Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВОЙ БИОМАССЫ БАЗИДИАЛЬНОГО ГРИБА Pleurotus pulmonarius

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к процессу выращивания биомассы высших грибов, в том числе Pleurotus pulmonarius методом глубинного культивирования, и может быть применено в пищевой промышленности для получения белковых пищевых добавок для использования в хлебопекарной, мясоперерабатывающей и других отраслях пищевой промышленности с целью обогащения пищевых продуктов высококачественным белком.

Способ глубинного культивирования в настоящее время используется для получения белковой биомассы базидиомицетов с высоким содержанием белка, содержащей в своем составе ненасыщенные жирные кислоты (линолевую, линоленовую), витамины, минеральные вещества. Биомасса может применяться не только как белковая пищевая добавка, но и как природный комплексный источник для выделения биологически активных соединений. В процессе глубинного культивирования грибной мицелий растет в жидкой среде в динамических условиях. Непрерывный барботаж питательной среды воздухом поддерживает растущий мицелий на протяжении всего процесса культивирования во взвешенном состоянии, что не соответствует условиям произрастания грибного таллома в природной среде обитания. Развитие базидиомицетов в природных условиях является процессом твердофазной ферментации растительного субстрата. Для стабильного развития грибного мицелия и дальнейшего формирования плодового тела грибной таллом фиксируется на растительных объектах, обладающих пористой структурой (пни, деревья, валежники).

При культивировании в глубинных условиях гриб вынужден стабилизировать свое положение, прикрепляясь к стенкам ферментера и воздухоподающего оборудования. Это приводит к перекрыванию отверстий подачи воздуха и к обрастанию стенок ферментера растущим мицелием. В результате этого процесса появляется необходимость очистки воздухоподающего оборудования и стенок ферментера после каждого цикла культивирования. В то же время преимуществом глубинного культивирования мицелия является значительно более высокая скорость роста по сравнению с выращиванием плодовых тел.

Известен способ получения белковой биомассы путем глубинного культивирования Panus tigrinus 3-204 ВКПМ F-810 на молочной сыворотке в условиях аэрации при температуре 32-34°C и pH 5,8-6,5 с последующим отделением биомассы. Предпочтительно используется отъемно-доливной метод культивирования в течение 60 ч с отъемом культуры в количестве 40-50% от общего объема культуральной жидкости, ее фильтрации и последующей сушки биомассы при температуре 60°C [1].

Известен способ получения белковой биомассы гриба путем глубинного культивирования штамма Pleurotus osteatus 2-204 ВКПМ F-811 на питательной среде, состоящей из молочной сыворотки и аммония сернокислого или аммония фосфорнокислого двухзамещенного [2]. Процесс культивирования протекает в течение 60-72 ч в условиях аэрации (расход воздуха составляет 0,8-1,0 л/л мин), с автоматической подпиткой 3% NaOH. Культивирование ведут отъемно-доливным способом с отъемом культуры в количестве 40-50% от общего объема культуральной жидкости на фильтрацию и последующую сушку при 50-60°C. Выход сухой биомассы составляет 17-25 г/л среды.

Недостатком обоих приведенных выше способов получения белковой грибной биомассы является отделение биомассы от культуральной жидкости методом фильтрования, что приводит к дополнительным энерго- и трудозатратам и увеличивает продолжительность процесса получения готового продукта в связи с дополнительной стадией промывки биомассы и очистки фильтров.

Наиболее близким к заявленному способу по технической сущности и достигаемому результату является способ получения белковой биомассы на основе базидиального гриба Pleurotus ostreatus ВКПМ F-720 [3]. Процесс культивирования проводят в глубинных условиях при температуре 26-28°C и pH 6,0-7,5 на жидком пивном сусле (4° по Баллингу) с добавлением 0,1% пептона в присутствии ПАВ. В основе лежит отъемно-доливной метод культивирования. Через каждые 30 часов проводят слив культуральной жидкости в количестве не более 50% от общего объема. По окончании ферментации биомассу отфильтровывают, промывают и высушивают при 50-60°C.

Недостатком данных способов является применение фильтрации на стадии отделения биомассы от культуральной жидкости, что в производственных условиях значительно увеличивает длительность процесса и приводит к дополнительным энерго- и трудозатратам, следовательно, и к повышению себестоимости готового продукта.

Наиболее близким к заявленному способу по технической сущности и достигаемому результату является способ глубинного культивирования Pleurotus pulmonarius [4]. Культивирование проводится на крахмал-аммонийной среде с содержанием крахмала 2% в течение 96 часов при температуре 26±1°C, pH 5,0 при непрерывном перемешивании путем барботирования стерильным воздухом.

Недостатком способа является применение фильтрации на стадии отделения биомассы от культуральной жидкости, что представляет собой трудоемкую операцию. Кроме того, после процесса отделения полученной биомассы от культуральной жидкости на фильтре остаются балластные примеси в виде коллоидов и взвесей, что приводит к дополнительному процессу промывки биомассы, очистке фильтров.

Процесс глубинного культивирования может стать экономически целесообразным при создании технологий, учитывающих физиологические особенности мицелиального строения используемого продуцента, а именно применение способа иммобилизации глубинного мицелия на полимерном носителе.

Задачей настоящего изобретения является разработка процесса культивирования Pleurotus pulmonarius с применением способа иммобилизации глубинного мицелия на полимерном носителе, упрощение процесса культивирования и исключение из технологического процесса стадий фильтрации и промывки биомассы.

Технический результат заключается в упрощении технологического процесса получения биомассы путем фиксации мицелия на полимерной сетке из полиэтилена высокого давления, однородного распределения биомассы в процессе роста грибной культуры и упрощении технологического процесса в результате равномерной сушки в тонком слое полученной структурированной биомассы на полимерной сетке и легкости отделения биомассы от полимерной сетки механическим способом.

Мицелий гриба, зафиксированный и растущий в процессе культивирования в плоскости полимерного носителя, является более доступным для поступления питательных веществ и кислорода, растворенных в среде.

Указанный технический результат достигается способом получения белковой биомассы путем глубинного культивирования грибов Pleurotus pulmonarius РР-3.2 на крахмал-аммонийной среде при температуре 23-25°C и pH 5,5-6,0, в течение 40-48 часов в условиях аэрации с последующим отделением биомассы и сушкой, при этом культивирование проводят путем иммобилизации глубинного мицелия на полимерной сетке из полиэтилена высокого давления с размером ячеек 2×2 мм, а отделение биомассы и сушку проводят совместно с полимерным носителем.

Упрощение процесса культивирования достигается путем полного исключения из технологической схемы стадии фильтрования, так как в процессе культивирования выращенный мицелий иммобилизуется на полимерном носителе и по окончании культивирования извлекается из культуральной жидкости совместно с носителем. После слива культуральной жидкости и биомасса, закрепленная на сетчатом носителе, при необходимости может быть промыта. После сушки иммобилизованный мицелий легко отделяется от носителя в виде порошка и не требует дополнительного измельчения, полученный продукт получается более однородным по структуре.

Из технологического цикла исключаются стадии суспензирования, центрифугирования, фильтрования, распределения биомассы тонким слоем для сушки, измельчение. Улучшение качества продукта, полученного предлагаемым способом, обосновывается на отсутствии в его составе остаточных компонентов питательной среды и метаболитов, которые выделяет гриб в питательную среду в процессе роста, так как культуральная жидкость, содержащая указанные компоненты, не фильтруется, а свободно сливается из культивационной емкости, а иммобилизованная на сетке биомасса дополнительно может быть промыта проточной водой.

В результате сушки биомассы, равномерно распределенной (структурированной) в процессе культивирования тонким слоем по поверхности полимерного сетчатого носителя, получается продукт, имеющий структуру, удобную для дальнейшего использования.

Предлагаемый способ может быть применен и для других мицелиальных грибов и является унифицированным.

Отличительной особенностью предлагаемого способа является то, что получение белковой биомассы включает глубинное культивирование базидиомицета Pleurotus pulmonarius в условиях аэрации на питательной среде с применением способа иммобилизации мицелия с последующим отделением биомассы от культуральной жидкости путем ее слива и промывки биомассы, закрепленной на полимерном носителе. В качестве продуцента используют штамм Pleurotus pulmonarius РР-3.2. Культивирование проводят при pH 5,5-6.0 и температуре 23-25°C. В процессе культивирования применяется способ иммобилизации глубинного мицелия гриба на полимерном сетчатом носителе. Для этого используется аппарат, снабженный полимерным сетчатым носителем, зафиксированным в емкости аппарата и находящимся в глубине питательной среды.

При использовании предлагаемого способа иммобилизации глубинный мицелий гриба фиксируется на полимерном носителе и растущие гифы не скручиваются, а закрепляются в ячейках. В результате этого рост глубинной культуры происходит в плоскости сетки. Выращенный иммобилизованный мицелий извлекается из культуральной жидкости совместно с сеткой. После сушки биомасса легко отделяется от носителя в виде порошка и не требует дополнительного измельчения.

На фиг. 1 показан фрагмент полимерного носителя с иммобилизованным глубинным мицелием Pleurotus pulmonarius после отделения культуральной жидкости; на фиг. 2 - фрагмент полимерного носителя с иммобилизованным глубинным мицелием Pleurotus pulmonarius после отделения культуральной жидкости (с увеличением в 3 раза); на фиг. 3 - внешний вид глубинной культуры в процессе культивирования без иммобилизации глубинного мицелия примера 2; на фиг. 4 - внешний вид глубинной культуры в процессе культивирования с иммобилизацией глубинного мицелия на полимерном носителе примера 2.

Способ осуществляется следующим образом. Выращивают чистую культуру гриба Pleurotus pulmonarius на сусловом агаре. Затем полученный поверхностный мицелий переносят в емкость с подготовленной питательной средой, в которой проводят процесс выращивания посевного материала при перемешивании. Питательная среда содержит в своем составе источник углерода (крахмал), источник азота (NH₄ ⁺) и комплекс минеральных солей, содержащий все необходимые для роста мицелия анионы (K⁺, Na⁺, Mg²⁺, Са²⁺, SO₄ ^2-, Cl^-, РО₄ ^3-). Далее посевной материал засевается в аппарат для культивирования с аналогичной питательной средой. Внутри емкости аппарата установлена сетка для иммобилизации мицелия. Процесс культивирования проводят при температуре 23-25°C и pH 5,5-6,0 и непрерывном барботаже воздухом. По окончании культивирования выросшую биомассу извлекают из культуральной жидкости совместно с полимерным носителем. После сушки при температуре 35-40°C порошок мицелия легко отделяется от носителя и упаковывается в тару.

Пример 1. Культуру Pleurotus pulmonarius выращивают на агаризованном сусле в чашке Петри в течение 7 суток. Из краевой зоны роста семисуточной культуры вырезают агаровые блоки воздушного мицелия пробойным сверлом диаметром 8 мм, которые в стерильных условиях переносят в три конических колбы вместимостью 300 мл с объемом питательной среды 150 мл. Питательная среда содержит в своем составе: - источник углерода (крахмал) - 2%; (NH₄)₂SO₄ - 3,5 г/л; NaNO₃ - 3,5 г/л; K₂HPO₄ - 0,2 г/л; KH₂PO₄ - 1,3 г/л; MgSO₄ - 0,5 г/л; CaCl₂ - 0,1 г/л; NaCl - 0,1 г/л; KCl - 0,8 г/л.

Выращивание посевного материала проводят в глубинных условиях на лабораторном шейкере при 220 об/мин. Полученный инокулят объемом 450 мл засевают в биореактор с подготовленной питательной средой, в результате начальная концентрация культуры в реакторе составляет 5,5 г/л.

Культивирование проводят в лабораторном биореакторе СеСа (Gallenkamp controlled environment culture apparatus, made in England BY) с рабочим объемом 2 литра. Используемый биореактор снабжен полимерным сетчатым носителем, который фиксируется внутри рабочей емкости реактора, таким образом, что вся поверхность носителя находится в питательной среде.

В качестве полимерного носителя в данной работе используют полимерную сетку, изготовленную в соответствии с ГОСТ 16337-77 ПВД без добавления красителей. Размер ячеек составляет (2×2) мм. Свойства применяемого полимерного носителя удовлетворяют следующим требованиям: химическая и биологическая стойкость; высокая механическая прочность; достаточная проницаемость для субстрата и аэрируемого воздуха. Культивирование проводят при непрерывном перемешивании за счет барботирования воздуха. Расход воздуха составляет 1,6 л/л мин. Температура культивирования 25°C, pH 6,0.

В течение четырех-шести часов культивирования глубинный мицелий Pleurotus pulmonarius полностью фиксируется в ячейках, и дальнейший его рост продолжается в плоскости полимерного сетчатого носителя. Процесс культивирования проводят в течение 48 часов. По окончании процесса культуральную жидкость удаляют из биореактора через нижний слив. Балластные примеси в виде коллоидов и взвесей, присутствующие в растворе, удаляются из реактора совместно с культуральной жидкостью. Выращенную биомассу извлекают совместно с полимерным носителем.

Полноту извлечения глубинной биомассы оценивают на основании определения содержания белка в культуральной жидкости.

Иммобилизованную биомассу высушивают при температуре 40°C. После сушки иммобилизованный мицелий легко отделяется от носителя в виде порошка. Готовый сухой продукт имеет светло-коричневый цвет, содержит в своем составе белков - 31,5%, липидов - 9,8%, в том числе ненасыщенных жирных кислот в их составе - 68,4%, содержание нуклеиновых кислот составляет 1,12%. Полученная биомасса может быть использована в качестве белковой пищевой добавки и для обогащения белками пищевых продуктов.

Примеры 2 и 3 аналогичны примеру 1. В примере 2 процесс культивирования проведен в конической плоскодонной колбе объемом 2 л. Условия проведения процесса культивирования приведены в таблице 1.

В таблице 1 приведены результаты выращивания биомассы Pleurotus pulmonarius при различных параметрах процесса культивирования.

В таблице 2 приведены сравнительные режимы культивирования биомассы, полученной по способу-прототипу и предлагаемому способу.

Как видно из данных таблицы 2, в предлагаемом способе глубинный мицелий фиксируется на сетке полимерного носителя (фиг. 4), а в прототипе рост мицелия происходит по всему объему питательной среды (фиг. 3), который в дальнейшем либо сбивается в агломераты, либо пытается прикрепиться к стенкам аппарата и к трубкам воздухопадающего оборудования. В предлагаемом способе культуральная жидкость в процессе культивирования остается прозрачной, так как весь мицелий закреплен на полимерном носителе и отделяется совместно с носителем. В прототипе отделение биомассы от культуральной жидкости проводят методом фильтрования.

Предлагаемый способ позволяет полностью исключить из технологической схемы наиболее трудоемкую операцию отделения выращенной биомассы. Биомасса, закрепленная на сетчатом носителе, при необходимости может быть промыта перед сушкой. Процесс сушки иммобилизованной биомассы на полимерной сетке протекает значительно быстрее и качественнее, чем сушка отфильтрованной биомассы в предварительно распределенном тонком слое по поверхности.

Получаемый готовый продукт имеет однородную структуру, не имеет включений, посторонних примесей. Высушенная биомасса в виде порошка не требует дополнительного измельчения.

Полученная предложенным способом биомасса может быть использована как белковая пищевая добавка, а также в качестве сырья для выделения биологически активных соединений.

В процессе глубинного культивирования базидиомицеты на определенных этапах своего развития выделяют биологически активные соединения в культуральную жидкость. Полученная данным способом культуральная жидкость может быть использована для выделения определенных классов биологически активных соединений, которые тоже могут найти свое применение в фармакологической промышленности.

Предлагаемый способ может быть использован для получения глубинной биомассы и для других грибов, имеющих мицелиальное строение.

Источники информации

1. Способ получения белковой биомассы гриба. Бирюков В.В., Биттеева М.Б., Черкезов А.А., Ширшиков, Н.В., Щеблыкин И.Н., Горшина Е.С., Осипова В.Г., Коваленко Н.В., Китайкин В.М., Зюкова Л.А. Патент RU 2186851 С12Р 21/00, C12N 1/14, C12N 1/14, C12R1:645 от 10.08.2002.

2. Способ получения белковой биомассы гриба. Биттеева М.Б., Бирюков В.В., Черкезов А.А., Ширшиков, Н.В., Щеблыкин И.Н., Горшина Е.С., Шушеначева Е.В., Стехновская Л.Д., Китайкин В.М., Зюкова Л.А. Патент RU 2189395 С12Р 21/00, C12N 1/14, C12N 1/14, C12R1:645 от 20.09.2002.

3. Способ получения белковой биомассы. Колесникова В.Ф., Пцкиаладзе Д.А. Патент RU 2126835 С12Р 21/00, C12N 1/14, C12N 1/14, C12R1:645 от 27.02.1999.

4. Мельникова, Е.А. Морфологические особенности базидиального гриба Pleurotus pulmonarius в поверхностной и глубинной культуре /Е.А. Мельникова, П.В. Миронов, Ю.А. Литовка // Вестник Крас ГАУ. - 2013. - №7. - С. 170-175.