Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ПРИРОДЫ ПРОИСХОЖДЕНИЯ РЕЦИДИВНЫХ КИСТ ПРИ ЦИСТНОМ ЭХИНОКОККОЗЕ

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к хирургии и может быть использовано для определения природы происхождения рецидивных эхинококковых кист у лиц, инвазированных ленточным червем Echinococcus granulosus.

Цистный эхинококкоз (ЦЭ) - широко распространенное тяжелое заболевание. В настоящее время достигнуты значительные успехи в диагностике и хирургическом лечении ЦЭ, тем не менее остается проблемой высокий процент пооперационных рецидивов заболевания [Ахмедов С.М., Иброхимов Н.К., Сафаров Б.Дж., Расулов Н.А., Табаров З.В. Резекция печени при эхинококкозе. Анналы хирургической гепатологии. 2014; 19(2): 49-54; Меджидов Р.Т., Султанова Р.С., Меджидов Ш.Р. Профилактика рецидива абдоминального эхинококкоза. Анналы хирургической гепатологии. 2014; 19(3): 63-67; Нартайлаков М.А., Мушарапов Д.Р., Зарипов Ш.А. Новые технологии при хирургическом лечении эхинококкоза печени. Анналы хирургической гепатологии. 2006; 11(3): 52-56].

В организме человека могут развиться имплантационные (при диссеминации зародышевых элементов во время операции), реинвазивные (возникающие при повторном заражении), резидуальные (не распознанные, из-за неравномерного развития кист при сочетанном и множественном эхинококкозе) по природе происхождения рецидивные кисты [Ахмедов И.Г., Османов А.О. Классификация эхинококковых кист, выявленных после хирургического лечения. Хирургия. 2002; 9: 28-32; Дадвани С.А., Мусаев Г.Х., Коваленко Ф.П., Лотов А.Н. Некоторые из причин рецидивов эхинококкоза. Проблемы эхинококкоза: матер. Междунар. науч.-практич. конф. Махачкала, 2000: 47-48]. Определение природы происхождения рецидивных кист является важным и способствует правильному выбору тактики оперативного лечения и адекватной профилактике рецидивов ЦЭ.

Известен способ выявления рецидива эхинококкоза по серологическим реакциям (ИФА, РНГА и др.), дополненный инструментальными методами (УЗИ, КТ, МРТ, рентген).

Разработанные в настоящее время методы диагностики рецидива эхинококкоза имеют следующие недостатки:

- широко используемые инструментальные методы исследования (УЗИ, рентген) не позволяют дифференцировать кисты по причине их возникновения;

- специфичность общепринятых серологических реакций недостаточна для идентификации кисты по природе ее происхождения.

Установлено, что на территории Республики Башкортостан (РБ) встречается вид Е. granulosus с генотипом G1, который имеет генетически полиморфные внутривидовые варианты (штаммы). Нами проведен анализ маркерного фрагмента длиною 397 нуклеотидов митохондриального гена cox1 с координатами 9883-10280 от 5′-концевого участка у распространенных в РБ генетических вариантов Е. granulosus (по данным ″GenBank″, собственных исследований и публикаций [Лукманова Г.И. Идентификация штамма Echinococcus granulosus и генетические факторы риска гидатидозного эхинококкоза на Южном Урале: автореф. дис. … докт. мед. наук. Москва, 2008. 49 с.; Буйдаков В.М. и соавт. Способ идентификации генотипа G1 у изолятов Echinococcus granulosus. Мед.паразитол. - 2010. - №1. - С. 5-8.]).

Выявлено, что генетический полиморфизм обусловлен единичными однонуклеотидными заменами (SNP - single-nucleotide polymorphism) и наличием (или отсутствием) фрагмента из 5 нуклеотидов (GTGGC с координатами 10274-10279). Было установлено, что SNP встречаются по 12 полиморфным позициям. Среди них была выбрана одна - замена цитозина на тимин (С→T) в положении 10154, от 5′-концевого участка гена cox1, которая делит все варианты на 2 группы и ее можно выявить при помощи анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ) продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК. На основании изучения сайтов рестрикции для эндонуклеаз этой полиморфной позиции гена cox1 был модифицирован способ ПЦР-ПДРФ анализа для дифференциации эхинококковых кист по молекулярно-генетическим отличиям.

В доступной научно-медицинской и патентной литературе сведений об известности способа дифференциации природы происхождения послеоперационных рецидивных кист при цистном эхинококкозе у человека не обнаружено.

Задачей изобретения является разработка способа дифференциации природы происхождения послеоперационных рецидивных кист при цистном эхинококкозе у человека с помощью выявления различий в нуклеотидных последовательностях маркерного фрагмента гена cox1 между образцами ДНК первичной и рецидивной кист.

Технический результат изобретения - получение критериев для дифференциации природы происхождения послеоперационных рецидивов цистного эхинококкоза.

Указанный технический результат достигается способом дифференциации природы происхождения рецидивных кист при цистном эхинококкозе, характеризующимся тем, что из клеток герминативного слоя оболочки первичной и рецидивной эхинококковых кист проводят выделение ДНК, получают фрагменты маркерного участка гена cox1 Е. Granulosus методом полимеразной цепной реакции, проводят анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов и при обнаружении сходства длин рестрикционных фрагментов устанавливают, что рецидивная киста имеет имплантационную природу происхождения, а при нахождении различий устанавливают резидуальную или реинвазивную причину возникновения рецидивной кисты.

Способ доступен по реактивам и оборудованию и осуществляется следующим образом.

У пациента с первичным ЦЭ после операции берут на исследование кисту и из ее клеток выделяют ДНК. Для этого фрагмент герминативной оболочки материнской кисты (2-3 грамма) промывают 3 раза в 3-х объемах стерильного физиологического раствора. Замораживают жидким азотом и растирают в фарфоровой ступке. Растертую ткань суспендируют в 1 мл буфера ТЕ (10 мМ трис-основание, рН=7,4 и 1 мМ ЭДТА, рН=8,0). Выделяют ДНК (с протеиназой К). Для этого к 200 мкл взвеси клеток герминативной оболочки добавляют 300 мкл лизирующего буфера (100 мМ NaCl; 50 мМ трис-HCl, рН=8,0; 50 мМ ЭДТА, рН 8,0; 1% SDS) и протеиназу К (500 мкг на пробу). Пробу инкубируют при температуре 56°С в течение 6-12 часов.

Депротеинизацию и осаждение ДНК осуществляют стандартным фенол-хлороформным методом (Sambrook J., Fritsch Е., Maniatis Т. Commonly used techniques in molecular cloning. Extraction with phenol:chloroform. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. 1987: E3-E4). Затем ДНК осаждают 96° этанолом, инкубируют при температуре -20°С в течение 15-20 минут и центрифугируют 10 минут при 10 000 об/мин. Осадок ДНК промывают 70° этанолом, затем просушивают его на воздухе и растворяют в деионизированной воде.

Для получения маркерных фрагментов гена cox1 применяют метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК [Способ идентификации возбудителя цистного эхинококкоза в биологическом образце / Лукманова Г.И. и соавт. / Патент РФ №2332465 от 2008 г.]. Для ПЦР используют праймеры следующей структуры: 5′ TGTGTTGATTTTGCCTGG 3′ (прямой) и 5′ GCCACCACAAACCAAGTATC 3′ (обратный).

Устанавливают следующий режим работы термоциклера:

- 1 цикл предварительной денатурации при температуре 94°С в течение 3 мин;

- 35 циклов с параметрами: денатурация при температуре 94°С в течение 30 сек,

- отжиг праймеров при температуре 52°С в течение 30 сек,

- элонгация цепи при температуре 72°С в течение 30 сек;

- финальная инкубация 1 цикл при температуре 72°С в течение 10 мин;

- хранение при температуре 16°С.

Присутствие продуктов амплификации анализируют электрофоретическим разделением смеси в 10% ПААГ, после окрашивания гелей бромистым этидием, с последующей визуализацией в УФ-свете на трансиллюминаторе.

При отсутствии фрагмента GTGGC с координатами 10274-10279 гена cox1 (что характерно для одного из штаммов генотипа G1 Е. granulosus, циркулирующих в РБ), «обратный» праймер не отжигается и поэтому ПЦР-продукта не будет. В случае существования на электрофореграмме ПЦР-продуктов на следующем этапе работы проводят параллельную рестрикцию с использованием эндонуклеаз R. Fok1, R. SfaN1, R. A1w1, R. Mae1. Присутствие на электрофореграмме рестрикционных фрагментов ДНК длиной 55, 118, 95, 128 пар нуклеотидов (пн) укажет на второй из штаммов генотипа G1 Е. granulosus. Обнаружение рестрикционных фрагментов ДНК длиной 55, 118, 223 пн - позволит выявить третий штамм.

На следующем этапе проводят сравнение результатов ПЦР-ПДРФ анализа ДНК клеток первичной и рецидивной кист у обследуемого больного ЦЭ. При обнаружении сходства длин рестрикционных фрагментов устанавливают, что рецидивная киста имеет имплантационную природу происхождения, а при нахождении различий устанавливают резидуальную или реинвазивную причину возникновения рецидивной кисты.

Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Пациент А. обратился в клинику с жалобами на боли в области правого подреберья. При УЗИ органов брюшной полости в правой доле печени (сегмента VIII) выявлено объемное образование размерами 72×61 мм неоднородной структуры смешанной эхогенности с четкими контурами. При осмотре и физикальном исследовании по системам органов других патологических изменений не выявлено. Больной оперирован, выполнена эхинококкэктомия. Взят на анализ фрагмент герминативной оболочки эхинококковой кисты. Проведен описанный выше способ ПЦР-ПДРФ анализа. На электрофореграмме обнаружены фрагменты ДНК длиной 55, 118, 223.

Через 2 года пациент обратился с теми же жалобами. При УЗИ в правой доле печени (сегмента VIII) выявлено объемное образование размерами 30×25 мм. Больной оперирован. Взят на анализ фрагмент герминативной оболочки эхинококковой кисты. Проведен описанный выше способ ПЦР-ПДРФ анализа. На электрофореграмме обнаружены фрагменты ДНК длиной 55,118, 223.

Сравнение результатов ПЦР-ПДРФ анализа ДНК клеток первичной и рецидивной кист показал на их молекулярно-генетическое сходство. На основании полученных данных можно утверждать, что рецидив может иметь имплантационную природу происхождения.

Пример 2. Пациент Р. обратился в клинику с жалобами на ощущение тяжести в правом подреберье. При УЗИ органов брюшной полости в правой доле печени (сегмента VIII) выявлено объемное образование размерами 85×60 мм неоднородной структуры смешанной эхогенности с четкими контурами. Больной оперирован, выполнена эхинококкэктомия. Взят на молекулярно-генетический анализ фрагмент герминативной оболочки эхинококковой кисты. Проведен описанный выше способ ПЦР-ПДРФ анализа. На электрофореграмме обнаружены фрагменты ДНК длиной 55, 118, 95, 128.

Через 3 года пациент обратился с теми же жалобами. При УЗИ в правой доле печени (сегмента VI) выявлено объемное образование размерами 35×25 мм. Больной оперирован. Взят на анализ фрагмент герминативной оболочки эхинококковой кисты. Проведен описанный выше способ ПЦР-ПДРФ анализа. На электрофореграмме фрагменты ДНК не обнаружены.

Сравнение результатов исследований показало, что ДНК клеток первичной и рецидивной кист имеют молекулярно-генетические различия, а значит и разную природу происхождения. На основании этих данных можно утверждать, что причиной рецидива не может быть имплантационная киста, но допустимо предположить резидуальную или реинвазивную природу возникновения кисты.