Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ВЫСОКОДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХ АДЕНОКАРЦИНОМ И АДЕНОМ ТОЛСТОЙ КИШКИ

Изобретение относится к медицине, а именно к патологической анатомии и онкологии, и может быть использовано в ранней прижизненной иммуногистохимической диагностике высокодифференцированных аденокарцином толстой кишки.

Выбор в качестве маркеров аденокарцином толстой кишки таких белков, как Е-кадгерин, р53, cyclin D1, Ki-67, обусловлен их ролью в развитии канцерогенеза.

Так, белок Е-кадгерин локализуется в клетках эпителия желез и регулирует трансмембранные клеточные взаимоотношения. Мутантный белок р53 экспрессируется на ядрах клеток опухолей, регулирует процессы апоптоза. Белок cyclin D1 регулирует процессы митотического деления клеток. Белок Ki-67 относится к семейству ядерных белков и отражает участие клеток в процессах пролиферации.

На сегодняшний день известно достаточно литературных источников об использовании Ki-67 и р53 в качестве прогностического маркера при различных патологических состояниях. В частности в изобретении «Способ прогнозирования метастазов у больных раком желудка» (см. патент RU № RU 2445632 С1, МПК G01N 33/53, G01N 33/68, опубл. 20.03.2012, бюл. №8) у больных раком желудка различного морфологического строения проводят определение маркера пролиферативной активности Ki-67 и маркера апоптоза р53, дополнительно определяют маркер апоптоза bcl-2 и устанавливают, что при абсолютных значениях при перстневидно-клеточном раке: р53 - 10%, bcl-2 - 10%, Ki-67 - 12%; при недифференцированном раке: р53 - 13%, bcl-2 - 11%, Ki-67 - 9%; при аденокарциноме: р53 - 10%, bcl-2 - 9%, Ki-67 - 12%, прогнозируют возникновение метастазов в лимфоузлах, а при р53 - 6%, bcl-2 - 5%, Ki-67 - 10% прогнозируют отсутствие метастатического поражения лимфоузлов. Однако предлагаемый авторами способ диагностики не специфичен для прижизненной диагностике высокодифференцированных аденокарцином толстой кишки.

В способе дифференциальной диагностики атипической фолликулярной аденомы и фолликулярного рака щитовидной железы (см. патент RU 2332172 С1, МПК А61В 10/00, G01N 33/569, опубл. 27.08.2008, бюл. №24) авторы на срезах опухоли определяли экспрессию белков Ki-67, Bcl-2 и р53 в ядрах клеток с помощью специфических моноклональных антител в комплексе с хромогеном. При этом определяли для каждого белка индекс мечения ядер клеток, который осуществляли по следующей процедуре: подсчитывали как среднюю долю клеток с окрашенными хромогеном ядрами в гистологических срезах, обработанных одним из специфических моноклональных антител, оцененную по 30 полям зрения и выраженную в процентах, причем дополнительно по той же процедуре определяли индексы мечения цитоплазмы клеток для белков Bcl-2 и р53, оценивали коэффициент потенциальной возможности к пролиферативной активности по формуле: КПВПА=(ИМя_вс1-2/ИМя_Р53)·ИМя_Ki-67, где КПВПА - коэффициент потенциальной возможности к пролиферативной активности, ИМя_Вс1-2, ИМя_р53, ИМя_Ki-67 - индексы мечения ядер клеток опухоли для каждого из белков Bcl-2, р53 или Ki-67 соответственно; оценивали коэффициент возможной атипии цитоплазмы (КВА) как отношение индекса мечения цитоплазмы клеток для белка Bcl-2 к индексу мечения цитоплазмы клеток для белка р53; определяли коэффициент активности опухолевого роста и потенциальной злокачественности (КАОРЗ) как произведение коэффициента возможной атипии цитоплазмы (КВА) и коэффициента потенциальной возможности к пролиферативной активности и при величине 0≤КАОРЗ≤4,35 диагностировали атипическую фолликулярную аденому, а при величине КАОРЗ>4,36 - фолликулярный рак. Однако на наш взгляд, этот способ не является строго специфичным и не дает возможности провести раннюю дифференциальную диагностику высокодифференцированных аденокарцином и аденом толстой кишки.

Установлено и доказано, что циклин D1 играет важную роль в онкогенезе различных онкологических заболеваний, в частности колоректальной аденокарциномы. Авторами установлено, что общая выживаемость и безрецидивная выживаемость были значительно беднее в больных с опухолями сильно положительных для циклина D1, по сравнению с циклин-D1-отрицательными. 5-летняя выживаемость пациентов с опухолями сильно положительных для циклин D1 составила 53,3%, в то время как 5-летняя выживаемость больных с циклин-D1-отрицательным значением и слабо положительных опухолей были 96,2 и 78,8% соответственно.

Кроме того, многомерный анализ показал, что циклин D1 экспрессия является независимым предиктором рецидива у наших пациентов (см. Cyclin D1 overexpression and prognosis in colorectal adenocarcinoma. Maeda K. Chung Y. Kang S. Ogawa M. Onoda N. Nishiguchi Y. Ikehara T. Nakata B. Okuno M. Sowa M. Osaka City University Medical School, Japan, 1998. Интернет-ресурс: http://www.gastroportal.ru/php/content.php?id=l02999).

Из литературных источников известно нарушение экспрессии Е-кадгерина и др. белков при различных формах гиперплазии эндометрия (ГЭ), эндометриальной интраэпителиальной неоплазии (ЭИН) и высокодифференцированной эндометриоидной аденокарциноме (ЭАК) (см. Нарушение экспрессии белков межклеточных контактов и адгезии при гиперплазии эндометрия, эндометриальной интраэпителиальной неоплазии, высокодифференцированной эндометриоидной аденокарциноме. Коган Е.А., Аскольская С.И., Сагиндыкова P.P., Файзуллина Н.М. Акушерство и гинекология, №11, 2014 г. Интернет-ресурс: http://www.medvestnik.ru/library/article/30304).

Авторами этой публикации установлено, что снижение уровня экспрессии мембранного Е-кадгерина и др. белков в ЭАК может быть связано с процессом эпителиально-мезенхимальной трансформации, лежащей в основе готовности к инвазивному росту при ЭИН и самого инвазивного роста при ЭАК. Однако предложенный способ не позволяет оценить пролиферативный пул клеток железистого эпителия толстой кишки, нарушение соотношения процессов пролиферации и апоптоза эпителиоцитов, что важно для ранней прижизненной оценки высокодифференцированных аденокарцином толстой кишки.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение точности и информативности способа ранней прижизненной дифференциальной диагностики высокодифференцированных аденокарцином и аденом толстой кишки для последующего планирования лечебных мероприятий.

Технический результат достигают тем, что дополнительно определяют наличие клеток, экспрессирующих Ki-67, Е-кадгерин, р53, и при выявлении клеток с гиперэкспрессией Е-кадгерина, р53, cyclin D1, индекса пролиферации Ki-67 более 20% ядер клеток устанавливают наличие высокодифференцированных аденокарцином с высоким инвазивным потенциалом роста, а при наличии клеток со слабой экспрессией Е-кадгерина, р53, cyclin D1, индекса пролиферации Ki-67 менее 20% ядер клеток устанавливают наличие аденом с признаками дисплазии 2-3 степени.

Выбранный авторами набор белков позволил оценить биологические потенции высокодифференцированных аденокарцином толстой кишки, позволяющие провести дифференциальный диагноз их с аденомами толстой кишки.

В таблице 1 представлены результаты сравнительного исследования иммуногистохимических маркеров Е-кадгерин, р53, cyclin D1, Ki-67 в срезах полипов толстой кишки у 30 пациентов с высокодифференцированными аденокарциномами (1 группа) и у 30 пациентов с аденомами (2 группа).

При сравнении результатов исследования между двумя группами пациентов обнаружено, что у пациентов с высокодифференцированными аденокарциномами имелась гиперэкспрессия Е-кадгерина, р53, cyclin D1, индекс пролиферации Ki-67 был более 20% ядер клеток.

Подобных иммуногистохимических исследований при ранней диагностике высокодифференцированных аденокарцином толстой кишки в доступной нам научно-медицинской и патентной литературе не встречалось.

Сравнительный анализ известных способов ранней диагностики и предлагаемого нами способа позволяет выявить его новизну и отличия от известных.

Новизна способа ранней диагностики высокодифференцированных аденокарцином толстой кишки заключается в использовании дополнительных маркеров, отвечающих за пролиферацию и рост клеток (Ki-67, cyclin D1), апоптоз (р53) и за межклеточные взаимодействия (Е-кадгерин) с целью повышения точности и качества морфологического исследования биопсийного материала.

Рисунки для пояснения сущности способа

На рис. 1 изображены железистые структуры в тубулярной аденоме с признаками гиперплазии и гиперсекреции слизи бокаловидными клетками. Окраска гематоксилином-эозином х 200.

На рис. 2 изображена пролиферация клеток в базальных отделах тубулярных структур аденом. ИГХ-реакция с Ki-67 х 200.

На рис. 3 изображены единичные стволовые клетки с экспрессией белка cyclin D в базальных отделах желез тубулярной аденомы. ИГХ-реакция х 200.

На рис. 4 указан индекс пролиферативной активности Ki-67 в железисто-криброзных структурах аденокарциномы (45-50% ядер клеток). ИГХ-реакция х 100.

На рис. 5 изображена гиперэкспрессия белка циклина D1 в криброзных структурах аденокарциномы на фоне аденомы. ИГХ-реакция х 200.

На рис. 6 изображена экспрессия мутантного белка р53 в тубулярных структурах криброзной аденокарциномы. ИГХ-реакция х 200.

Предлагаемый авторами способ прогнозирования осуществляют следующим образом.

1. После биопсии полипа толстой кишки готовили 2 парафиновых среза из стандартного блока с тканью толщиной 3-5 микрон по стандартной методике, депарафинировали в ксилоле и регидратировали в батарее спиртов. Четыре среза использовали для проведения иммуногистохимической реакции с маркерами Е-кадгерин, р53, cyclin D1 , Ki-67.

Последовательность этапов проведения реакции с каждым из маркеров совпадала.

2. Иммуногистохимическое исследование по оценке экспрессии Е-кадгерин, р53, cyclin D1, Кi-67 проводили по стандартной методике. Для открытия антигенных детерминант проводили обработку срезов в цитратном буфере [рН 6,0] в течение 30 минут при 95°С на водяной бане.

3. Инкубацию с первичными антителами проводили в течение ночи при 4°С. В качестве первичных антител при оценке экспрессии Е-кадгерин, р53, cyclin D1, Ki-67 использовали мышиные моноклональные антитела к данным маркерам, фирма производитель DAKO Corp).

4. Для визуализации реакции антиген-антитело использовали стрептавидин-биотиновую тест-систему [DAKO Corp] согласно инструкции. В качестве хромогена использовали ДАБ+[DAKO Corp].

5. Затем срезы докрашивали гематоксилином и заключали в бальзам.

6. Реакцию оценивали с применением светового микроскопа (увеличение ×40) по следующим критериям. Количество положительных клеток оценивали в зонах, содержащих их максимальное количество. В качестве негативного контроля использовали иммуногистохимическую реакцию без добавления первичных антител.

При наличии клеток с гиперэкспрессией Е-кадгерина, р53, cyclin D1, индекса пролиферации Ki-67 более 20% ядер клеток устанавливают наличие высокодифференцированных аденокарцином с высоким инвазивным потенциалом роста, а при наличии клеток со слабой экспрессией Е-кадгерина, р53, cyclin D1, индекса пролиферации Ki-67 менее 20% ядер клеток устанавливают наличие аденом с признаками дисплазии 2-3 степени.

Клинические примеры использования способа

Пример 1.

Биопсия полипа толстой кишки у больного M., 1956 года рождения. Патогистологическое исследование выявило наличие железистых структур с признаками гиперплазии и гиперсекреции слизи бокаловидными клетками (рис. 1).

Отмечалась незначительная пролиферация ядер клеток в базальных отделах крипт желез (Ki-67 не превышал 10-15% ядер клеток, рис. 2). Белок cyclin D1 обнаруживался в базальных отделах желез аденом в виде отдельных скоплений (рис. 3).

Комплексное морфоиммуногистохимическое исследование (ИГХ) аденом толстой кишки выявило невысокие показатели уровня пролиферативной активности ядер клеток, локализующихся преимущественно в базальных отделах крипт. Заключение ИГХ: тубулярная аденома толстой кишки с признаками пролиферативной активности базальных клеток железистого эпителия. Больному показано дальнейшее клиническое наблюдение.

Пример 2.

Биопсия полипа толстой кишки у больного В., 1959 года рождения. Патогистологическое исследование полипа толстой кишки выявило наличие мелких и средних желез, расположенных в глубине слизистой оболочки кишки. Индекс пролиферации Ki-67 составил 45-50% ядер клеток (рис. 4).

Уровень экспрессии циклина Д1 существенно превышал таковые показатели в аденомах и достигал значений 50-60% ядер клеток. При этом данный белок локализовался не только в базальных отделах опухолевых желез, но и в поверхностных отделах, расположенных ближе к просвету тубулярных атипичных структур (рис. 5).

Мутантный белок р53 выявлялся в трубчатых структурах аденокарцином неравномерно дискретно и достигал значений 15-20% ядер клеток (рис. 3). В то же время в структуре аденом мутантный белок р53 не обнаруживался. Заключение ИГХ: высокодифференцированная тубулярная аденокарцинома толстой кишки с высоким потенциалом пролиферации клеток железистого эпителия. Больному рекомендовано оперативное лечение.

Таким способом был установлен прижизненный диагноз 30 больным.

Разработанный способ диагностики дифференциальной диагностики аденокарцином толстой кишки является промышленно применимым, позволяет более точно прогнозировать исход заболевания и планировать лечебные мероприятия.