Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАРЦИССИНА В ЦВЕТКАХ КАЛЕНДУЛЫ ЛЕКАРСТВЕННОЙ

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в центрах контроля качества лекарственных средств и контрольно-аналитических лабораториях при проведении количественного определения нарциссина в цветках календулы лекарственной (Calendula officinalis L.).

Действующая система контроля качества лекарственных препаратов требует постоянного усовершенствования подходов к стандартизации биологически активных соединений (БАС) с использованием современных методов анализа и актуальных данных об их физико-химических, спектральных и фармакологических свойствах, позволяющих объективно и селективно определять содержание целевых веществ.

Цветки календулы лекарственной, или ноготки (Calendula officinalis L.), широко используются в отечественной и зарубежной медицине (1-5), однако до сих пор в полной мере не решены проблемы стандартизации, особенно в плане количественного определения БАС. Так, в фармакопейной статье на цветки ноготков, включенной в Государственную фармакопею СССР XI издания, предусмотрено определение лишь содержания экстрактивных веществ (1).

На кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии была разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на ГСО рутина с использованием дифференциальной спектрофотометрии (6). Данный метод взят нами в качестве наиболее близкого аналога (прототипа). Недостатками данного метода являются низкая специфичность и невозможность определения в анализируемом сырье диагностически значимого компонента.

Ранее нами было установлено, что доминирующим и диагностическим веществом цветков календулы является флавоноид нарциссин (3-рутинозид изорамнетина) (4), что делает привлекательным определение данного компонента не только с помощью ТСХ, но и методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

В литературе встречаются данные относительно возможности применения метода ВЭЖХ анализа для стандартизации сырья календулы (2, 5). По данным некоторых авторов анализ извлечения цветков календулы лекарственной методом ВЭЖХ необходимо проводить путем идентификации кверцетина с определением высоты пика данного вещества, а также с использованием ГСО кверцетина (5). На наш взгляд, кверцетин не является диагностическим веществом для цветков календулы лекарственной, так как, во-первых, содержится в следовых количествах, а во-вторых, является наиболее распространенным флавоноидным агликоном в растениях. Другие исследователи для целей ВЭЖХ-анализа предлагают использовать такие маркерные компоненты, как тифанеозид(изорамнетин-3-O-α-L-рамнопиранозил-(1→2)-α-L-рамнопиранозил-(1→6)-β-D-глюкопиранозид), нарциссин, изорамнетин-3-О-глюкозид и изорамнетин-3-O-(6¹¹-ацетил)-глюкозид (2), причем предусматривается определение суммы флавоноидов, что с точки зрения фармакопейного анализа представляется проблематичным в силу сложности методики, значительной ошибки методики (±10,50%) и ее низкой селективности.

Принимая во внимание тот факт, что доминирующими и диагностически значимым флавоноидом является нарциссин, на наш взгляд, для целей стандартизации сырья и препаратов календулы лекарственной целесообразным является определение данного флавоноида.

Таким образом, целью изобретения является разработка способа количественного определения нарциссина в цветках календулы лекарственной с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Техническим результатом предлагаемого способа является улучшение способа количественного определения флавоноида в цветках календулы лекарственной путем определения нарциссина как биологически активного соединения, определяющего желчегонные и противовоспалительные свойства лекарственных препаратов на основе данного сырья.

Технический результат достигается тем, что количественное определение нарциссина проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии; 20 мкл полученного водно-спиртового извлечения цветков календулы лекарственной вводят в жидкостной хроматограф «Biotronic» с УФ-детектором; элюирование введенной пробы проводят в условиях обращенно-фазовой хроматографии в колонке «Phenomenex Luna С18(2)» 250×2,0 мм, в градиентном, трехступенчатом режиме, смешивая буферный раствор, представляющий собой 0,01 М раствор KH₂PO₄, подкисленный Н₃РО₄ до рН 3,0, и метанол сначала в соотношении 90:10, с 10 минуты - 50:50, с 42 минуты - 70:30; скорость элюирования - 0.6 мл/мин; УФ-детектирование проводят при длине волны 254 нм; параллельно в жидкостный хроматограф вводят 20 мкл раствора стандартного образца нарциссина и хроматографируют в тех же условиях; на хроматограмме испытуемого раствора определяют площадь пика нарциссина со временем удерживания около 37 мин и рассчитывают среднюю площадь пика по трем параллельным определениям; измеряют площадь пика нарциссина на хроматограмме раствора рабочего стандартного образца (РСО) нарциссина и рассчитывают среднюю площадь пика по трем параллельным определениям; содержание нарциссина в цветках календулы лекарственной в процентах (X) в пересчете на абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:

где:

S - площадь пика нарциссина на хроматограмме испытуемого раствора;

S₀ - площадь пика нарциссина на хроматограмме стандартного образца;

m - навеска сырья, г;

m₀ - масса нарциссина в растворе РСО, г;

V - объем извлечения, мл;

V₁ - объем вводимой пробы раствора испытуемого раствора, мкл;

V₀ - объем раствора РСО нарциссина (раствор А), мл;

V₂ - объем вводимой пробы раствора РСО нарциссина, мкл;

W - влажность сырья, %.

Последовательное использование в градиентном режиме элюентной системы, состоящей из смеси буферного раствора и метанола в соотношении 90:10, 50:50 и 70:30, позволяет достигать оптимального разделения флавоноидов водно-спиртового извлечения цветков календулы лекарственной. Результаты ВЭЖХ-анализа свидетельствуют о том, что в подобранных условиях хроматографирования нарциссин с величиной времени удерживания около 37,42 мин хорошо отделяется от других компонентов цветков календулы лекарственной (рис. 1), что позволяет объективно и селективно определять площадь пика анализируемого флавоноида. При хроматографировании пробы рабочего стандартного образца нарциссина методом ВЭЖХ время удерживания анализируемого вещества составило 37,83±0,10 мин (рис. 2), что подтверждает корректность разделения компонентов в водно-спиртовом извлечении цветков календулы лекарственной (рис. 1). С использованием разработанного способа определено, что содержание нарциссина в цветках календулы лекарственной варьирует от 0,89±0,02% до 0,98±0,03%. Ошибка единичного определения методики с доверительной вероятностью 95% составляет ±4,51%.

Способ реализуется следующим образом.

Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 50 мл, прибавляют 30 мл 70% спирта этилового. Колбу закрывают пробкой, взвешивают на тарирных весах с точностью до ±0.01 г. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 60 мин. Затем колбу охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр. 20 мкл полученного водно-спиртового извлечения цветков календулы лекарственной вводят в жидкостной хроматограф «Biotronic» с УФ-детектором; элюирование введенной пробы проводят в условиях обращенно-фазовой хроматографии в колонке «Phenomenex Luna С18(2)» 250×2,0 мм, в градиентном, трехступенчатом режиме, смешивая буферный раствор, представляющий собой 0,01 М раствор KH₂PO₄, подкисленный Н₃РО₄ до рН 3,0, и метанол сначала в соотношении 90:10, с 10 минуты - 50:50, с 42 минуты 70:30; скорость элюирования - 0.6 мл/мин; УФ-детектирование проводят при длине волны 254 нм; параллельно в жидкостный хроматограф вводят 20 мкл раствора стандартного образца нарциссина и хроматографируют в тех же условиях; на хроматограмме испытуемого раствора определяют площадь пика нарциссина со временем удерживания около 37 мин и рассчитывают среднюю площадь пика по трем параллельным определениям; измеряют площадь пика нарциссина на хроматограмме раствора РСО нарциссина и рассчитывают среднюю площадь пика по трем параллельным определениям; содержание нарциссина в цветках календулы лекарственной в процентах (X) в пересчете на абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:

где:

S - площадь пика нарциссина на хроматограмме испытуемого раствора;

S₀ - площадь пика нарциссина на хроматограмме стандартного образца;

m - навеска сырья, г;

m₀ - масса нарциссина в растворе РСО, г;

V - объем извлечения, мл;

V₁ - объем вводимой пробы раствора испытуемого раствора, мкл;

V₀ - объем раствора РСО нарциссина (раствор А), мл;

V₂ - объем вводимой пробы раствора РСО нарциссина, мкл;

W - влажность сырья, %.

Примечания: 1. Приготовление раствора рабочего стандартного образца нарциссина.

Около 0.02 г (точная навеска) стандартного образца нарциссина помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в 20 мл 95% спирта этилового, доводят объем раствора до метки тем же растворителем и перемешивают (раствор А). 5 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят объем раствора 95% спиртом этиловым до метки и перемешивают (раствор Б). Объем вводимой пробы составляет 20 мкл.

2. Приготовление элюента для ВЭЖХ.

Навеску калия гидрофосфата (ЧДА ГОСТ 2493-75) 1,36 г переносят в мерную колбу вместимостью 1 л, растворяют в воде и разбавляют водой до метки, перемешивают. Полученный раствор подкисляют раствором ортофосфорной кислоты до рН 3,00±0,01. Раствор фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,4-0,5 мкм. Раствор дегазируют с помощью ультразвуковой ванны непосредственно перед анализом. Раствор годен в течение 1 месяца.

3. Проверка пригодности хроматографической системы.

Хроматографическая система считается пригодной, если выполняются следующие условия: эффективность хроматографической колонки, рассчитанная по пику нарциссина, должна быть не менее 3000 теоретических тарелок.

Предлагаемый способ поясняется следующим примером.

Пример.

Аналитическую пробу сырья (производитель - ОАО «Красногорсклексредства») измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. 1,0271- г измельченного сырья (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 50 мл, прибавляют 30 мл спирта этилового 70%. Колбу закрывают пробкой, взвешивают на тарирных весах с точностью до ±0.01 г. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на водяной бане при t=100°С в течение 60 мин. Затем колбу охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр. 20 мкл полученного водно-спиртового извлечения цветков календулы лекарственной вводят в жидкостной хроматограф «Biotronic» с УФ-детектором; элюирование введенной пробы проводят в условиях обращенно-фазовой хроматографии в колонке «Phenomenex Luna С18(2)» 250×2,0 мм, в градиентном, трехступенчатом режиме, смешивая буферный раствор, представляющий собой 0,01 М раствор KH₂PO₄, подкисленный H₃PO₄ до рН 3,0, и метанол сначала в соотношении 90:10, с 10 минуты - 50:50, с 42 минуты - 70:30; скорость элюирования - 0,6 мл/мин; УФ-детектирование проводят при длине волны 254 нм; параллельно в жидкостный хроматограф вводят 20 мкл раствора стандартного образца нарциссина и хроматографируют в тех же условиях; на хроматограмме испытуемого раствора определяют площадь пика нарциссина со временем удерживания около 37 мин и рассчитывают среднюю площадь пика по трем параллельным определениям; измеряют площадь пика нарциссина на хроматограмме раствора РСО нарциссина и рассчитывают среднюю площадь пика по трем параллельным определениям. Рассчитаны показатели площади пика нарциссина на хроматограмме испытуемого раствора (S=225,19), площади пика нарциссина на хроматограмме рабочего стандартного образца нарциссина (S_o=129,35) и массы сырья (m=1,0271).

Содержание нарциссина в цветках календулы лекарственной в процентах (X) в пересчете на абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:

Содержание нарциссина=0,89%.

Все результаты были статистически обработаны. Ошибка единичного количественного определения составила ±4,51%.

Таким образом, предлагаемый способ количественного определения нарциссина в цветках календулы лекарственной с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии разработан впервые для анализа данного флавоноида и обладает следующими преимуществами перед методикой, используемой в известном способе (прототип):

1. Определение идет по содержанию доминирующего и диагностически значимого для цветков календулы лекарственной флавоноида - нарциссина.

2. Разработанный метод является более специфичным и селективным, поскольку обеспечивает четкое отделение нарциссина от других компонентов цветков календулы лекарственной.

3. Указанный способ менее громоздок с точки зрения расчета содержания одного компонента, а не суммы флавоноидов путем определения и сложения значений, полученных для каждого флавоноида, включая минорные компоненты.

4. Ошибка единичного определения предлагаемого способа составляет ±4,51%, тогда как в случае способа прототипа она достигает ±10,50%, что свидетельствует об объективности разработанного способа.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Государственная фармакопея СССР: Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. 11-е изд., доп. - М.: Медицина, 1990. - С. 237-238.

2. Кащенко Н.И. Фитохимическое исследование и совершенствование методов стандартизации цветков и травы календулы лекарственной (Calendula officinalis L.): дис … канд. фармац. наук. - Улан-Удэ, 2014. - 223 с.

3. Куркин В.А. Фармакогнозия. Учебник для студентов фармацевтических вузов (факультетов). 2-е изд., перераб. и доп. - Самара: ООО «Офорт», ГОУ ВПО «СамГМУ», 2007. - 1239 с.

4. Куркин В.А., Шарова О.В. Разработка методик стандартизации цветков ноготков // Фармация. - 2007. - №8. - С. 11-13.

5. Сампиев A.M., Хочава М.Р. Календула лекарственная. - Краснодар: Советская Кубань, 2010. - 144 с.

6. Шарова О.В. Фитохимическое исследование по стандартизации и созданию лекарственных средств на основе календулы лекарственной: Автореф. дис. канд. фарм. наук. - Самара, 2007. - 24 с.

Способ количественного определения нарциссина в цветках календулы лекарственной, при котором получают водно-спиртовое извлечение цветков календулы лекарственной путем экстракции 1 г (точная навеска) измельченных цветков календулы лекарственной, помещенных в колбу вместимостью 50 мл, с добавлением 30 мл 70% спирта этилового при нагревании на кипящей водяной бане в течение 60 мин, отличающийся тем, что количественное определение нарциссина проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии; 20 мкл полученного водно-спиртового извлечения цветков календулы лекарственной вводят в жидкостной хроматограф «Biotronic» с УФ-детектором; элюирование введенной пробы проводят в условиях обращенно-фазовой хроматографии в колонке «Phenomenex Luna С18(2)» 250×2,0 мм, в градиентном, трехступенчатом режиме, смешивая буферный раствор, представляющий собой 0,01 М раствор КНРО, подкисленный НРО до рН 3,0, и метанол сначала в соотношении 90:10, с 10 минуты - 50:50, с 42 минуты - 70:30; скорость элюирования - 0.6 мл/мин; УФ-детектирование проводят при длине волны 254 нм; параллельно в жидкостный хроматограф вводят 20 мкл раствора стандартного образца нарциссина и хроматографируют в тех же условиях; на хроматограмме испытуемого раствора определяют площадь пика нарциссина со временем удерживания около 37 мин и рассчитывают среднюю площадь пика по трем параллельным определениям; измеряют площадь пика нарциссина на хроматограмме раствора рабочего стандартного образца (РСО) нарциссина и рассчитывают среднюю площадь пика по трем параллельным определениям; содержание нарциссина в цветках календулы лекарственной в процентах (X) в пересчете на абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле: где:S - площадь пика нарциссина на хроматограмме испытуемого раствора;S - площадь пика нарциссина на хроматограмме стандартного образца;m - навеска сырья, г;m - масса нарциссина в растворе РСО, г;V - объем извлечения, мл;V - объем вводимой пробы раствора испытуемого раствора, мкл;V - объем раствора РСО нарциссина (раствор А), мл;V - объем вводимой пробы раствора РСО нарциссина, мкл;W - влажность сырья, %.