ШТАММ БАКТЕРИЙ Plantibacter flavus 3Kz - ПРОДУЦЕНТ МЕТИЛЗАВИСИМОЙ САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ PfsI

Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения нового штамма бактерий Plantibacter flavus 3Kz - продуцента метилзависимой сайт-специфической эндонуклеазы PfsI, которая может быть использована для крупноблочного сайт-специфического гидролиза ДНК, содержащей С5-метилцитозиновые основания.

К настоящему времени известно несколько метилзависимых сайт-специфических ДНК-эндонуклеаз (MD-эндонуклеаз), узнающих и расщепляющих ДНК, только при наличии в сайте узнавания 5-метилцитозина.

Известен штамм бактерий Glacial ice bacterium I, продуцирующий эндонуклеазу GlaI, которая узнает и расщепляет метилированную нуклеотидную последовательность , где 5mC - 5-метилцитозин, R - означает пурин, a Y - пиримидин [1, 2].

Известны штаммы бактерий Bacillus simplex 23 [3], Bacillus subtilis 230 [4] и Glacial ice bacterium 24 [5], продуцирующие сайт-специфические эндонуклеазы BlsI, BisI и Glul, соответственно, которые узнают и расщепляют метилированную нуклеотидную последовательность , при наличии в ней от двух до четырех 5-метилцитозиновых оснований.

Недостатком вышеперечисленных штаммов является то, что продуцируемые ими MD-эндонуклеазы не способны узнавать и расщеплять обе цепи нуклеотидной последовательности ДНК только с семью или восемью 5-метилцитозинами. Наиболее близким к заявляемому штамму - прототипом, является штамм бактерии Microbacterium testaceum 17В, продуцирующий метилзависимую сайт-специфическую эндонуклеазу MteI, которая узнает метилированную последовательность нуклеотидов и расщепляет ее перед центральным нуклеотидом с образованием однонуклеотидного 5′-выступающего конца при условии С5-метилирования в ней от пяти до восьми цитозинов [6].

Недостатком известного штамма является то, что продуцируемая им сайт-специфическая эндонуклеаза расщепляет узнаваемую последовательность, в которой метилированы пять или шесть цитозинов, что в ряде случаев не позволяет использовать ее для получения крупных фрагментов при сайт-специфическом расщеплении ДНК, содержащей С5-метилцитозиновые основания.

В настоящее время не описаны штаммы бактерий, являющиеся продуцентами метилзависимых сайт-специфических ДНК-эндонуклеаз, узнающих и расщепляющих только гиперметилированные последовательности ДНК при наличии в них не менее семи С5-метилцитозинов.

Задачей изобретения является получение бактериального штамма, продуцирующего метилзависимую сайт-специфическую ДНК-эндонуклеазу, которая узнает и расщепляет обе цепи гиперметилированной последовательности только при наличии в ней не менее семи 5-метилцитозиновых оснований.

Поставленная задача решается путем получения штамма Plantibacter flavus 3Kz - продуцента метилзависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазы, узнающей и расщепляющей следующие метилированные последовательности нуклеотидов:

где 5mC - 5-метилцитозин (знаком «^» указаны позиции расщепления ДНК).

Техническим результатом изобретения является получение бактериального штамма, являющегося продуцентом метилзависимой сайт-специфической ДНК-эндонуклеазы с новой, не имеющей аналогов, сайт-специфичностью.

Предлагаемый штамм выделен из природного сырья (микрофлоры поверхности опавших листьев) в результате целенаправленного систематического поиска. Полученный штамм Plantibacter flavus 3Kz депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ГосНИИГенетика) под регистрационным номером ВКПМ В-12248, а продуцируемая им сайт-специфическая эндонуклеаза названа PfsI.

Штамм Plantibacter flavus 3Kz характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки. На агаризованной среде Луриа-Бертрани (LB) образует коричневато-желтые, гладкие, блестящие, полупрозрачные, выпуклые, круглые колонии 1-2 мм в диаметре. В жидкой питательной среде со встряхиванием образует гомогенную муть. Клетки неподвижные, палочковидные, размером 0,3-0,4 мкм в диаметре и 0,5-1,2 мкм в длину. Спор не образуют. Грамположительные. Массовая доля G/C-нуклеотидов составляет 68-70%.

Физиолого-биохимические признаки. Облигатно аэробные. Каталазоположительные. Оксидазоотрицательные. Растут при температуре от 4 до 37°C с температурным оптимумом роста 28°C, при pH от 6 до 9.

Штамм идентифицирован на основе анализа морфологических и биохимических свойств по определителю [7], а также с помощью анализа первичной структуры фрагмента гена 16S рРНК по программе BLAST [8] как вид бактерии Plantibacter flavus. Продуцируемая заявляемым штаммом сайт-специфическая метилзависимая эндонуклеаза PfsI названа согласно номенклатуре [9].

Хранение штамма осуществляется в лиофильно высушенном состоянии или в пробирках «Eppendorf» с 22% глицерином, 0,5% желатиной, 20 мМ Трис-HCl (pH 8,1), 60 мМ NaCl, 15 мМ MgCl₂, 1 мМ CaCl₂ при -50°C.

Для культивирования штамма используют питательную среду следующего состава (г/л): триптон - 10, дрожжевой экстракт - 5, NaCl - 5, рН 7,5. Культивирование осуществляют при 30°C с аэрацией до достижения стационарной стадии роста.

Полученная сайт-специфическая MD-эндонуклеаза PfsI характеризуется следующими свойствами:

1. Узнает и расщепляет в ДНК последовательность нуклеотидов , в которой С5-метилированы не менее семи цитозинов.

2. Расщепляет межнуклеотидные связи перед центральным нуклеотидом N в обеих цепях узнаваемой последовательности.

3. Не расщепляет вышеприведенную последовательность, не содержащую С5-метилцитозиновых оснований или содержащую менее семи метилированных цитозинов.

4. Оптимальная температура действия фермента 37°C.

5. Оптимальное значение рН для действия фермента 7,7-9,0.

6. Для проявления активности PfsI требуются ионы Mg²⁺, оптимальная концентрация - 5-10 мМ.

Определяющим отличием предлагаемого штамма от всех известных в настоящее время штаммов-продуцентов метилзависимых сайт-специфических ДНК-эндонуклеаз является то, что данный штамм продуцирует сайт-специфическую эндонуклеазу, которая узнает и расщепляет обе цепи метилированной нуклеотидной последовательности ДНК только при наличии в ней не менее семи 5-метилцитозинов.

Таким образом, метилзависимая сайт-специфическая эндонуклеаза PfsI представляет собой новый, не имеющий аналогов фермент, который может быть использован для выявления и анализа С5-метилированной ДНК.

Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и для выделения сайт-специфической эндонуклеазы, узнающей и расщепляющей вышеназванную последовательность нуклеотидов в указанной позиции, никогда не использовался, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения «новизна» и «изобретательский уровень».

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Выращивание штамма и выделение фермента

Для получения колоний штамм высевают на агаризованную среду LB в чашку Петри и выращивают в течение 48 часов при 22-25°C. Для ферментации штамм выращивают при встряхивании в 0,5-литровых колбах, содержащих по 300 мл среды (1% триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 0,5% NaCl, рН 7,5) при 120-140 об/мин в течение 20 часов при 30°C. Клетки осаждают на центрифуге J2-21 («Beckman», США) в роторе JA-10 при 8000 об/мин и хранят при -20°C. С 1 л среды получают 6-8 г биомассы.

Дезинтеграцию клеток, выделение и очистку фермента проводят с использованием модификации известной методики [10]. Фермент хранится при -20°C в буфере, содержащем 10 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 0,2 М NaCl, 0,1 мМ ЭДТА, 0,08% Тритон Х-100, 7 мМ 2-меркаптоэтанол, 50% глицерин.

За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК плазмиды pHspAI10, дополнительно метилированной метилазой Fsp4HI и линеаризованной эндонуклеазой рестрикции DriI, в течение 1 часа при температуре 37°C в 20 мкл реакционной смеси. Выход фермента составляет 1500 ед./г сырой биомассы, концентрация 2000 ед./мл.

Пример 2. Сайт-специфический гидролиз плазмидных ДНК, С5-метилированных метилазами HspAI и Fsp4HI

Расщепление ДНК проводят в оптимальных условиях (37°C, реакционный буфер - 33 мМ Трис-ацетат, рН 7,9 (при 25°C), 10 мМ MgCl₂, 66 мМ калия ацетат, 1 мМ дитиотреитол) в течение 60 мин. Продукты расщепления плазмидной ДНК разделяют путем электрофореза в 1% агарозном геле в буфере ТАЕ, содержащем 0,04 М Трис-HCl (рН 8,4 при 25°C), 0,02 М уксусной кислоты, 1 мМ ЭДТА.

В качестве субстратов для выявления специфичности фермента используют различные метилированные и неметилировнные плазмидные и фаговые ДНК: фагов лямбда и Т7 (контрольные ДНК, которые не расщепляются PfsI вследствие отсутствия метилированных сайтов узнавания). Для подтверждения возможности сайт-специфического расщепления последовательности с различными узорами метилирования используют следующий набор сконструированных плазмид, содержащих ген метилазы HspAI, метилирующей первый цитозин в положении С5 на обеих цепях последовательности [6]:

1. Плазмида pHspAI4 имеет единственный гиперметилированный сайт:

то есть последовательность с четырьмя 5-метилцитозинами.

2. Плазмида pHspAI10 имеет единственный гиперметилированный сайт:

то есть последовательностьс шестью 5-метилцитозинами.

3. Плазмида pHspAI12 имеет единственный гиперметилированный сайт:

то есть последовательность с пятью 5-мети лцитозинами.

Кроме того, для анализа использовались эти же три плазмиды, pHspAI4, pHspAI10 и pHspAI12, но предварительно метилированные метилазой Fsp4HI по сайту , в результате чего в уникальных последовательностях этих плазмид дополнительно метилировались цитозины перед центральным нуклеотидом на обеих цепях. Таким образом, в последовательностях этих гиперметилированных плазмид к уже имеющимся 5-метилцитозиновым остаткам добавилось еще по два модифицированных остатка.

Для оценки возможности гидролиза MD-эндонуклеазой PfsI метилированного внутреннего сайта в зависимости от типа центрального и фланкирующих внутреннюю последовательность нуклеотидов также использовали плазмиды, содержащие ген метилтрансферазы Fsp4HI [5, 6], метилирующей первый цитозин в последовательности :

1. Плазмида pFsp4HI3 имеет единственный гиперметилированный сайт:

Таким образом, в плазмиде pFsp4HI3 есть единственная метилированная последовательность (подчеркнута), в которой все четыре цитозина метилированы, в качестве центрального нуклеотида выступает G/C-пара, и данная последовательность фланкирована с 5′-конца нуклеотидом С, а с 3′-конца - нуклеотидом А.

2. Плазмида pFsp4HI4 имеет единственный гиперметилированный сайт:

Следовательно, в плазмиде pFsp4HI4 есть единственная метилированная последовательность (подчеркнута), в которой все четыре цитозина метилированы, в качестве центрального нуклеотида N выступает А/Т-пара, и данная последовательность фланкирована с 5′-конца и с 3′-конца - нуклеотидами С.

3. Плазмида pFsp4HI6 имеет единственный гиперметилированный сайт:

Таким образом, в плазмиде pFsp4HI6 есть единственная метилированная последовательность (подчеркнута), в которой все четыре цитозина метилированы, в качестве центрального нуклеотида N выступает А/Т-пара, и данная последовательность фланкирована с 5′-конца и с 3′-конца - нуклеотидами С.

4. pFsp4HI8 имеет единственный гиперметилированный сайт:

Следовательно, в плазмиде pFsp4HI8 есть единственная метилированная последовательность (подчеркнута), в которой все четыре цитозина метилированы, в качестве центрального нуклеотида выступает А/Т-пара, и данная последовательность фланкирована с 5′-конца нуклеотидом Т, а с 3′-конца - нуклеотидом А.

Все плазмиды предварительно переведены из кольцевой в линейную форму с помощью расщепления эндонуклеазой рестрикции DriI.

На фиг. 1 представлена электрофореграмма продуктов расщепления вышеназванных ДНК плазмид, метилированных метилазами HspAI и Fsp4HI.

Описание дорожек на электрофореграмме, изображенной на фиг. 1: 1 - pHspAI4/DriI; 2 - pHspAI4/DriI+MteI; 3 - pHspAI4/DriI+PfsI; 4 - pHspAI10/DriI; 5 - pHspAI10/DriI+MteI; 6 - pHspAI10/DriI+PfsI; 7 - pHspAI12/DriI; 8 - pHspAI12/DriI+MteI; 9 - pHspAI12/DriI+PfsI; 10 - маркер молекулярного веса ДНК 1 kb; 11 - pHspAI4/DriI+M.Fsp4HI; 12 - _PHspAI4/DriI+M.Fsp4HI+MteI; 13 - pHspAI4/DriI+M.Fsp4HI+PfsI; 14 - pHspAI10/DriI+M.Fsp4HI; 15 - pHspAI10/DriI+M.Fsp4HI+MteI; 16 - pHspAI10/DriI+M.Fsp4HI+PfsI; 17 - pHspAI12/DriI+M.Fsp4HI; 18 - pHspAI12/DriI+M.Fsp4HI+MteI; 19 - pHspAI12/DriI+M.Fsp4HI+PfsI; 20 - pFsp4HI2/DriI; 21 - pFsp4HI2/DriI+PfsI; 22 - pFsp4HI3/DriI; 23 - pFsp4HI3/DriI+PfsI; 24 - pFsp4HI4/DriI; 25 - pFsp4HI4/DriI+PfsI; 26 - маркер молекулярного веса ДНК 1 kb; 27 - pFsp4HI6/DriI; 28 - pFsp4HI6/DriI+PfsI; 29 - pFsp4HI8/DriI; 30 - pFsp4HI8/DriI+PfsI.

Как видно из фиг. 1, MD-эндонуклеаза PfsI, подобно MteI, не расщепляет плазмиду, метилированую метилазой HspAI, в которой в последовательности имеется только четыре 5-метилцитозиновых остатка (pHspAI4, дор. 3). Однако, в отличие от MteI, новый фермент (PfsI) также не расщепляет плазмиды, в которых в последовательности присутствует только пять (pHspAI12, дор. 9) или шесть 5-метилцитозиновых остатков (pHspAI10, дор. 6 и pHspAI4, дополнительно метилированная метилазой Fsp4HI, дор. 13).

MD-эндонуклеаза PfsI расщепляет гиперметилированную последовательность лишь в случае, если она содержит семь 5-метилцитозиновых остатков (pHspAI10, дополнительно метилированная метилазой Fsp4HI, дор. 16 и pHspAI12, дополнительно метилированная метилазой Fsp4HI, дор. 19).

Более наглядно эти данные представлены в таблице 1.

Из фиг. 1 также видно, что MD-эндонуклеаза PfsI не расщепляет ДНК плазмид pFsp4HI3, pFsp4HI4, pFsp4HI6 и pFsp4HI8, модифицированных метилазой Fsp4HI, с различными вариантами фланкирования сайта , в котором все четыре цитозина метилированы в положении С5, независимо от того, G/C- или А/Т-парой в ней представлен центральный нуклеотид N, и независимо от типа фланкирования внутренней последовательности с 3′- и с 5′-концов. Эти факты говорят о том, что для гидролиза PfsI недостаточно только внутренней метилированной последовательности , даже при модификации всех цитозинов в ней. Однако данная последовательность является частью сайта узнавания PfsI - .

Пример 3. Определение позиции гидролиза MD-эндонуклеазой PfsI

Для подтверждения правильности определения узнаваемой последовательности и определения позиции гидролиза ДНК в сайте узнавания проводили гидролиз синтетических олигонуклеотидных дуплексов, образованных из олигонуклеотидов следующей структуры:

Mte1:

Mte2:

На фиг. 2 изображен радиоавтограф электрофореграммы продуктов расщепления дезоксирибоолигонуклеотидного радиоактивно-меченого дуплекса MteI/Mte2 в 20% полиакриламидном геле, содержащем 7 М мочевину. Описание дорожек на электрофореграмме, изображенной на фиг. 2:

1 - исходный дуплекс MteI*/Mte2;

2 - дуплекс MteI*/Mte2, обработанный MteI;

3 - дуплекс MteI*/Mte2, обработанный экзонуклеазой III из E. coli;

4 - дуплекс MteI*/Mte2, обработанный PfsI.

Олигонуклеотиды, меченные радиоактивным фосфором P³² по 5′-концу, обозначены знаком *.

Из фиг. 2 видно, что электрофоретичекие подвижности фрагментов ДНК, образованные при обработке дуплексов MteI и PfsI, совпадают.

Таким образом, оба фермента имеют одинаковые позиции гидролиза относительно сайта узнавания . Этот факт означает, что MD-эндонуклеаза PfsI расщепляет обе цепи последовательности узнавания перед центральным нуклеотидом N, так же как и MteI, с образованием однонуклеотидных 5′-выступающих концов: .

Использование предлагаемого изобретения позволит расширить ассортимент штаммов-продуцентов, позволяющих получать новую метилзависимую сайт-специфическую эндонуклеазу PfsI, узнающую и расщепляющую обе цепи нуклеотидной последовательности ДНК , при условия С5-метилирования в ней не менее чем семи цитозиновых остатков. Данная сайт-специфическая эндонуклеаза может быть использована в молекулярной биологии, биотехнологии и генной инженерии для сайт-специфического расщепления метилированной ДНК, в частности для выявления и анализа метилированной хромосомной ДНК млекопитающих и человека.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Чернухин В.А., Наякшина Т.Н., Абдурашитов М.А., Томилова Ю.Э., Мезенцева Н.В., Дедков B.C., Михненкова Н.А., Гончар Д.А., Дегтярев С.Х. // Новая эндонуклеаза рестрикции GlaI узнает метилированную последовательность // Биотехнология. - 2006. - 4. - С. 31-35.

2. G.V. Tarasova, Т.N. Nayakshina, S.Kh. Degtyarev. Substrate specificity of new methyl-directed DNA endonuclease GlaI // BMC Molecular Biology 2008, 9: 7.

3. Чернухин B.A., Томилова Ю.Э., Чмуж E.B., Соколова О.О., Дедков B.C., Дегтярев С.Х. Сайт-специфическая эндонуклеаза BlsI узнает последовательности ДНК и расщепляет ее с образованием 3′-выступающих концов // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. - 2007. - Т. 3. - 1. - С. 28-33.

4. Чмуж Е.В., Каширина Ю.Г., Томилова Ю.Э., Мезенцева Н.В., Дедков B.C., Гончар Д.А., Абдурашитов М.А., Дегтярев С.Х. Новая эндонуклеаза рестрикции BisI из Bacillus subtilis T30 узнает метилированную последовательность ДНК // Биотехнология. - 2005. - 3. - C. 22-26.

5. Чернухин В.А., Чмуж Е.В., Томилова Ю.Э., Наякшина Т.Н., Гончар Д.А., Дедков B.C., Дегтярев С.Х. Новая сайт-специфическая эндонклеаза Glul узнает метилированную последовательность ДНК // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. - 2007. - Т. 3. - 2. - С. 13-17.

6. Чернухин В.А., Гончар Д.А., Килева Е.В., Соколова В.А., Голикова Л.Н., Дедков B.C., Михненкова Н.А., Дегтярев С.Х. Новая метилзависимая сайт-специфическая ДНК-эндонуклеаза MteI расщепляет девятинуклеотидную последовательность // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. - 2012. - Т. 8. - №1. - С. 16-26.

7. Определитель бактерий Берджи / Под ред. Дж. Хоулта и др.: (9-е издание в 2 томах: Пер. с англ. под ред. акад. РАН Г.А. Заварзина. - М., 1997.

8. Madden T.L., Tatusov R.L. & Zhang J. Applications of network BLAST server. // Meth. Enzymol - 1996. - V. 266. - P. 131-141.

9. Smith H.O., Nathans D. A suggested nomenclature for bacterial host modification and restriction systems and their enzymes // J. Mol. Biol. - 1973. - Vol. 81. - P. 419-423.

10. Bickle T.A., Pirrotta V. and Imber R. A simple, general procedure for purifying restriction endonucleases // Nucleic Acids Res. - 1977. - V. 4. - P. 561-2572.