ПОРТ ВВЕДЕНИЯ ТЕСТИРУЕМОГО ХИМИЧЕСКОГО СОЕДИНЕНИЯ И ОТБОРА ЖИДКОСТИ ИЗ ЯЧЕЙКИ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОЧНЫХ МОДЕЛЕЙ

Изобретение относится к устройствам - микробиореакторам, предназначенным для работы с клетками тканей человека, животных или растений, культурами вирусов и может быть, в частности, использовано для создания клеточных моделей тканей и органов млекопитающих и моделирования межорганных взаимодействий.

Микробиореакторы (микрожидкостные или микрофлюидные устройства, или микрофлюидные чипы) представляют собой биореакторы, предназначенные для культивирования клеток или микроорганизмов в ячейках объемом от нескольких микролитров до нескольких миллилитров. Известны различные варианты конструкций микробиореакторов для культивирования клеток, основным конструктивным элементом которых являются ячейки для культивирования клеток, которые могут быть изолированы друг от друга либо соединены единой системой каналов, по которым осуществляется движение питательной среды. В последнем случае для получения в питательной среде близких к естественным концентраций метаболитов требуется обеспечить замкнутую циркуляцию минимально необходимого количества питательной среды, при этом объем жидкости в каналах сравним с объемом жидкости в ячейках. В зависимости от конструкции микробиореактора ячейки могут быть открыты в окружающую среду микробиореактора, закрыты мембраной или закрыты герметично. Малый объем ячеек может обуславливаться необходимостью воспроизведения трофических характеристик ткани или характерных размеров структурной единицы органа. При изучении моделей органов и тканей и их взаимодействия в микробиореакторе требуется введение в определенные ячейки различных соединений, например лекарственных веществ, и забор проб на анализ. Также замена питательной жидкости может производиться через ячейки. В случае с герметично закрытыми ячейками требуется использовать устройство для ввода и отбора образцов из ячейки для культивирования клеток, позволяющее герметизировать ячейку после размещения в ней клеточной модели, введения или отбора из нее жидкости. При проведении любых операций с микробиореакторами или его ячейками необходимо обеспечить стерильность, отсутствие перепадов давления в ячейке, способных разрушить межклеточные контакты (давления порядка 3,5 кПа), и величины касательных напряжений на поверхности клеток, не превышающие физиологическим значений.

Известно устройство для введения и отбора проб жидкости из культуры клеток (EP 1591517), включающее составные трубку 1 для введения проб жидкости и трубку 2 для отбора проб жидкости, проходящие через отверстия в крышке емкости для культивирования клеток так, что нижние части трубок погружены в емкость для культивирования клеток, а верхние части трубок находятся за пределами емкости для культивирования клеток. Длина трубки 1 для введения пробы жидкости такова, что жидкость вводят в воздушное пространство над поверхностью культуральной среды с возможностью регулировки длины трубки. Трубка для отбора проб жидкости погружена в емкость для культивирования клеток до поверхности дна данной емкости на стыке дна с боковой стенкой и установлена в крышке с возможностью вращения вокруг оси, параллельной оси трубки. Трубка 2 выполнена из тефлона (гибкий химически и биологически инертный материал, обладающий высокими антиадгезивными свойствами, износостойкий, устойчивый к воздействию света, электричества, температуры). Крышка емкости для культивирования клеток завинчивается в горлышко данной емкости, имеющее цилиндрическую форму, расположенное в верхней части боковой стенки емкости для культивирования клеток и ориентированное вверх под углом 10-45° ко дну данной емкости, так что трубки 1 и 2 проходят параллельно продольной оси горлышка, но образуют угол по отношению ко дну емкости. Крышка и горлышко бутылки снабжены метками, относительное положение которых обозначает закрытое или вращательное положение крышки. Места соединения верхних и нижних частей каждой из трубок снабжены элементами, обеспечивающими вращение и перемещение составных элементов трубок вдоль или вокруг своей оси. Крышка дополнительно снабжена фильтром для газообмена с окружающей средой. Длина емкости для культивирования клеток в диапазоне 5-20 см и ширина в диапазоне 5-15 см значительно больше, чем его высота в диапазоне 1,5-6 см.

Недостатком известного устройства является то, что устройство для введения и отбора проб жидкости адаптировано к емкости для культивирования клеток, которая в силу своей конструкции и достаточно больших габаритов непригодна в качестве устройства для введения и отбора проб жидкости для использования в микробиореакторе.

Известно устройство для отбора проб жидкости из культуры клеток биореактора (US 20140087413), расположенное вне биореактора и соединенное с ним с помощью канала, снабженного клапаном для отбора пробы на выходе из биореактора. Устройство включает резервуар переменного объема для проб жидкости, отобранных из биореактора, соединенный с каналом для выпуска отобранной пробы из резервуара, содержащий выпускной клапан; с каналом для поступления в резервуар дезинфицирующей жидкости, снабженным клапаном впуска дезинфицирующей жидкости, и с каналом для поступления газа, снабженным клапаном впуска газа. Устройство позволяет отбирать пробы жидкости из биореактора и осуществлять дезинфекцию ее каналов и резервуара для проб жидкости, а также удалять дезинфицирующую жидкость.

Недостатком устройства является то, что оно не позволяет вводить вещества в биореактор. Другим недостатком является то, что оно не обеспечивает постоянства давления в биореакторе при отборе проб жидкости, поскольку не обеспечивает восполнения отобранного объема жидкости другой жидкостью или газом.

Известно устройство для отбора и введения жидкости в культуру клеток (US 6730510), включающее один или несколько портов, расположенных в крышке биореактора над ячейкой для культивирования клеток, помещенной во внутреннее пространство биореактора. Порты выполнены из мягкой и гибкой силиконовой резины, обладающей способностью самозакрытия в силу свойств материала. Отбор и введение жидкости через данные порты осуществляют с помощью трубок, шприцов или конических наконечников, для чего порт может иметь разрез в виде щели и дополнительную уплотнительную манжету над ним или разрез в виде креста. Порты для отбора и введения проб жидкости расположены таким образом, что их проекции выходят за пределы центральной части ячейки для культивирования клеток, где расположена мембрана для культуры клеток. Такое расположение обеспечивает отбор проб из культуральной среды ячейки, а при введении жидкости она также попадает в культуральную среду, но не в то место на мембране, где расположены клетки, что снижает возможность травмирования клеток.

Недостатком устройства является создание повышенного давления в ячейке, обусловленное деформацией порта при введении трубок, или шприцов, или конических наконечников через порт, особенно в том случае, если в порте отсутствуют разрезы, упрощающие введение. Другим недостатком системы является низкая износоустойчивость порта подобной конструкции. Еще одним недостатком является небольшое давление разгерметизации порта с разрезом или щелью. Еще одним недостатком является возможность контаминации содержимого ячейки как в случае наличия щели и дополнительной уплотнительной манжеты, так и в случае разреза в виде креста, поскольку при введении трубок, шприцов или конических наконечников сложно обеспечить герметичность такого соединения, а в область между дополнительной уплотнительной манжетой и щелью могут попасть объекты, приводящие к контаминации, при том что обработка дезинфицирующими растворами внешних поверхностей порта, а также области между уплотнительной манжетой и щелью может привести к попаданию дезинфицирующего раствора внутрь ячейки за счет капиллярных эффектов в разрезе или щели.

Наиболее близким к заявляемому является устройство для отбора проб жидкости из культуры клеток (EP 2145950 A2), расположенное в крышке биореактора над открытой ячейкой для культивирования клеток, помещенной во внутреннее пространство биореактора, поддерживающего определенные условия инкубирования. Устройство включает трубки для введения и отбора проб жидкости, винтовым соединением прикрепленные к входному и выходному отверстию в крышке биореактора соответственно; трубки расположены вертикально вниз, имеют конусообразное сужение в нижней части и погружены нижним концом в ячейку для культивирования клеток.

Недостатком устройства является то, что оно, сообщаясь с внешней средой за пределами биореактора, не обеспечивает необходимой стерильности, а для его промывки дезинфицирующим раствором необходимо отсоединение от крышки биореактора, поскольку оно постоянно сообщается с ячейкой для культивирования клеток. Кроме того, введение проб жидкости в культуру клеток или забор жидкости непосредственно над клетками может приводить к нарушению межклеточных контактов, обусловленному перепадом давления жидкости и достаточно большой величиной касательного напряжения на поверхности клеток. Другой недостаток устройства заключается в том, что для его промывки и дезинфекции требуется отсоединение от крышки биореактора, что также может привести к нарушению стерильности и затрудняет осуществление многоразового использования.

Задачей и техническим результатом, на решение которой направлено изобретение, является создание порта для введения тестируемого соединения и отбора жидкости из ячейки микробиореактора для культивирования клеточных моделей с герметизацией ячейки для культивирования клеток при обеспечении стерильности при многоразовом вводе и отборе проб жидкости из ячейки для культивирования клеток и минимизации механических воздействий на клетки. Минимизация механических воздействий на клетки обеспечивается в т.ч. за счет отсутствия нагнетания давления или создания разрежения в ячейке при переводе клапана из одного положения в другое (положения «открыто» и «закрыто»), установкой порта в ячейку или извлечения из нее. Стерильность обеспечивается герметичностью ячейки и возможностью дезинфекции сообщающихся с внешней средой каналов, полостей и поверхностей в закрытом положении клапана (порта). Заявляемый порт обеспечивает также приближенное к in vivo соотношение объемов клеточной модели и жидкости в ячейке.

Решение поставленной задачи достигается тем, что порт введения тестируемого химического соединения и отбора жидкости из ячейки для культивирования клеточных моделей выполнен в виде клапана, представляющего собой тело вращения, при этом клапан выполнен из двух деталей - неподвижной и подвижной (с возможностью поворота относительно оси клапана), каждая из которых снабжена двумя сквозными отверстиями, а неподвижная деталь дополнительно снабжена протяженным пазом, выполненным со стороны торцевой поверхности, обращенной к подвижной детали, где неподвижная деталь имеет нижнюю и верхнюю части, при этом нижняя часть выполнена с возможностью герметичного размещения в ячейке, а верхняя часть выполнена с выемкой для размещения и фиксации в ней подвижной детали с возможностью поворота последней относительно оси клапана в положения «открыто» и «закрыто», где в положении «открыто» - сквозные отверстия в подвижной и неподвижной деталях совмещены с образованием двух каналов для введения тестируемого химического соединения и отбора жидкости из ячейки для культивирования клеточных моделей, в положении «закрыто» - сквозные отверстия подвижной детали совмещены с протяженным пазом с образованием канала для промывки сквозных отверстий подвижной детали. Для обеспечения фиксации подвижной детали в верхней части неподвижной детали одна из деталей может быть снабжена пазом, а вторая - сопрягаемым с ним выступом. В одном из вариантов выполнения в поперечном сечении паз имеет прямоугольную форму, выступ - форму усеченного конуса. Клапан может быть дополнительно снабжен элементами герметизации каналов, расположенными в зоне сопряжения подвижной и неподвижной деталей, которые могут быть выполнены в виде слоя из эластичного материала, расположенного в теле неподвижной детали. Для варианта выполнения ячейки микробиореактора цилиндрической формы внешняя боковая поверхность нижней и верхней частей неподвижной детали также имеет цилиндрическую форму меньшего и большего диаметра соответственно. В одном из вариантов выполнения каналы расположены на равноудаленном расстоянии от оси клапана. Каналы выполнены с диаметром d (не менее 1 мм) и расположены на расстоянии друг от друга не менее 2d. Паз в горизонтальном сечении имеет форму фигуры, образованной двумя полуокружностями, соединенными отрезками касательных прямых или концентрическими дугами, при этом расстояние между центрами полуокружностей выполнено равным расстоянию между центрами каналов, а ширина паза выполнена равной диаметру каналов d с величиной погрешности не более 10%. В одном из вариантов расположения каналы и паз имеют расположение в подвижной и неподвижной деталях клапана, обеспечивающее переход из положения «открыто» в положение «закрыто» поворотом подвижной детали на 180°. Для обеспечения герметичности клапан выполнен из термопластов, например из полиэфирэфиркетона или полипропилена, при этом контактирующие поверхности подвижной и неподвижной деталей клапана имеют шероховатость с параметром Ra, характеризующим совокупность неровностей поверхности с относительно малыми шагами на базовой длине не более 0,25 мкм.

Изобретение поясняется чертежами, где на фиг. 1 представлено схематичное изображение заявляемого устройства, вид сбоку, вид сверху при размещении деталей клапана в положении «открыто», на фиг. 2 представлена схема работы заявляемого устройства, где на поз. а показаны подвижная 2 и неподвижная 1 детали клапана (показаны разнесенными, вид сверху) с расположением сквозных отверстий в положении «открыто» - сквозные отверстия в подвижной и неподвижной частях совмещены с образованием двух каналов для введения тестируемого химического соединения и отбора жидкости из ячейки для культивирования клеточных моделей, поз. б представлен вариант расположения отверстий в подвижной и неподвижной частях в положении «закрыто» - сквозные отверстия подвижной части совмещены с протяженным пазом с образованием канала для промывки сквозных отверстий поворотной части.

Позициями на чертежах обозначены:

1 - неподвижная деталь клапана,

2 - подвижная деталь клапана,

3 - ячейка для культивирования клеточных моделей микрофлюидного устройства;

4, 5 - сквозные отверстия (каналы) в подвижной детали клапана,

6 - протяженный паз, выполненный в неподвижной детали,

7, 8 - сквозные отверстия (каналы) в неподвижной детали клапана,

9 - нижняя часть неподвижной детали,

10 - верхняя часть неподвижной детали,

11 - паз в верхней части неподвижной детали для обеспечения фиксации подвижной детали в верхней части неподвижной детали,

12 - выступ у подвижной детали под паз 11 для обеспечения фиксации подвижной детали в верхней части неподвижной детали,

13 - элементы герметизации каналов в зоне сопряжения подвижной и неподвижной деталей (слой из эластичного материала, расположенного в теле неподвижной детали),

14 - ось клапана.

Раскрытие сущности изобретения

Изобретение предназначено для использования в микробиореакторах (микрофлюидных или микрожидкостных устройствам или чипах) для культивирования (или создания) клеточных моделей органов и тканей млекопитающих, содержит объединенные системой микрожидкостных каналов (микроканалов) ячейки для одновременного культивирования клеточных моделей тканей и органов млекопитающих в проточном или замкнутом режимах. Ячейки и каналы выполнены в слое полимерного оптически прозрачного материала - полидиметилсилоксане (ПДМС) и со стороны его нижней поверхности загерметизированы предметным стеклом. Ячейка является одним из основных элементов микробиореактора. Микробиореактор включает по меньшей мере две ячейки 3, предназначенные для размещения и совместного культивирования клеточных моделей. Ячейки и микроканалы заполнены питательной средой. Микроканал, как правило, имеет прямоугольное поперечное сечение, например, высотой 100 мкм и шириной 400 мкм. Питательная среда приводится в движение с помощью насоса, встроенного в конструкцию микроканала. Насос состоит из двух клапанов и рабочей камеры, управляемых пневматически, которые в одном из вариантов выполнения микробиореактора представляют собой гибкие тонкостенные мембраны. Клеточные модели располагаются в ячейке на специальной мембранной вставке. Объем ячейки с мембранной вставкой составляет не более 200 мкл. Возможен вариант, при котором клеточные модели представляют собой сфероиды, размещенные в ячейке без мембранной вставки. Каждая ячейка снабжена портом для введения тестируемого химического соединения и отбора жидкости из ячейки для культивирования клеточных моделей, выполняющим также функцию крышки ячейки. При этом упомянутый порт представляет собой клапан с гидравлическим распределителем, герметично закрывающим ячейку.

Порт (или клапан) (см. фиг. 1, 2) представляет собой тело вращения и выполнен из двух деталей - неподвижной 1 и подвижной 2, имеющих одну ось 14, при этом подвижная деталь 2 размещена на неподвижной 1 с возможностью поворота относительно данной оси 14. Каждая из деталей снабжена двумя сквозными отверстиями: 4, 5 - отверстия (или каналы) подвижной детали, 7, 8 - отверстия (каналы) неподвижной детали клапана. Кроме того, неподвижная деталь 1 дополнительно снабжена протяженным пазом 6, выполненным со стороны торцевой поверхности, обращенной к подвижной детали 2. При этом отверстия 4, 5, 7, 8 расположены параллельно оси клапана 14, а паз 6 - перпендикулярно. Паз 6 в горизонтальном сечении имеет форму фигуры, образованной двумя полуокружностями, соединенными отрезками касательных прямых, при этом расстояние между центрами полуокружностей выполнено равным расстоянию между центрами каналов, а ширина паза выполнена равной диаметру каналов с величиной погрешности не более 10%.

Подвижная деталь выполнена с возможностью поворота относительно оси 14 на 180° и имеет два положения: «открыто» и «закрыто». Расположение упомянутых отверстий в подвижной и неподвижной деталях при размещении неподвижной детали в положении «открыто» должно обеспечивать их совмещение с образованием двух каналов для введения тестируемого химического соединения и отбора жидкости из ячейки для культивирования клеточных моделей, а в положении «закрыто» сквозные отверстия 4 и 5 подвижной детали 2 должны быть совмещены с протяженным пазом 6 с образованием канала для промывки сквозных отверстий подвижной детали. Фиксация подвижной детали в положениях «открыто» и «закрыто» может осуществляться с помощью упоров. При этом возможен вариант, когда соответствующие упоры выполнены на подвижной и неподвижной детали со стороны боковой поверхности в области взаимодействия данных деталей.

Положение подвижной детали «открыто» также используется при установке порта в ячейку или извлечении порта из ячейки, поскольку при установке позволяет вытеснить излишки жидкости через сообщающиеся с ячейкой каналы, избегая нагнетания давления в ячейке, или при извлечении впустить в ячейку воздух, избегая создания разрежения в ячейке, способных разрушить плотные клеточные контакты и оказать негативное воздействие на клетки в ячейке. Положение подвижной детали «закрыто» (обеспечивающее герметизацию ячейки) используется для промывки отверстий 4 и 5 подвижной детали с целью удаления остатков вводимых веществ и промывки от загрязнений (с помощью подачи через канал, образованный отверстием 4, пазом 6 и отверстием 5), способных привести к контаминации ячейки.

В одном из вариантов выполнения заявляемого устройства каналы 4, 5, 7, 8 выполнены с диаметром d=1 мм, расположены на расстоянии друг от друга на расстоянии 3.5 мм и на равноудаленном расстоянии от оси клапана 14. Ячейка имеет внутренний диаметр 5.6 мм и глубину 12 мм.

Герметичное размещение клапана в ячейке, а также элементов клапана в положениях «закрыто» и «открыто» (при совмещении сквозных отверстий 4 и 5 подвижной детали 2 клапана со сквозными отверстиями 7 и 8 неподвижной детали клапана 1) обеспечивается плотным контактом неподвижной детали с верхней торцевой поверхностью ячейки, а также соприкасающихся поверхностей подвижной и неподвижной деталей клапана за счет изготовления деталей с низкой шероховатостью контактирующих поверхностей (Ra 0,25 мкм и ниже), либо из материалов, способных упруго деформироваться и заполнять неровности. В первом случае детали могут быть изготовлены из термопластов, например, полиэфирэфиркетона или полипропилена, а во втором - из различных видов резины, силиконов или фторопластов. Кроме того, клапан может быть снабжен одним или несколькими элементами герметизации каналов, расположенными в зоне сопряжения подвижной и неподвижной деталей (между нижней поверхностью подвижной детали 2 и верхней поверхностью неподвижной детали 1). Элементы герметизации могут быть выполнены в виде слоя из эластичного материала, расположенного в теле неподвижной детали, например, методом двухкомпонентного литья. В качестве эластичного материала может быть использован силикон, при этом слой выполнен толщиной 1 мм и размещен в теле изготовленной из термопласта неподвижной детали в специально выполненной со стороны верхней (торцевой) поверхности профилированной выемке с небольшим (0.1 мм) выступанием в сторону верхней поверхности.

Использование заявляемого порта для введения и отбора проб жидкости из ячейки для культивирования клеток позволяет стерильно осуществлять процедуру введения жидкости в ячейку, в частности замену питательной среды, и процедуру отбора проб жидкости из ячейки. Также обеспечивает отсутствие нагнетания давления или создания разрежения в ячейке при установке и извлечении порта, его герметизации (рабочее положение Б) и разгерметизации (рабочее положение А). Позволяет промыть (рабочее положение Б) в том числе дезинфицирующим раствором отверстия (каналы) подвижной части с целью снижения вероятности контаминации ячейки, с последующей их промывкой для удаления дезинфицирующего раствора. Позволяет легко подсоединять и отсоединять дозирующие устройства. Может использоваться как порт для введения тестируемых химических соединений в питательную среду или для замены питательной среды. В качестве дозирующих устройств могут применяться шприцы, пипетки или автоматизированные устройства со специальными наконечниками.