СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СМЕСИ АФЛАТОКСИНОВ B1, B2, G1, G2 МЕТОДОМ ИНВЕРСИОННОЙ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИИ

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для анализа пищевых продуктов, кормов и кормовых добавок, сельскохозяйственной продукции растительного происхождения, а также в медицине.

Известен способ одновременного количественного определения афлатоксинов В1, В2, G1, G2 методом жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрическим обнаружением LC-ESI-MS/MS [Shuyu Liu, Feng Qiu, Weijun Kong, Jianhe Wei, Xiaohe Xiao, Meihua Yang. Development and validation of an accurate and rapid LC-ESI-MS/MS method for the simultaneous quantification of aflatoxin В₁, B₂, G₁ and G₂ in lotus seeds / Food Control. 2013. V. 29. №1. P. 156-161] в семенах лотоса с пределом количественного обнаружения (мкг/кг): В1 - 0,02, В2 - 0,015, G1 - 0,01, G2 - 0,015 на основе соотношения сигнал:шум (10:1). Разделение афлатоксинов проводили на колонке C₁₈ Zorbax SB (50×2,1 мм внутренний диаметр, 3,5 мкм) при комнатной температуре. Подвижная фаза состояла из растворителей А (0,1% муравьиной кислоты в бидистиллированной воде) и В (0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле) при скорости потока 0,4 мл/мин в ступенчатом режиме.

Известен способ одновременного количественного определения смеси афлатоксинов В1, В2, G1, G2 методом высокоэффективной жидскостной хроматографии в сочетании с флуоресцентным детектором системы Kobra [Jongin Lee, Jae-Young Her, Kwang-Geun Lee. Reduction of aflatoxins (В₁, B₂, G₁, and G₂) in soybean-based model systems / Food Chemistry. 2015. In Press, Corrected Prof - Note to users] в модельных системах на основе соевых бобов (соевая матрица) с пределом количественного обнаружения (нг/г): В1 - 0,28, В2 - 0,34, G1 - 0,27, G2 - 0,25.

В этих способах одновременное количественное определение смеси афлатоксинов В1, В2, G1, G2 осложнено использованием дорогостоящего оборудования и наличием высокотоксичных растворителей, используемых в качестве подвижной фазы.

Известен способ количественного определение афлатоксинов В1 и В2 электрохимическим методом с помощью адсорбционной катодной инверсионной вольтамперометрии на электроде с висящей ртутной каплей [Hajian R., Ensafi А.А. Determination of aflatoxins B1 and B2 by adsorptive cathodic stripping voltammetry in groundnut / Food Chemistry. Analytical Methods. 2019. V. 115. №3. P. 1034-1037] в арахисе, выбранный в качестве прототипа. Вольтамперные измерения проводились с использованием прибора Metrohm, модель 797 с трехэлектродной электрохимической ячейкой в системе газообразного азота. В качестве рабочего электрода использовали электрод с висящей ртутной каплей, вспомогательного - угольный стержень и электрода сравнения - Ag/AgCl (3,0 M KCl). Были исследованы фоновые электролиты: 0,1 M фосфата, 0,1 M ацетата, 0,1 M бората и универсальная буферная смесь Бриттона-Робинсона (БР) в интервале рН от 2 до 11. Накопление проводили при потенциале -0,4 В в течение 60 с, в развертке потенциалов от -0,9 до -1,5 В. Градуировочные зависимости для афлатоксинов В1 и В2 были линейны в диапазонах 0,4-40 нг/мл и 0,2-70 нг/мл с пределом обнаружения (ПРО) 0,15 и 0,10 нг/мл соответственно. Результаты исследований сравнивали с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Недостатком этого способа является использование газообразного азота и токсической ртути.

Задачей заявленного изобретения является одновременное количественное определение смеси афлатоксинов В1, В2, G1, G2 методом инверсионной вольтамперометрии.

Предложенный способ одновременного количественного определения смеси афлатоксинов В1, В2, G1, G2 методом инверсионной вольтамперометрии, так же, как в прототипе, включает перевод афлатоксинов из пробы в раствор.

Согласно изобретению используют анодную инверсионную вольтамперометрию в дифференциальном режиме для одновременного количественного определения смеси афлатоксинов В1, В2, G1, G2 и стеклоуглеродный электрод в качестве индикаторного. Накопление смеси афлатоксинов в перемешиваемом растворе проводят в течение от 30 до 40 с при потенциале электролиза Е_э=(0,0±0,05) В относительно насыщенного хлоридсеребряного электрода на фоне 0,1 M сульфата аммония в диапазоне рН от 4 до 5 с последующей регистрацией анодных пиков в дифференциальном режиме съемки вольтамперограмм при скорости развертки потенциала от 20 до 30 мВ/с. Концентрацию смеси афлатоксинов В1, В2, G1, G2 определяют по высоте пиков в диапазоне потенциалов Ε_п(G1)=(+0,252±0,001) В, Ε_п(Β1)=(+0,505±0,002) В, Е_п(В2)=(+0,675±0,007) В, Е_п(G2)=(+0,902±0,001) В методом добавок аттестованных смесей.

Выбор стеклоуглеродного электрода обусловлен его высокой химической и электрохимической устойчивостью, отсутствием токсической ртути, широкой областью рабочих потенциалов, а также простотой механического обновления поверхности и требованиями техники безопасности.

Установленные условия проведения электродного процесса позволили количественно определять в совместном присутствии смесь афлатоксинов В1, В2, G1, G2 на основе реакции электроокисления. Предлагаемый вольтамперометрический способ позволил сократить количество используемых реактивов, в частности высокотоксичных растворителей, и дополнительных химических реагентов, используемых в аналогах, а также существенно улучшить метрологические характеристики одновременного количественного определения смеси афлатоксинов В1, В2, G1, G2 по сравнению с прототипом.

На фиг. 1 представлены вольтамперограммы электроокисления афлатоксинов В1, В2, G1, G2, полученные на стеклоуглеродном электроде методом добавок (время накопления - 30 сек при 0,0 В), где кривая 1-10 мл 0,1 M (NH₄)₂SO₄; кривая 2-10 мл 0,1 M (NH₄)₂SO₄+0,02 мл смеси афлатоксинов В1, В2, G1, G2; кривая 3-10 мл 0,1 M (NH₄)₂SO₄+0,04 мл смеси афлатоксинов В1, В2, G1, G2; кривая 4-10 мл 0,1 M (NH₄)₂SO₄+0,06 мл смеси афлатоксинов В1, В2, G1, G2, относительно Ag/AgCl, нас. KCl.

На фиг. 2 представлены градуировочные зависимости тока пика электроокисления афлатоксинов В1, В2, G1, G2, полученные на стеклоуглеродном электроде от объема аликвоты пробы, при следующих условиях: фоновый электролит - 0,1 (NH₄)₂SO₄; V_ал=0,02 мл; С_п(B1)=2·10^-7 мг/мл, С_п(В2)=6·10^-7 мг/мл, С_п(G1)=2·10^-7 мг/мл, С_п(G2)=6·10^-7 мг/мл; Е_нак=0,0 В; τ_э=30 с; Е_разв=0,0…+1,1 В; w=30 мВ/с.

На фиг. 3 представлены градуировочные зависимости тока пика электроокисления афлатоксинов В1, G1, полученные на стеклоуглеродном электроде от концентрации афлатоксинов в пробе, при следующих условиях: фоновый электролит - 0,1 (NH₄)₂SO₄; V_ал=0,02 мл; С_п(B1)=2·10^-7 мг/мл, С_п(G1)=2·10^-7 мг/мл; Е_нак=0,0 В; τ_э=30 с; Е_разв=0,0…+1,1 В; w=30 мВ/с.

На фиг. 4 представлены градуировочные зависимости тока пика электроокисления афлатоксинов В2, G2, полученные на стеклоуглеродном электроде от концентрации афлатоксинов в пробе, при следующих условиях: фоновый электролит - 0,1 (NH₄)₂SO₄; V_ал=0,02 мл; С_п(В2)=6·10^-7 мг/мл, С_п(G2)=6·10^-7 мг/мл; Е_нак=0,0 В; τ_э=30 с; Е_разв=0,0…+1,1 В; w=30 мВ/с.

В таблице 1 представлены вольтамперометрические условия одновременного количественного определения смеси афлатоксинов В1, В2, G1, G2.

В таблице 2 представлены результаты вольтамперометрического одновременного количественного определения смеси афлатоксинов В1, В2, G1, G2 в арахисе.

В таблице 3 представлена проверка правильности методики измерения методом «введено-найдено» на содержание афлатоксинов В1, В2, G1, G2 в пробах модельных растворов.

Пример 1. Определение содержания смеси афлатоксинов В1, В2, G1, G2 на уровне 2·10^-7 и 6·10^-7 мг/мл.

В кварцевый стаканчик емкостью 20 мл наливают 10 мл 0,1 M раствора сульфата аммония рН=4. Стаканчик с раствором помещают в электролитическую ячейку. Опускают в раствор электроды (индикаторный - стеклоуглеродный, вспомагательный и сравнения - хлоридсеребряные). Проводят электронакопление при потенциале (0,0±0,05) В в течение 30 с при перемешивании раствора и скорости развертки потенциала 20 мВ/с. По окончании электролиза начинают регистрацию вольтамперограммы в диапазоне потенциалов от 0,0 до +1,1 В (фиг. 1, кривая 1). Вольтампрограммы регистрировали в дифференциальном режиме съемки на комплексе аналитическом вольтамперометрическом типа СТА (ТУ 4215-001-20694097-98). Определение рН осуществляли с использованием переносного рН-метра-милливольтамперметра (рН-673). Погрешность в определении рН раствора не превышала ±0,1%. Отсутствие пиков свидетельствует о чистоте фона. Затем добавляют 0,02 мл стандартного раствора смеси афлатоксинов В1, В2, G1, G2 с концентрацией каждого афлатоксина в отдельности 1·10^-4 мг/мл, 3·10^-4 мг/мл, 1·10^-4 мг/мл, 3·10^-4 мг/мл соответственно и проводят электронакопление при потенциале (0,0±0,05) В в течение 30 с (таблица 1) при перемешивании раствора с последующей регистрацией вольтамперограммы в диапазоне потенциалов пиков E_п(G1)=(+0,252±0,001) В, Е_п(В1)=(+0,505±0,002) В, Е_п(В2)=(+0,675±0,007) В, E_п(G2)=(+0,902±0,001) В (отн. ХСЭ) при чувствительности прибора (0,5÷1)·10^-9 А/мм (фиг. 1, кривая 2). Проводят разметку вольтамперограмм, средняя высота анодных пиков составляет I_п(G1)=0,423 нА, Ι_п(Β1)=1,645 нА, I_п(В2)=0,754 нА, I_п(G2)=1,5865 нА. Далее в стаканчик с анализируемым раствором с помощью дозатора вносят добавку аттестованной смеси афлатоксинов В1, В2, G1, G2 в объеме 0,02 мл концентрацией каждого афлатоксина в отдельности 1·10^-4 мг/мл, 3·10^-4 мг/мл, 1·10^-4 мг/мл, 3·10^-4 мг/мл соответственно. Электронакопление и регистрацию аналитического сигнала проводят в тех же условиях (фиг. 1, кривая 3). Пики регистрируют в диапазоне потенциалов E_п(G1)=(+0,252±0,001) В, Ε_п(Β1)=(+0,505±0,002) В, Е_п(В2)=(+0,675±0,007) В, E_п(G2)=(+0,902±0,001) В (отн. ХСЭ), средняя высота анодных пиков составляет I_п(G1)=1,012 нА, Ι_п(Β1)=3,011 нА, I_п(В2)=1,196 нА, I_п(G2)=3,485 нА. Далее в стаканчик с анализируемым раствором вновь вносят с помощью дозатора добавку аттестованной смеси афлатоксинов В1, В2, G1, G2 в объеме 0,02 мл концентрацией каждого афлатоксина в отдельности 1·10^-4 мг/мл, 3·10^-4 мг/мл, 1·10^-4 мг/мл, 3·10^-4 мг/мл соответственно. Электронакопление и регистрацию аналитического сигнала проводят в тех же условиях (фиг. 1, кривая 4). Пики регистрируют в диапазоне потенциалов E_п(G1)=(+0,252±0,001) В, Ε_п(Β1)=(+0,505±0,002) В, Е_п(В2)=(+0,675±0,007) В, E_п(G2)=(+0,902±0,001) В (отн. ХСЭ), средняя высота анодных пиков составляет Ι_п(G1)=1,679 нА, Ι_п(Β1)=3,232 нА, I_п(В2)=1,143 нА, I_п(G2)=4,568 нА.

Линейный диапазон определяемых концентраций для смеси афлатоксинов В1, В2, G1, G2 составил (мг/мл): В1 - до 4·10^-7, В2 - до 12·10^-7, G1 - до 8·10^-7, G2 - до 18·10^-7 (фиг. 2-4).

Пример 2. Определение содержания смеси афлатоксинов В1, В2, G1, G2 в арахисе на уровне ПДК (5·10^-7 мг/мл).

Образцы пробы измельчают на высокой скорости в бытовом блендере в течение 3 минут. Затем отбирают 5 г пробы и проводят экстракцию водно-этанольным раствором 10 мл С₂Н₅ОН:H₂O (80:20) с последующим добавлением 5 мл гексана. Суспензию встряхивают в течение 3 минут и пропускают через бумажный фильтр. Для анализа полученный водный слой разбавляют в 10 раз. Затем 0,02 мл полученного анализируемого раствора вносят в кварцевый стаканчик с фоновым раствором 0,1 М сульфата аммония с рН=5. Проводят электронакопление при потенциале (0,0±0,05) В в течение 40 с при перемешивании раствора и скорости развертки потенциала 30 мВ/с. По окончании электролиза начинают регистрацию вольтамперограммы в диапазоне потенциалов от 0,0 до +1,1 В. Анодные пики смеси афлатоксинов B1, В2, G1, G2 фиксируют в диапазоне потенциалов E_п(G1)=(+0,252±0,001) В, Е_п(В1)=(+0,505±0,002) В, Е_п(В2)=(+0,675±0,007) В, E_п(G2)=(+0,902±0,001) В на стеклоуглеродном электроде при чувствительности прибора (1÷5) 10^-8 А/мм в дифференциальном режиме съемки вольтамперограмм. Массовую концентрацию смеси афлатоксинов В1, В2, G1, G2 в пробе оценивают методом добавок аттестованных смесей, измеряя высоту анодных пиков (фиг. 3, 4) по формуле (1):

,

где:

X₁ - содержание афлатоксина в анализируемой пробе, мг/мл;

С_д - концентрация афлатоксина в аттестованной смеси /АС/, из которой делается добавка к анализируемой пробе, мг/мл;

V_д - объем добавки АС афлатоксина, мл;

I₁ - величина максимального тока компонента в анализируемой пробе, нА;

I₂ - величина максимального тока компонента в пробе с добавкой АС, нА;

V_ал - объем навески пробы, взятой для анализа, мл.

Время анализа одной пробы с учетом времени пробоподготовки занимает около 37 минут. В таблице 2 представлены результаты вольтамперометрического одновременного количественного определения смеси афлатоксинов В1, В2, G1, G2 в арахисе.

Проведена проверка правильности методики измерения методом «введено-найдено» на модельных растворах (таблица 3) с погрешностью измерений 15-20%.

Предложенный способ прост, не требует большого количества реактивов и трудозатрат и может быть использован в любой химической лаборатории, имеющей полярограф, особенно в настоящее время, когда налажен выпуск отечественной и зарубежной электроаппаратуры с контрольным управлением и обработкой данных (анализаторы типа СТА, ТА и др.).