ШТАММ БАКТЕРИЙ Microbacterium testaceum 17B - ПРОДУЦЕНТ САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ MteI

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения нового штамма, используемого для выделения новой сайт-специфической эндонуклеазы, узнающей и расщепляющей ДНК, только при наличии в сайте узнавания 5-метилцитозина.

К настоящему времени известны несколько сайт-специфических эндонуклеаз, узнающих и расщепляющих ДНК, только при наличии в сайте узнавания 5-метилцитозина.

Известен штамм Glacial ice bacterium I, продуцирующий эндонуклеазу GlaI, которая узнает и расщепляет метилированную нуклеотидную последовательность 5′-G(m5C)^GC-3′, где m5C - С5-метилцитозин [1].

Известны штаммы Bacillus simplex 23 [2] и Bacillus subtilis Т30 [3], продуцирующие сайт-специфические эндонуклеазы, которые узнают и расщепляют метилированную нуклеотидную последовательность 5′-GCNGC-3′, при наличии в сайте узнавания С5-метилцитозиновых оснований.

Однако в настоящее время не описаны штаммы бактерий, являющиеся продуцентами сайт-специфических эндонуклеаз, узнающих и расщепляющих метилированную последовательность ДНК 5′-G(m5C)G(m5C)NG(m5C)G(m5C)-3′/3′-(m5C)G(m5C)GN(m5C)G(m5C)G-5′ и не расщепляющих метилированную последовательность ДНК 5′-G(mSC)^∧NG(m5C)-3′/3′(m5C)GN^∧(m5C)G-5′.

Наиболее близким к заявляемому штамму - прототипом, является штамм Glacial ice bacterium 24, продуцирующий эндонуклеазу рестрикции GluI, которая узнает последовательность нуклеотидов 5′-GCNGC-3′ и расщепляет ее перед центральным нуклеотидом (N) с образованием однонуклеотидного 5′-выступающего конца, если все цитозиновые основания узнаваемой последовательности метилированы в положении 5 (С5-метилцитозин) [4].

Недостатком известного штамма является то, что продуцируемая им сайт-специфическая эндонуклеаза расщепляет короткую метилированную последовательность 5′-G(m5C)^∧NG(m5C)-3′/3′(m5C)GN(m5C)G-5′, что в ряде случаев не позволяет использовать ее для получения крупных фрагментов при сайт-специфическом расщеплении ДНК, содержащей С5-метилцитозиновые основания.

Технической задачей изобретения является получение бактериального штамма, продуцирующего сайт-специфическую эндонуклеазу, которая узнает и расщепляет обе цепи нуклеотидной последовательности ДНК 5'-G(m5C)G(m5C)^NG(m5C)G(m5C)-3'.

Поставленная техническая задача достигается получением штамма Microbacterium testaceum 17В - продуцента сайт-специфической эндонуклеазы, узнающей и расщепляющей метилированную последовательность нуклеотидов:

5′-G(m5C)G(m5C)^∧G(m5C)G(m5C)-3′,

3′-(m5C)G(m5C)GN^∧(m5C)G(m5C)G-5′,

где m5C - С5-метилцитозин. (Символом "^∧" указаны позиции расщепления ДНК.)

Предлагаемый штамм выделен из природного материала (почвы) в результате целенаправленного систематического поиска.

Полученный штамм Microbacterium testaceum 17B депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИгенетика под регистрационным номером ВКПМ В-10628, а продуцируемая им сайт-специфическая эндонуклеаза названа MteI.

Штамм Microbacterium testaceum 17B характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки. На агаризованной среде Луриа-Бертрани (ЛБ) образует гладкие, блестящие, бледно-оранжевые колонии. Клетки палочковидные размером 0,8×(1,5-2) мкм, неподвижные. Грамположительные. Физиолого-биохимические признаки. Облигатно аэробные. Каталазоположительные. Оксидаза не обнаружена. Растут при температуре от 10 до 40°С, при рН от 6 до 9.

Штамм идентифицирован на основе анализа морфологических и биохимических свойств по определителю [5]. Продуцируемая заявляемым штаммом сайт-специфическая эндонуклеаза MteI названа по номенклатуре [6].

Хранение штамма осуществляется в лиофильно высушенном состоянии или в растворе 30% глицерина при температуре -60°С.

Для культивирования штамма применяют среду следующего состава (г/л): пептон - 10, дрожжевой экстракт - 5, NaCl - 5. Культивирование проводят при 28°С с аэрацией до достижения стационарной стадии роста. Выход целевого фермента составляет 100 ед./г сырой биомассы с концентрацией 16000 ед./мл.

Полученная сайт-специфическая эндонуклеаза MteI характеризуется следующими свойствами:

1. Узнает и расщепляет метилированную последовательность нуклеотидов 5′-G(m5C)G(m5C)NG(m5C)G(m5C)-3′/3′-(m5C)G(m5C)GN(m5C)G(m5C)G-5′, где m5C - 5-метилцитозин.

2. Не расщепляет вышеприведенную последовательность, не содержащую С5-метилцитозиновых оснований (неметилированную), а также короткую метилированную последовательность 5′-G(m5C)^∧NG(m5C)-3′/3′(m5C)GN(m5C)G-5′.

3. Расщепляет связи перед центральным нуклеотидом в обеих цепях узнаваемой последовательности.

4. Оптимальная температура действия 37-45°С.

5. Оптимальное значение рН для действия фермента 7,5-8,5.

6. Оптимальная концентрация соли при расщеплении ДНК 30-70 мМ NaCl.

7. Для проявления активности MteI требуются ионы Mg²⁺, оптимальная концентрация - 3-10 мМ.

Определяющим отличием предлагаемого штамма от штамма-продуцента сайт-специфической эндонуклеазы GluI является то, что первый продуцирует сайт-специфическую эндонуклеазу, которая узнает и расщепляет обе цепи метилированной нуклеотидной последовательности ДНК 5′-GCGC^∧N GCGC-3′ и не расщепляет метилированную последовательность ДНК 5′-G(m5C)^∧NG(m5C)-3′/3′(m5C)GN(m5C)G-5′. Сайт узнавания GluI 5′-GCNGC-3′ является частью сайта узнавания MteI (5′-GCGCNGCGC-3′). Данное отличие от GluI позволяет использовать эндонуклеазу MteI для более крупноблочной фрагментации С5-метилированной ДНК. Таким образом, сайт-специфическая эндонуклеаза MteI представляет собой новый, не имеющий аналогов фермент.

Поскольку предлагаемый штамм получен впервые и для выделения сайт-специфической эндонуклеазы, узнающей и расщепляющей вышеназванную последовательность нуклеотидов в указанной позиции никогда не использовался, можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения «новизна» и «изобретательский уровень».

Изобретение иллюстрируется примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Выращивание штамма и выделение фермента

Для получения биомассы клетки штамма-продуцента переносят на агаризованную среду ЛБ в чашку Петри и инкубируют в течение ночи при 28°С. Свежевыращенные колонии переносят стерильной бактериологической петлей в колбы, содержащие жидкую питательную среду ЛБ, и культивируют на качалках при 28°С при перемешивании - 150 об/мин, до достижения стационарной фазы роста. Клетки осаждают центрифугированием при 5000 об/мин при 4°С. Выход биомассы составляет 5 г/л среды. Дезинтеграцию клеток, выделение и очистку фермента проводят по известной методике [7].

Пример 2. Сайт-специфический гидролиз С5-метилированной плазмидной ДНК эндонуклеазой MteI

Расщепление ДНК проводили в оптимальных условиях (45°С, реакционный буфер - 10 мМ TrisHCl, рН 8.0, 5 мМ MgCl₂, 50 мМ NaCl, 1 мМ DTT) в течение 60 мин. Продукты расщепления плазмидной ДНК разделяли путем электрофореза в 1% агарозном геле.

В качестве субстратов для выявления специфичности расщепления использовали различные метилированные и неметилировнные плазмидные и фаговые ДНК: фагов лямбда (λ) и Т7, pHspAI (содержит метилированные последовательности 5′-G(5mC)GC-3′/3′-CG(5mC)G-5′ [1]) и pFsp4HI3 (содержит метилированные последовательности 5′-G(5mC)NGC-3′/3′-(5mC)GNCG-5′ [4]) и предварительно полученные плазмиды pBstMW1 и pBstMW2 (последние две содержат метилированные последовательности 5′-G(5mC)NNNNNNNGC3′/3′-CGNNNNNNN(5mC)G-5′.

Плазмида pBstMW1 была получена путем клонирования фрагментов геномной ДНК штамма бактрерии Bacillus stearothermophilus MW, продуцирующего метилазу BstMW, которая метилирует первый цитозин в обеих цепях сайта узнавания с образованием метилированной последовательности 5′-G(5mC)NNNNNNNGC3′/3′-CGNNNNNNN(5mC)G-5′.

Клонируемый фрагмент был получен путем гидролиза геномной ДНК эндонуклеазой рестрикции XmaI и последующим встраиванием в вектор pUC19 по сайту узнавания XmaI. Вставка имеет длину 4000 т.п.н. и содержит ген метилазы BstMWI.

Плазмида pBstMW2 была получена из плазмиды pBstMW1 путем встраивания по сайтам узнавания рестриктаз Sfr274 и SphI олигонуклеотидного дуплекса, образованного из следующих нуклеотидов:

В17-1: 5′-TCGAGCGCAGCGCGCGCAGCGCGCGCAGCGCCATG-3′,

В17-2: 5′-GCGCTGCGCGCGCTGCGCGCGCTGCGC-3′.

Таким образом, плазмида pBstMW2 в отличие от плазмиды pBstMW1 имеет метилированную метилазой BstMWI последовательность, содержащую единственный сайт узнавания MteI (узнаваемая последовательность выделена рамочкой):

На фиг.1 представлена электрофореграмма продуктов, образованных в результате обработки ДНК плазмид pHspAI и pFsp4HI3 и pBstMW эндонуклеазой MteI.

Описание дорожек на электрофореграмме, изображенной на фиг.1:

1 - ДНК фага λ;

2 - ДНК фага λ, обработанная эндонуклеазой MteI;

3 - ДНК фага Т7;

4 - ДНК фага Т7, обработанная эндонуклеазой MteI;

5 - ДНК плазмиды pHspAI;

6 - ДНК плазмиды pHspAI, обработанная эндонуклеазой MteI;

7 - маркер молекулярного веса ДНК 1 kb (производство НПО СибЭнзим);

8 - ДНК плазмиды pFsp4HI3, линеаризованная эндонуклеазой рестрикции DriI;

9 - ДНК плазмиды pFsp4HI3, линеаризованная эндонуклеазой рестрикции DriI, обработанная эндонуклеазой GluI;

10 - ДНК плазмиды pFsp4HI3, линеаризованная эндонуклеазой рестрикции DriI, обработанная эндонуклеазой MteI;

11 - ДНК плазмиды pBstMW1, линеаризованная эндонуклеазой рестрикции DriI;

12 - ДНК плазмиды pBstMW1, линеаризованная эндонуклеазой рестрикции DriI, обработанная эндонуклеазой GluI;

13 - ДНК плазмиды pBstMW1, линеаризованная эндонуклеазой рестрикции DriI, обработанная эндонуклеазой MteI;

14 - ДНК плазмиды pBstMW2, линеаризованная эндонуклеазой рестрикции DriI;

15 - ДНК плазмиды pBstMW2, линеаризованная эндонуклеазой рестрикции DriI, обработанная эндонуклеазой GluI;

16 - ДНК плазмиды pBstMW2, линеаризованная эндонуклеазой рестрикции DriI, обработанная эндонуклеазой MteI.

Как видно из фиг.1, эндонуклеаза MteI не расщепляет плазмид pFsp4HI3, pBstMW1 и pHspAI, в которых отсутствует метилированная последовательность 5′-G(m5C)G(m5C)^∧NG(m5C)G(m5C)-3′/5′-(m5C)G(m5C)^∧GN(m5C)G(m5C)G-3′.

В отличие от MteI эндонуклеаза GluI расщепляет pFsp4HI3 по единственному сайту 5′-G(m5C)^∧NG(m5C)-3′/3′-(m5C)GN^∧(m5C)G-5′.

ДНК плазмиды pBstMW1 длиной 4969 п.н., линеаризованную рестриктазой DriI, данный фермент расщепляет в единственном месте. Электрофоретическая подвижность образуемых в результате данного расщепления фрагментов ДНК соответствует теоретически рассчитанным для гидролиза по последовательности 5′-W(5mC)GNNNNNNN(5mC)GW-3′/5′-W(5mC)GNNNNNNN(5mC)GW-3′: 1260 п.н. и 3709 п.н.

Пример 3. Определение позиции гидролиза ДНК рестриктазой MteI на олигонуклеотидных дуплексах

Определение места гидролиза ДНК рестриктазой MteI осуществляли путем сравнения длин фрагментов, образуемых при расщеплении эндонуклеазами рестрикции MteI и GluI олигонуклеотидного дуплекса MteI/Mte2, образованного из олигонуклеотидов MteI и Mte2:

MteI: 5′GCGGGATATG(m5C)G(m5C)^∧N G(m5C)G(m5C)GCCAGTCA 3′,

Mte2: 5′TGACTGGG(m5C)G(m5C)^∧N G(m5C)G(m5C)GATATCCCGC 3'.

В качестве маркера длин фрагментов использовали продукты частичного расщепления этих же дуплексов экзонуклеазой ЕхоIII. Последовательности олигонуклеотидов, использованных для определения позиции гидролиза MteI, приведены в таблице.

На фиг.2 изображен радиоавтограф электрофореграммы продуктов расщепления дезоксирибоолигонуклеотидного радиоактивно меченного дуплекса MteI/Mte2 в 20% полиакриламидном геле, содержащем 7-молярную мочевину. Описание дорожек на электрофореграмме, изображенной на фиг.2:

1 - исходный дуплекс MteI*/Mte2;

2 - дуплекс MteI*/Mte2, обработанный эндонуклеазой GluI;

3 - дуплекс MteI*/Mte2, обработанный экзонуклеазой III из E.coli;

4 - дуплекс MteI*/Mte2, обработанный эндонуклеазой MteI;

5 - исходный дуплекс Mte2*/Mte;

6 - дуплекс Mte2*/Mte обработанный эндонуклеазой GluI;

7 - дуплекс Mte2*/Mte обработанный экзонуклеазой III из E.coli;

8 - дуплекс Mte2*/Mte, обработанный эндонуклеазой MteI.

Олигонуклеотиды, меченные радиоактивным фосфором ³²Р по 5′-концу, обозначены знаком *.

Из фиг.2 видно, что продукты гидролиза ДНК дуплекса MteI*/Mte2 на дорожках 2 и 4, а также дуплекса Mte2*/MteI на дорожках 6 и 8 имеют одинаковые длины. Это означает, что позиции гидролиза ферментами GluI и MteI совпадают.

На основе полученных результатов можно сделать вывод, что в вырожденной палиндромной последовательности эндонуклеаза MteI расщепляет ДНК перед центральным нуклеотидом N: 5′-G(m5C)G(m5C)^∧NG(m5C)G(m5C)-3′, где m5C - 5-метилцитозин.

Выход сайт-специфической эндонуклеазы MteI определяют по электрофоретической картине расщепления ДНК олигонуклеотидов MteI*/Mte2. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 пмоль олигонуклеотидного дуплекса MteI*/Mte2 за 1 час при температуре 37°С в объеме реакционной смеси 20 мкл. Выход фермента составляет 200 ед./г сырой биомассы, концентрация 16000 ед./мл.

Фермент хранится при -20°С в буфере, содержащем 50% глицерин, 0,08% тритон XI00, 0,2 М NaCl, 10 мМ трисНСl (рН 7,5), 7 мМ β-меркаптоэтанол, 0,1 мМ ЭДТА.

Таким образом, получен новый штамм, продуцирующий сайт-специфическую эндонуклеазу MteI, узнающую и расщепляющую обе цепи нуклеотидной последовательности ДНК 5′-G(m5C)G(m5C)^∧NG(m5C)G(m5C)-3′/3′-(m5C)G(m5C)GN^∧(m5C)G(m5C)G-5′, где m5C - 5-метилцитозин, с образованием однонуклеотидного 5′-выступающего конца и не расщепляет короткую метилированную последовательность ДНК 5′-G(m5C)^∧NG(m5C)-3′/3′(m5C)GN(m5C)G-5′.

Данная сайт-специфическая эндонуклеаза может быть использована для выявления и анализа метилированной ДНК.

Источники информации

1. Чернухин В.А., Наякшина Т.Н., Абдурашитов М.А., Томилова Ю.Э., Мезенцева Н.В., Дедков B.C., Михненкова Н.А., Гончар Д.А., Дегтярев С.Х. // Новая эндонуклеаза рестрикции GlaI узнает метилированную последовательность 5′-GCGC-3′. - Биотехнология. - 2006. - №4. - С.31-35.

2. Чернухин В.А., Томилова Ю.Э., Чмуж Е.В., Соколова О.О., Дедков B.C., Дегтярев С.Х. Сайт-специфическая эндонуклеаза BlsI узнает последовательности ДНК 5′-G(5mC)NGC-3′ и расщепляет ее с образованием 3′-выступающих концов // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А.Овчинникова. - 2007. - Т.3. - №1. - С.28-33.

3. Чмуж Е.В., Каширина Ю.Г., Томилова Ю.Э., Мезенцева Н.В., Дедков B.C., Гончар Д.А., Абдурашитов М.А., Дегтярев С.Х. Новая эндонуклеаза рестрикции BisI из Bacillus subtilis T30 узнает метилированную последовательность ДНК 5′G(m5C)^∧NGC-3′ // Биотехнология. - 2005. - №3. - С.22-26.

4. Чернухин В.А., Чмуж Е.В., Томилова Ю.Э., Наякшина Т.Н., Гончар Д.А., Дедков B.C., Дегтярев С.Х. Новая сайт-специфичесчкая эндонклеаза GluI узнает метилированную последовательность ДНК 5′-G(5mC)NG(5mC)-3′/3′-(5mC)GN(5mC)G-5′ // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А.Овчинникова. - 2007. - Т.3. - №2. - С.13-17.

5. Определитель бактерий Берджи. / Под ред. Дж.Хоулта и др.: (9-е издание в 2 томах: пер. с англ. под ред. акад. РАН Г.А.Заварзина). - М., 1997.

6. Bickle, T.A., Pirrotta, V. and Imber, R. A simple, general procedure for purifying restriction endonucleases. // Nucleic Acids Res. - 1977. - V.4 - P.561-2572.

7. Sugisaki, H., Yamamoto, K., Takanami М. The HgaI restriction-modification system contains two cytosine methylase genes responsible for modification of different DNA strands. // 1991. - J. Biol. Chem. - V.266 - P.13952-13957.