УСТРОЙСТВО И СПОСОБ АВТОМАТИЗИРОВАННОГО ПОДДЕРЖАНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ РАСТВОРЕННЫХ ГАЗОВ В КУЛЬТУРАЛЬНОЙ СРЕДЕ В МИКРОФЛЮИДНОЙ СИСТЕМЕ

Область техники

Изобретение относится к устройствам - микробиореакторам, предназначенным для работы с клетками тканей человека, животных или растений, культурами вирусов, которые могут быть использованы для создания и культивирования клеточных моделей тканей и органов млекопитающих и моделирования межорганных взаимодействий.

Уровень техники

Микробиореакторы (микрофлюидные или микрожидкостные устройства или системы, или микрофлюидные чипы) представляют собой биореакторы, предназначенные для культивирования клеток или микроорганизмов в ячейках объемом от нескольких микролитров до нескольких миллилитров. Известны различные варианты конструкций микробиореакторов для культивирования клеток, основным конструктивным элементом которых являются ячейки для культивирования клеток, которые могут быть изолированы друг от друга, либо соединены единой системой каналов, по которым осуществляется движение питательной среды. В последнем случае для получения в питательной среде близких к естественным концентраций метаболитов требуется обеспечить замкнутую циркуляцию минимально необходимого количества питательной среды, при этом объем жидкости в каналах сравним с объемом жидкости в ячейках. В зависимости от конструкции микробиореактора, ячейки могут быть открыты в окружающую среду микробиореактора, закрыты мембраной, или закрыты герметично. Малый объем ячеек может обуславливаться необходимостью воспроизведения трофических характеристик ткани или характерных размеров структурной единицы органа. Важной задачей микробиореактора является воспроизведение in vitro параметров культивирования клеток с приближенными in vivo значениями. Одним из таких параметров является концентрация растворенных в межклеточной жидкости газов. Обычно данная задача решается использованием СО₂-инкубаторов или мультигазовых инкубаторов, устройств, поддерживающих заданную концентрацию газов в определенным объеме. Однако инкубатор является достаточно дорогостоящим оборудованием, усложняющим работу с микробиореакторами, поэтому является актуальной задача поддержания заданной концентрации растворенных газов в культуральной среде на базе интегрального решения в микрофлюидной системе.

Из уровня техники известен патент US 8408073, в котором представлен способ определения объема, плотности и/или скорости потока газосодержащей жидкости в микрофлюидном устройстве, с использованием резонансной трубки, обладающей достаточной чувствительностью для считывания объема газа в пузырьках в жидкости или скорости потока и/или плотности растворенного в жидкости газа или смеси газов, проходящей через трубку. Трубка содержит выступающую часть над поверхностью подложки, способную вибрировать в плоскости, нормальной к поверхности подложки. При протекании жидкости, содержащей газ, через внутреннюю часть трубки, управляющий сигнал заставляет вибрировать выступающую часть трубки на резонансной частоте. При этом обнаруживают отклонения Кориолиса выступающей части трубки по отношению к подложке и формируют выходной сигнал, который в совокупности с управляющим сигналом используют для определения плотности растворенного в жидкости газа или смеси газов.

Данное решение может быть использовано для определения концентрации растворенных газов в культуральной среде, однако оно не обеспечивает автоматического поддержания концентрации растворенного в жидкости газа, поскольку не предоставляет средств автоматизированного изменения концентрации газа на основании проведенных измерений.

Из патента KR 101294521 известно устройство управления концентрацией кислорода и способ создания условий гипоксии для тканевой культуры на микрофлюидной основе. Устройство для управления концентрацией растворенного кислорода в клетках включает: первый канал, обеспечивающий пространство для тканевой культуры; второй канал, расположенный на одной стороне первого канала; промежуточную мембрану, разделяющую первый и второй каналы и модуль подачи абсорбента кислорода во второй канал для переноса межклеточного растворенного кислорода из первого канала во второй через разделяющую мембрану. Способ управления растворенным кислородом в клетках с помощью данного устройства включает: выращивание клеток в первом канале и подачу абсорбента кислорода во второй канал для уменьшения парциального давления кислорода в первом канале.

Из международной заявки WO 2014082377 известен микрофлюидный чип для генерации раствора определенной концентрации, который выполнен с возможностью получения определенных градиентов концентрации, удовлетворяя различным требованиям, и позволяющий не только выращивать суспензионные культуры микроорганизмов или клеток, но и определять специфические композиции в культуральном растворе. Согласно данному изобретению, микрофлюидный чип реализует разделение между каналами для потоков жидкости, имеет меньшие требования к точности сборки различных слоев и позволяет располагать каналы намного ближе друг к другу. Концентрация газа в микрофлюидном чипе определяется различными объемами газа, диффундирующего в раствор через газопроницаемую мембрану в нескольких точках пересечения или различных областях пересечения; концентрация растворенного газа в основном определяется количеством точек пересечения или размером областей пересечения.

Однако данные технические решения не обеспечивают автоматизированного поддержания концентрации растворенных газов в культуральной среде микрофлюидной системы при изменении потребления газов в этой системе, поскольку описанные средства изменения концентрации растворенных газов не предполагают их автоматическую подстройку на основании результатов измерений.

Реализация автоматического поддержания концентрации растворенных в жидкости газов предлагается в публикациях US 5188962 и US 2009220935. Из патента US 5188962 известно устройство для выращивания клеток. Согласно описанию данного устройства, факторы питательной среды, такие как концентрация растворенного кислорода и величина рН, настраиваются в соответствии с желательными значениями путем управления газовым смесителем на основании значений, измеренных соответствующими датчиками. Например, когда измеритель растворенного кислорода определяет его недостаток, открывается кислородный или воздушный клапан для приготовления газовой смеси с высоким содержанием кислорода, подлежащей растворению в питательной среде в водяном баке. Напротив, когда обнаруживается избыток кислорода, может быть открыт азотный клапан для увеличения содержания азота, а следовательно, уменьшения содержания кислорода. Таким образом, количество растворенного кислорода может быть уменьшено при сохранении общего количества растворенного в жидкости газа.

Наиболее близкими к предлагаемым техническим решениям являются устройство и способ управления концентрацией растворенного кислорода в параллельном массиве интегрированного биореактора, известные из материалов заявки US 2009220935. Параллельный интегрированный биореактор включает несколько сосудов, каждый из которых связан с перистальтическим оксигенирующим смесителем, включающим проницаемую для кислорода мембрану. Каждый оксигенирующий смеситель имеет газовый ввод и газовый вывод, при этом газовый ввод связан с газовым резервуаром. Для управления концентрацией кислорода в резервуаре предусмотрен переключатель газового смесителя. В предпочтительном варианте исполнения биореактор также включает выдерживающие давление клапаны для управления газовыми вводами и выводами. Биореактор также может включать первый слой с множеством камер роста, второй слой с перистальтическим оксигенирующим смесителем и третий слой, включающий множество выдерживающих давление клапанов. В предпочтительном варианте исполнения предусмотрены источник воздуха и источник кислорода. Переключатель газового смесителя попеременно соединяет источник воздуха и источник кислорода с резервуаром в течение выбранного рабочего цикла для управления концентрацией кислорода в резервуаре. Способ управления концентрацией растворенного кислорода в газовом резервуаре осуществляют путем переключения входа в резервуар между газом с относительно низкой концентрацией кислорода и газом с относительно высокой концентрацией кислорода. Газ доставляется из газового резервуара в камеру роста и отслеживается концентрация растворенного кислорода в камере роста. Переключение входа по результатам отслеживания концентрации растворенного кислорода управляется таким образом, чтобы поддерживать определенную концентрацию в камере роста. Одним из вариантов алгоритма управления является метод ПИД-регулирования, согласно которому рабочий цикл переключателя выбирается согласно ошибке концентрации растворенного кислорода, интегралу и производной ошибки.

Недостатком известных технических решений является необходимость размещения в камере роста датчика для измерения концентрации растворенного газа, что, во-первых, может усложнять работу с клеточными культурами, находящимися в сосуде, и, во-вторых, предъявляет повышенные требования к этому датчику. В частности, в течение срока службы датчик должен сохранять точность, чувствительность и избирательность при воздействии растворенных в культуральной среде соединений. Например, известна проблема блокирования чувствительного элемента датчика слоем белка. Кроме того, размещение датчика в камере роста может потребовать разработки герметичного соединения датчика с камерой роста, что является технически сложной задачей для микрофлюидных устройств. Другим недостатком является тот факт, что размещение датчика в камере роста или другом месте микрофлюидной системы может потребовать увеличения объема жидкости, что обычно является нежелательным для микрофлюидных устройств.

Кроме того, размещение датчика непосредственно в камере роста (ячейке для культивирования клеток) может отрицательно сказываться на процессе культивирования, в частности может иметь место стрессирование клеток, вызванное воздействием датчика (например, воздействием перекиси водорода, образующейся в некоторых электрохимических датчиках), приводящее к тому, что получаемая модель становится непригодной для проведения исследований.

Раскрытие изобретения

Задачей, на решение которой направлено изобретение, является разработка технологии (способа и устройства) поддержания требуемой концентрации растворенных газов в культуральной среде, питающей клеточные культуры, культивируемые в микрофлюидной системе, обеспечивающей создание физиологичных условий их культивирования.

Достигаемый технический результат заключается: в отсутствии взаимного негативного влияния клеточных культур и элементов устройства, поддерживающего концентрацию растворенных газов, и как следствие, увеличении срока службы и надежности заявляемого устройства при достаточно высокой точности поддержания концентрации растворенных газов и сохранении характерно низкого для микрофлюидных устройств объема жидкости в каналах.

Поставленная задача решается тем, что способ автоматического поддержания концентрации растворенных газов в культуральной среде, находящейся в ячейке с клеточной моделью и циркулирующей по микрофлюидным каналам микрофлюидной системы, выполненным в слое из газопроницаемого материала, с использованием каналов подачи газа, выполненных также в слое из газопроницаемого материала, независимо от микрофлюидных каналов, основан на использовании пропорционально-интегро-дифференцирующего (ПИД) регулирования, в котором в качестве измеряемого параметра используют значение концентрации кислорода и/или углекислого газа в слое из газопроницаемого материала, по крайней мере, в одной отдельной измерительной ячейке, не соединенной с упомянутыми каналами и ячейкой с клеточной моделью, а в качестве заданного параметра - параметр, рассчитанный исходя из требуемого параметра концентрации упомянутых газов в ячейке с клеточной моделью с учетом коэффициента связи концентраций в измерительной и клеточной ячейках, при этом измерение концентрации газов осуществляют непрерывно или периодически - не реже 1 раза в минуту.

Измерение концентрации газа осуществляют с помощью, по крайней мере, одного датчика, размещенного в измерительной ячейке вблизи ячейки с клеточной моделью. Предпочтительно измерительную ячейку с датчиком размещать от ячейки с клеточной моделью на расстоянии не более 40% от диаметра ячейки с клеточной моделью. Измерительную ячейку, как правило, размещают на участке между микрофлюидным каналом и каналом подачи газа. Возможен вариант с использованием, по крайней мере, двух измерительных ячеек, одна из которых предназначена для измерения концентрации кислорода, а вторая - углекислого газа. Возможен также вариант использования одной измерительной ячейки с размещенными в ней двумя датчиками. Измерительная ячейка может быть заполнена контрольной жидкостью, состав которой представляет собой водный раствор солей серебра или деионизированную воду. В качестве датчика измерения концентрации могут быть использованы датчик с твердым электролитом, например Figaro SK-25F, или датчик, представляющий собой электрод второго рода, или NDIR датчик, например SprintIR GC-0017, или флуоресцентный датчик, например Presens CD1.

Поставленная задача решается тем, что устройство поддержания концентрации растворенных газов в культуральной среде, находящейся в ячейке с клеточной моделью и циркулирующей по микрофлюидным каналам микрофлюидной системы, выполненным в слое из газопроницаемого материала, с использованием каналов подачи газа, выполненных также в слое из газопроницаемого материала, независимо от микрофлюидных каналов, с возможностью подключения к источнику газа через клапан, включает, по крайней мере, один датчик для измерения концентрации углекислого газа и/или кислорода, размещенный в отдельной измерительной ячейке, выполненной в слое из газопроницаемого материала, не соединенной с упомянутыми каналами и ячейкой с клеточной моделью; соединенный с датчиком ПИД-регулятор, выполненный с возможностью подачи управляющего сигнала на клапан. При этом заявляемому устройству также могут быть присущи конструктивные признаки, реализующие перечисленные выше признаки способа.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется чертежами, где на фиг. 1 и 2 представлено схематичное изображение микрофлюидной системы - вид сверху и сбоку, соответственно, на фиг. 3 представлен горизонтальный разрез слоя газопроницаемого материала в плоскости микрофлюидных каналов и канала подачи газовой смеси, на фиг. 4 и фиг. 5 представлен вертикальный разрез микрофлюидной системы, проходящий через измерительную ячейку с установленным в ней датчиком (два варианта), на фиг. 6 представлена структурная схема заявляемого устройства поддержания концентрации растворенных газов в культуральной среде микрофлюидной системы.

Позициями на чертежах обозначены: 1 - канал подачи газа, 2 - пластина, 3 - слой стекла, 4 - вход канала подачи газа, 5 - выход канала подачи газа, 6 - микрофлюидные каналы (микроканалы), 7 - слой газопроницаемого материала, 8 - измерительная ячейка, 9 - ячейка с клетками (или ячейка с клеточной моделью), 10 - крышка ячейки с клетками, 11 - датчик, 12 - флюоресцентный чувствительный элемент, 13 - световод, 14 - ПИД-регулятор, 15 - электромагнитный клапан, 16 - регулятор давления газа, 17 - источник газа.

Осуществление изобретения

Изобретение предназначено для использования в микрофлюидных системах (микробиореакторах) для создания и культивирования клеточных моделей органов и тканей млекопитающих. Конструкция микрофлюидной системы представляет собой, как правило, трехслойную структуру (фиг. 1-5), верхний слой которой образован пластиной 2, выполненной, например, из поликарбоната толщиной 10 мм, на которой отлит слой из газопроницаемого материала 7, например, полимерного оптически прозрачного полидиметилсилоксана (ПДМС) толщиной 2 мм и размерами 25×75 мм, содержащий объединенные системой микрофлюидных (микрожидкостных) каналов (микроканалов), ячейки 9 для культивирования клеточных моделей тканей и органов млекопитающих в проточном или замкнутом режимах, а также нижний слой, образованный стандартным предметным стеклом 3 толщиной 1 мм, герметизирующий микрофлюидные каналы в слое ПДМС.

Для поддержания концентрации растворенных газов в культуральной среде конструкция микрофлюидной системы дополнительно снабжена одним или несколькими независимыми (от микрофлюидных каналов) каналами подачи газа 1, имеющими вход 4 и выход 5, выполненными в слое газопроницаемого материала 7 (ПДМС), и, по крайней мере, одним датчиком измерения концентрации газа 11 (например, углекислого газа и/или кислорода), который также размещен в упомянутом слое. При этом в предпочтительном варианте осуществления изобретения каналы подачи газа 1 размещены внутри контура микрофлюидного канала 6 (фиг. 3), а газопроницаемый слой 7 снабжен, по крайней мере, одной измерительной ячейкой 8 для размещения датчика 11. Заявляемое устройство поддержания концентрации растворенных газов в культуральной среде содержит также контроллер 14, соединенный с датчиком 11 (12, 13), электромагнитный клапан 15 и регулятор давления газа 16, расположенные со стороны входа 4 канала подачи газа 1, через которые осуществляется соединение канала подачи газа 1 с источником газа 17, при этом контроллер 14 выполнен с возможностью подачи управляющих команд на электромагнитный клапан 15.

Предпочтительным в конструкции заявляемого устройства является расположение измерительной ячейки 8 с датчиком 11 в непосредственной близости с ячейкой для клеток 9 (на расстоянии 1-2 мм).

Ячейки 9 и микроканалы 6 заполнены культуральной средой. Культуральная среда приводится в движение с помощью насоса, который может быть встроен в конструкцию микроканала. В одном из вариантов выполнения встроенный насос состоит из управляемых пневматически двух клапанов и рабочей камеры, которые представляют собой гибкие тонкостенные мембраны. Каждая ячейка 9 снабжена крышкой 10, герметично закрывающей ячейку.

Обратная связь, определяющая промежутки времени подачи газа, основана на косвенной оценке концентрации растворенного газа в культуральной среде, размещенной в микрофлюидных каналах, на основании данных датчика 11 (или 12, 13) о концентрации газа в измерительной ячейке 8. В частности, регулирование концентрацией растворенных газов осуществляется посредством периодического или постоянного контроля текущих параметров концентрации с помощью датчика 11 и подачи на вход 4 канала подачи газа 1 газа или смеси газов с заданными параметрами (в зависимости от требуемого соотношения концентраций в ячейке, например чистый углекислый газ или смесь углекислого газа и кислорода в соотношении 1:1) в течение определенных промежутков времени. Промежутки времени могут выбираться в соответствии с принципом пропорционально-интегро-дифференциирующего регулятора (ПИД-регулятора). В частности, промежуток времени может являться суммой трех слагаемых, первое из которых (сигнал рассогласования) пропорционально разности заданной концентрации в измерительной ячейке 8 (входного сигнала) и измеренной концентрацей в измерительной ячейке 8 (сигнала обратной связи), второе - интегралу сигнала рассогласования, третье - производной сигнала рассогласования.

Коэффициенты ПИД-регулятора могут быть подобраны экспериментально с обеспечением минимального времени выхода концентраций газов на заданные.

Заданная концентрация в измерительной ячейке 8 определяется исходя из требуемой концентрации в ячейке 9 на основе соотношения между концентрациями в измерительной ячейке 8 и ячейке 9, полученной с помощью численного моделирования диффузии в слое газопроницаемого материала 7 газа из канала подачи газа 1 или экспериментально. При этом концентрация газа в измерительной ячейке 8 линейно зависит от концентрации растворенного газа в микрофлюидных каналах 6 благодаря диффузии газов через газопроницаемый материал микрофлюидного устройства 7. Требуемые концентрации газов зависят от типа культивируемых клеток, например: для клеток почки требуется 9,5% кислорода, для клеток мозга - 4,4%.

Газы могут подаваться из баллонов со сжатым газом, в том числе через газовый смеситель. Регулировка подачи может осуществляться как с помощью пропорционального клапана, так и с помощью пилотного электромагнитного клапана. На выходе 5 канала подачи газа 1 может стоять пассивный клапан, препятствующий свободному обмену между каналом подачи газа и атмосферой. Измерение концентраций растворенных газов производится как минимум одним датчиком концентрации газа 11 (или 12, 13), герметично установленным в измерительной ячейке 8. Причем измерительная ячейка 8 не соединена ни с одним из каналов микрофлюидной системы (6 и 1). Возможен вариант выполнения устройства, при котором измерительная ячейка 8 расположена в слое из газопроницаемого материала 7 на участке между ячейкой с клетками 9 и каналом подачи газа 1. Возможен также вариант выполнения устройства, при котором использованы, по крайней мере, две измерительные ячейки 8, одна из которых предназначена для измерения концентрации кислорода, а вторая - углекислого газа, расположенные, например, на равноудаленном расстоянии от ячейки 9. Для датчиков на основе флуоресцентных меток (12, 13) предпочтителен вариант выполнения устройства, при котором измерительная ячейка 8 заполнена контрольной жидкостью, представляющей собой дионизированную воду. Для датчиков на основе электрохимических сенсоров предпочтителен вариант выполнения устройства, при котором измерительная ячейка 8 заполнена контрольной жидкостью, представляющей собой водный раствор солей серебра. На фиг. 4 и 5 показаны варианты размещения датчиков в измерительной ячейке 8. В конструкции на фиг. 5 представлен пример использования оптического датчика, содержащего флюоресцентный чувствительный элемент 12 (например дисковый элемент CD1 фирмы PreSens) и световод 13 с, как минимум, одним волокном накачки и, как минимум, одним волокном регистрации флюоресценции. В качестве оптического датчика может быть использован EOM-CO2-mini или EOM-O2-micro.

Кроме того, возможно использование любых известных из уровня техники датчиков, имеющих соответствующие характеристики (измерение CO₂ или O₂ в диапазоне парциального давления от 0 до 10% с точностью не хуже 0,5% и частотой не менее 0,03 Гц), позволяющих их размещать в микрофлюидных системах, в частности датчиков с твердым электролитом, например Figaro SK-25F; датчиков, представляющих собой электрод второго рода; NDIR датчиков, например SprintIR GC-0017, флуоресцентных датчиков и т.д.

Алгоритм работы заявляемого устройства включает:

- периодическое (не реже 1 раза в минуту) или постоянное измерение значений концентрации газа датчиком 11 (или 12, 13),

- расчет, например с помощью ПИД-регулятора 14, длительности подачи газа на основе суммы сигнала рассогласования, его интеграла и производной с соответствующими коэффициентами,

- подачу газа из источника 17 на вход 4 соответствующего канала 1 в течение рассчитанной длительности.

ПИД-регулирование обеспечивает достаточно высокую точность при управлении процессом автоматического поддержания заданного значения измеряемого параметра - концентрации кислорода и/или углекислого газа, растворенных в культуральной среде, находящейся в ячейке с клетками, который включает расчет необходимого количества газа и времени его подачи, представляет собой устройство, выполненное, как правило, на базе микроконтроллера, располагаемого в цепи обратной связи, и в который поступает информация от датчика концентрации упомянутых газов о текущей концентрации, при этом память микроконтроллера содержит заданные параметры концентрации, которые должны быть в измерительной ячейке.

Пример конкретного выполнения

Заявляемое устройство поддержания концентрации растворенных газов в культуральной среде было апробировано на микрофлюидной системе, изготовленной в газопроницаемом слое полидиметилсилоксана с толщиной 2 мм и размерами 25×75 мм, герметизированной предметным стеклом и отлитой на слое поликарбоната. Каналы 1 и 6 имели высоту 100 мкм и ширину 400 мкм. Канал 1 имел длину 280 мм. В качестве контрольно-измерительного оборудования был использован прибор Presens ЕОМ CO2-mini с датчиками CD1, размещенными в ячейках 9 (для контроля) и 8, расположенных на расстоянии 2 мм. Диаметры ячеек составляли 5,6 мм. Ячейка 8 была заполнена деионизированной водой. Микрофлюидная система имела встроенный насос со средним объемным расходом 5 мкл/мин. В качестве ПИД-регулятора использовался регулятор ЕМСО ESM-4420. В качестве исполнительных механизмов были использованы регулятор давления Festo LRP-1/4-0,7 с установленным давлением 10 кПа и электромагнитный клапан Festo МН-1. Источником газа служил баллон со сжиженным углекислым газом с двухступенчатым редуктором (40 кПа). В качестве значения нормы было установлено значение концентрации, соответствующее 5% CO₂. Коэффициент, связывающий концентрации в измерительной и клеточной ячейках (зависящий в т.ч. от коэффициента диффузии газа в газопроницаемом материале), составил 1,24. Подбор коэффициентов ПИД-регулятора осуществлялся им автоматически по встроенному алгоритму.

Культивируемые в заявляемом устройстве клетки HeLa не показали статистически значимых отличий в показателях жизнеспособности от клеток, культивируемых в CO₂-инкубаторе.

Применение устройства существенно упрощает использование микрофлюидных систем для культивирования клеточных моделей, поскольку позволяет работать с ними вне CO₂-инкубатора без стрессирования клеточных моделей. В частности, становится возможным длительное наблюдение за моделями с помощью стандартных инвертированных микроскопов.

Преимуществами данного устройства являются низкий объем жидкости (культуральной среды) в каналах микрофлюидной системы и отсутствие взаимного влияния датчика и культивируемых клеток.