем выдержки препарата в свежеприготовленном реактиве Грисса-Илосвая в течение 30 мин при температуре 37°С. Активность синтазы оксида азота определяли фотометрически по содержанию в клетках препарата продуктов цитохимических реакций на нитриты и диформазан.

Как показали результаты эксперимента, приведенные в таблице 2, эфир L-нитроаргинина катионного типа (холиновый, карнитиновый, трифенилфосфониогексиловый), проникнув в цитозоль клеток и в митохондрии, действительно проявляет свойства ингибитора синтазы оксида азота, обеспечивает по сравнению со средством-прототипом в 1,5-2,0 раза большую выживаемостью крыс с нарушениями мозгового кровообращения и в 1,3-1,6 раз снижает активность митохондриальной NOS.

Для подтверждения влияния заявляемого средства на митохондриальные процессы параллельно гистохимически (по Пирсу) определяли активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ) как наиболее диагностически значимого фермента дыхательной цепи митохондрий, инактивация которого определяла степень гипоксического повреждения, тогда как гомогенное закрашивание клетки при гистохимическом анализе расценивали как потерю интрамитохондриальной локализации вследствие необратимого повреждения митохондрий.

Количество пирамидных нейроцитов 5 слоя коры с гомогенным закрашиванием цитозоля при гистохимическом выявлении СДГ при применении эфира L-нитроаргинина катионного типа (холиновый, карнитиновый, трифенилфосфониогексиловый) снижалось почти в 2 раза, а средняя активность фермента превышала показатель группы средства-прототипа в 1,5 раза, что доказывает способность заявляемого средства ингибировать митохондриальную синтазу оксида азота.

Пример 3. Исследование антигипоксического действия средства-прототипа и заявляемого средства

Антигипоксическое действие средства-прототипа и заявляемого средства исследовали на модели гиперкапнической гипоксии (гипоксии в гермообъеме).

При изучении антигипоксических свойств известных ингибиторов нейрональной синтазы оксида азота, в частности 6-нитроиндазола, установлено, что их антигипоксическая активность сопряжена, в первую очередь, с влиянием на сохранность структуры митохондрий, что, в конечном счете, и определяет продолжительность жизни животных.

Эксперименты выполнены на крысах-самцах линии Wistar массой 180-220 г. Формировали 3 группы животных: контрольную (6 особей) и две опытные группы (первая опытная (6 особей) и вторая опытная (18 особей)).

Животным контрольной группы за 10 мин до воздействия вводили изотонический раствор. Животным первой и второй опытных групп в этот же срок вводили, соответственно, средство-прототип (6-нитроиндазол) в дозе 50 мг/кг или заявляемое средство (эфир L-нитроаргинина катионного типа (холиновый, карнитиновый, трифенилфосфониогексиловый)) в дозе 25 мг/кг. Применяемые в ходе эксперимента средства вводили внутрибрюшинно.

Критериями устойчивости к гипоксии, проявляющейся под воздействием терапии с применением средства-прототипа или заявляемого средства, служили время начала судорог и продолжительность жизни подопытных животных.

Результаты исследований представлены в таблице 3, из которой видно, что под воздействием средства-прототипа судороги начинаются практически в то же время, что и в контрольной группе. В случае же использования заявляемого средства (эфир L-нитроаргинина катионного типа (холиновый, карнитиновый, трифенилфосфониогексиловый)) по сравнению со средством-прототипом судороги наступают, соответственно, через 15,4±2,18 мин, 16,9±2,41 мин, 17,2±3,05 мин, то есть на 6,8-8,6 мин позже.

При этом продолжительность жизни подопытных животных, терапию которых проводили с применением заявляемого средства (эфир L-нитроаргинина катионного типа (холиновый, карнитиновый, трифенилфосфониогексиловый)), составляла, соответственно, 27,1±3,56 мин, 26,6±3,0 мин, 25,5±3,22 мин, что в 2,1-2,2 раз превышает аналогичный показатель, достигаемый при использовании средства-прототипа (6-нитроиндазол).

Таким образом, экспериментально показано, что применение заявляемого средства позволяет обеспечить большую устойчивость к гипоксии по сравнению со средством-прототипом.

Приведенные примеры свидетельствуют о том, что применение заявляемого средства позволяет обеспечить ингибирование активности митохондриальной синтазы оксида азота и ограничение дезинтеграции митохондрий при острых повреждениях гипоксической природы, что подтверждает достижение цели изобретения.

Заявляемое изобретение соответствует критерию «новизна», так как впервые предложено использовать эфир L-нитроаргинина катионного типа (холиновый, карнитиновый, трифенилфосфониогексиловый) в качестве ингибитора митохондриальной синтазы оксида азота, ограничивающего дезинтеграцию митохондрий.

Заявляемое изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень», так как в нем описаны представители нового класса биологически активных соединений, обладающие качествами ингибитора митохондриальной синтазы оксида азота, ограничивающие дезинтеграцию митохондрий.

Соответствие заявляемого изобретения критерию «пригодность для применения» подтверждается результатами исследований, показавшими, что заявляемое средство действительно проявляет свойства ингибитора синтазы оксида азота, значимо ограничивает продукцию нитритов и снижает степень набухания митохондрий, обеспечивает лучшую по сравнению со средством-прототипом выживаемость подопытных животных при нарушениях мозгового кровообращения, а также способствует более позднему наступлению судорог и существенному увеличению продолжительности жизни подопытных животных в условиях гиперкапнической гипоксии. Заявляемое средство водорастворимо, что обеспечивает возможность создания его инъекционных форм. Производство заявляемого средства может быть освоено российскими предприятиями химико-фармацевтической промышленности.

Список литературы

1. Bolisetty S. Mitochondria and reactive oxygen species: physiology and pathophysiology / S. Bolisetty, E.A. Jaimes // Int. J. Mol. Sci. - 2013. - Vol. 14, №3. - P. 6306-6344.

2. Drose S. Mitochondrial respiratory chain complexes as sources and target of thiol-based redox-regulation / S. Drose, U. Brandt, I. Witting // Biochim. Biophys. Acta. - 2014. - Vol. 1844, №8. - P. 1344-1354.

3. Gheddouchi S. Low SOD activity is associated with overproduction of peroxynitrite and nitric oxide in patients with acute coronary syndrome / S. Gheddouchi, N. Mokhrtari-Soulimane, H. Bekhti, F. Soulimane, B. Guermouche, A. Meziane Tani, M. Narce // Nitric oxide. - 2015. - Vol. 49. - P. 40-46.

4. Xie L. Liposomal tetrahydrobiopterin preserve eNOS coupling in the post-ischemic heart conferring in vivo cardioprotection / L. Xie, M.A. Talukder, J. Sun, S. Varadharaj, J.L. Zweier // J. Mol. Cell Cardiol. - 2015. - Vol. 86. - P. 14-22.

5. Caplin B. Endogenous nitric oxide synthase inhibitors in biology of disease: markers, mediators and regulators? / B. Caplin, J. Leiper // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 2012. - Vo. 32, №6. - P. 1343-1353.

6. Barbanti P. Drugs targeting nitric oxide syntase for migraine treatment / P. Barbanti, G. Egeo, C. Aurilia, L. Fofi, D. Della-Morte // Expert Opin. Investig. Drugs. - 2014. - Vol.23, №8. - P. 1141-1148.

7. Guilivi C. Mithochondria as generators and targets of nitric oxide / C. Guilivi // Novartis Found Symp. - 2007. - Vol. 287. - P. 92-100.

8. Zaobornyj T. Strategic localization of heart mithochondrial NOS: a rewiew of the evidence / T. Zaobornyj, P. Ghafourifar // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. - 2012. - Vol. 303, №11. - P. H1283-H1293.

9. Carreras M.C. The biological significance of mtNOS modulation / M.C. Carreras, M.C. Franco, P.V. Finocchietto, D.P. Converso, V.G. Antico Arciuch, S. Holod, J.C. Peralta, J.J. Poderoso / Front Biosci. - 2007. - Vol. 12. - 1041-1048.

10. Zaobornyj T. Strategic localization of heart mithochondrial NOS: a rewiew of the evidence / T. Zaobornyj, P. Ghafourifar // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. - 2012. - Vol. 303, №11. - P. H1283-H1293.

11. Ghafourifar P. Mithochondrial nitric oxide synthase / P. Ghafourifar, C.K. Sen // Front Biosci. - 2007. - Vol. 12. - P. 1072-1078.

12. Haynes V. Mithochondrial nitric-oxide synthase: role in pathophysiology / V. Haynes, S.L. Elfering, R.J. Squires, N. Traaseth, J. Solien, A. Ettl, C. Giulivi // IUDMB Life. - 2003. - Vol. 55, №10-11. - P. 599-603.

13. Глинский М.А. Метиларгинины крови и нарушение регуляции биодоступности оксида азота у пациентов гемодиализа / М.А. Глинский, С.И. Анохин, С.А. Королева, Т.В. Латышева, Г.М. Петракова, Р.А. Суховершин // Нефрология и диализ. - 2012. - Т. 14, №2. - С. 102-108.

14. Проскуряков С.Я. Оценка роли оксида азота в отягощении исходов комбинированных радиационно-термических поражений / С.Я. Проскуряков, Л.П. Ульянова, В.Г. Скворцов, Р.С. Будагов // Радиационная биол. Радиоэкология. - 2005. - Т. 45, №3. - С. 316-319.

15. Zhang J. Glucocorticoid receptor agonist dexamethasone attenuates renal ischemia/ reperfusion injury by up-regulating eNOS/iNOS / J. Zhang, J.H. Li, L. Wang, M. Han, F. Xiao, X.Q. Lan, Y.Q. Li, G. Xu, Y. Yao // J. Huazhong Univ Sci. Technolog. Med. Sci. - 2014. - Vol. 34, №4. - P. 516-520.

16. RU 2318500 C2, 10.03.2008.

17. RU 2191017 C1, 20.10.2002.

18. Вейганг-Хильгетаг. Методы эксперимента в органической химии. Изд. «Химия», - 1968. - С. 343-353.

19. Бюлер К., Пирсон Д. Органические синтезы, ч. II, М.: Мир, - 1973. - С. 282-346.

20. Наканиси К. Инфракрасные спектры органических соединений. Гл. II. Таблица характеристических частот. - М.: Мир, - 1965, - С. 21-71.

21. Беллами Л. Инфракрасные спектры молекул. - М.: ИИЛ, - 1957, - 444 с.

22. Государственная Фармакопея СССР, XI изд., Вып. 1. Общие методы анализа. М.: Медицина, 1987. - С. 32-37.

23. Крыжановский Г.Н. Общая патофизиология нервной системы: Руководство. - М.: Медицина, 1997. - 351 с.

24. Массовая концентрация азота нитритного в морских водах. Методика измерения фотометрическим методом с реактивом Грисса: Руководящий документ РД 52.10.740-2010. - М., 2010. - 24 с.

25. Фатеев И.В. Модель нарушения могзового кровообращения с поэтапной перевязкой общих сонных артерий / И.В. Фатеев, В.Н. Быков, С. В. Чепур, Л.А. Покровская, Н.И. Щемелева, О.О. Владимирова, И.И. Алексеева // Бюлл. экперим. биол. и мед. - 2011. - Т. 152, №9. - С. 350-354.

26. RU 2202110 С1, 10.04.2003.