СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХИМИЧЕСКОГО ВЕЩЕСТВА

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к способу получения химического вещества путем непрерывной ферментации с использованием исходного сырья для ферментации, содержащего гексозу и пентозу.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Поскольку актуальными являются проблема выбросов диоксида углерода в атмосферу и энергетическая проблема, то все большее внимание привлекают получаемые из биомассы химические вещества, представленные биоразлагаемыми полимерными материалами, такими как молочная кислота, и биотопливами, такими как этанол, так как эти вещества характеризуются устойчивым потреблением и обладают определенным эксплуатационным ресурсом (LCA). Указанные биоразлагаемые полимерные материалы и биотопливо обычно получают из микроорганизмов как продукты ферментации с использованием глюкозы, представляющей собой гексозу, в качестве исходного сырья для ферментации, которую выделяют из пригодной в пищу биомассы, такой как кукуруза. Однако использование пригодной в пищу биомассы вызывает рост ее стоимости из-за конкуренции с пищевыми продуктами, что приводит к нестабильному поступлению исходного сырья. В связи с этим предпринимались попытки использовать сахара, выделяемые из не пригодной в пищу биомассы, такой как рисовая солома, в качестве исходного сырья для ферментации микроорганизмами (см. патентный документ 1).

В тех случаях, когда в качестве исходного сырья для ферментации используют сахар, выделенный из непригодной в пищу биомассы, целлюлоза, гемицеллюлоза и т.п., содержащиеся в непригодной в пищу биомассе, разлагаются на сахара под действием осахаривающего фермента. В этом способе получают не только гексозы, такие как глюкоза, но и пентозы, такие как ксилоза и, таким образом, если в качестве исходного сырья для ферментации микроорганизмами используют сахар, полученный из непригодной в пищу биомассы, то в качестве исходного сырья для ферментации

используют смешанные сахара гексоз и пентоз (см. патентный документ 1).

В тех случаях, когда используют смешанные сахара пентоз и гексоз, необходимо использовать микроорганизмы, имеющие не только метаболический путь для гексоз, но и метаболический путь для пентоз. Известно несколько путей для метаболизма пентозы. В метаболическом пути пентоз, где на первой стадии метаболического пути редуктаза пентозы действует на пентозу с образованием пентола, пентол с трудом попадает на последующие стадии метаболического пути, а потому пентол накапливается в культуральной жидкости (см. патентный документ 1). С другой стороны, в метаболическом пути пентоз, где изомераза пентозы действует на пентозу на первой стадии метаболического пути, пентол не образуется, а потому ферментативный выход в данном метаболическом пути выше, чем в метаболическом пути, зависимом от действия редуктаза пентозы (см. внепатентный документ 1).

В качестве способа ферментации, где в качестве исходного сырья для ферментации микроорганизмами используют сахар, который получают из непригодной в пищу биомассы и который представляет собой смешанные сахара гексоз и пентоз, может быть применена непрерывная ферментация, однако выход ферментации, который на самом деле достигается при непрерывной ферментации, не исследовался (см. патентный документ 2). С другой стороны, как известно из области техники, в том случае, когда проводят непрерывную ферментацию с использованием микроорганизма, имеющего изомеразу пентозы и с использованием в качестве сырья для ферментации смеси сахаров гексоз и пентоз, ферментативный выход ниже, чем в случае порционной ферментации (см. внепатентный документ 2). Таким образом, в соответствии с обычными технологическими принципами, полагали, что для улучшения ферментативного выхода при проведении непрерывной ферментации, когда смесь сахаров гексоз и пентоз используют в качестве исходного сырья для ферментации микроорганизмом, имеющим изомеразу пентозы, необходимо улучшить микроорганизм путем генетической модификации, такой как блокирование биосинтетического пути для побочного продукта.

ДОКУМЕНТЫ, ИЗВЕСТНЫЕ ИЗ ОБЛАСТИ ТЕХНИКИ

ПАТЕНТНЫЙ ДОКУМЕНТ

Патентный документ 1: WO 2010/067785

ВНЕПАТЕНТНЫЕ ДОКУМЕНТЫ

Внепатентный документ 1:

Kaisa Karhumaa, Rosa Garcia Sanchez, Barbel Hahn-Hagerdal, Marie-F Gorwa-Grauslund, Comparison of the xylose reductase-xylitol dehydrogenase and the xylose isomerase pathways for xylose fermentation by recombinant Saccharomyces cerevisiae, Microbial Cell Factories, 6:5, (2007).

Внепатентный документ 2:

Do Yun Kim, Seong Chun Yim, Pyung Cheon Lee, Woo Gi Lee, Sang Yup Lee, Ho Nam Chang, Batch and continuous fermentation of succinic acid from wood hydrolysate by Mannheimia succiniciproducens MBEL55E, Enzyme and Microbial Technology, 35, (2004), 648-653.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ПРОБЛЕМЫ, КОТОРЫЕ РЕШАЕТ НАСТОЯЩЕЕ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Известно, что при ферментативном получении биоразлагаемых полимерных веществ и биотоплива непрерывная ферментация, в которой в качестве исходного сырья для ферментации микроорганизмом, имеющим изомеразу пентозы, используют смесь сахаров гексоз и пентоз, приводит к низкому ферментативному выходу. В связи с этим, объектом настоящего изобретения является увеличение ферментативного выхода при непрерывной ферментации, которую проводят с использованием смеси сахаров гексоз и пентоз в качестве исходного сырья для микроорганизма, имеющего метаболический путь, в котором изомераза пентозы используется для метаболизма пентозы.

СРЕДСТВА ДЛЯ РЕШЕНИЯ УКАЗАННЫХ ПРОБЛЕМ

В результате интенсивных исследований, с целью решения вышеуказанной проблемы, авторы настоящего изобретения обнаружили, что проблему можно решить с помощью способа получения химического вещества путем непрерывной ферментации с использованием смеси сахаров гексоз и пентоз в качестве исходного сырья для микроорганизма, имеющего метаболический путь, в котором для метаболизма пентозы используется изомераза пентозы, при этом непрерывную ферментацию осуществляют с использованием разделительной мембраны, и таким образом было осуществлено настоящее изобретение.

Таким образом, настоящее изобретение описывается приведенными ниже пунктами с (1) по (6).

(1) Способ получения химического вещества путем непрерывной ферментации, при этом указанный способ включает фильтрацию культуральной жидкости микроорганизма(ов) через разделительную мембрану; сохранение не прошедшей через фильтр жидкости в культуральной жидкости или возврат обратным потоком не прошедшей через фильтр жидкости в культуральную жидкость; добавление исходного сырья для ферментации в культуральную жидкость; и извлечение продукта из фильтрата; где указанное исходное сырье для ферментации содержит пентозу и гексозу и где указанный(ые) микроорганизм(ы) имеет(ют) метаболический путь, в котором для метаболизма пентозы используется изомераза пентозы.

(2) Способ получения химического вещества в соответствии с пунктом (1), который включает осуществление непрерывной ферментации в условиях, когда коэффициент переноса кислорода (KLa) равен не более чем 150 ч^-1.

(3) Способ получения химического вещества в соответствии с пунктом (1) или (2), где массовое отношение между гексозой и пентозой, которые содержатся в указанном сырье для ферментации, составляет от 1:9 до 9:1.

(4) Способ получения химического вещества в соответствии с пунктом (1) или (2), где указанное сырье для ферментации представляет собой сахарный сироп, полученный из биомассы.

(5) Способ получения химического вещества в соответствии с любым из пунктов с (1) по (4), где указанной изомеразой пентозы является изомераза ксилозы.

(6) Способ получения химического вещества в соответствии с любым из пунктов с (1) по (5), где указанной пентозой является ксилоза.

ПОЛЕЗНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В соответствии с настоящим изобретением, химическое вещество можно получить с большим выходом, несмотря на использование смеси сахаров гексоз и пентоз в качестве исходного сырья для ферментации микроорганизмом, имеющим метаболический путь, в котором для метаболизма пентозы используется изомераза пентозы.

НАИЛУЧШИЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение представляет собой способ ферментативного получения химических веществ путем выращивания микроорганизма(ов) с использованием исходного сырья для ферментации, при этом способ включает фильтрацию культуральной жидкости через разделительную мембрану; сохранение не прошедшей через фильтр жидкости в культуральной жидкости или возврат обратным потоком не прошедшей через фильтр жидкости в культуральную жидкость; добавление исходного сырья для ферментации в культуральную жидкость; и извлечение продукта из фильтрата; при этом осуществляют непрерывную фильтрацию, в которой используют микроорганизм(ы), имеющий(ие) метаболический путь, в котором для метаболизма пентозы используется изомераза пентозы, а указанное исходное сырье для ферментации содержит гексозу и пентозу.

Пятиуглеродный сахар, также называемый пентозой, содержит 5 атомов углерода, которые составляют сахар. Пентозу можно подразделить на альдопентозу, которая имеет альдегидную группу в 1-й позиции, и кетопентозу, которая имеет кетонную группы во 2-й позиции. Примеры альдопентозы включают ксилозу, арабинозу, рибозу и ликсозу, а примеры кетопентозы включают рибулозу и ксилулозу. Пентоза, которую используют по настоящему изобретению, может быть любой пентозой, при условии, что она может метаболизироваться микроорганизмом, а с точки зрения наличия в природе, доступности и т.п. предпочтительными являются ксилоза и арабиноза, а более предпочтительной является ксилоза.

Шестиуглеродный сахар, также называемый гексозой, содержит 6 атомов углерода, которые составляют сахар. Гексозу можно подразделить на альдозу, которая имеет альдегидную группу в 1-й позиции, и кетозу, которая имеет кетонную группы во 2-й позиции. Примеры альдозы включают глюкозу, маннозу, галактозу, аллозу, гулозу и талозу, а примеры кетозы включают фруктозу, псикозу и сорбозу. Гексоза, которую используют по настоящему изобретению, может быть любой гексозой, при условии, что она может метаболизироваться микроорганизмом, а с точки зрения наличия в природе, доступности и т.п. предпочтительными являются глюкоза, манноза и галактоза, при этом более предпочтительной является глюкоза.

Смесь сахаров, используемая в настоящем изобретении, не ограничивается, и указанная смесь сахаров, предпочтительно, представляет собой сахарный сироп, полученный из содержащей целлюлозу биомассы, поскольку он, как известно, содержит как гексозу, так и пентозу. Примеры содержащей целлюлозу биомассы включают растительные биомассы, такие как выжимки сахарного тростника, просо, кукурузную солому, рисовую солому и пшеничную солому; и древесные биомассы, такие как деревья и отходы строительных материалов. Содержащие целлюлозу биомассы включают целлюлозу или гемицеллюлозу, которые представляют собой полисахариды, образующиеся при дегидратационной конденсации сахаров. Путем гидролиза подобных полисахаридов можно получить сахарные сиропы, которые могут использоваться в качестве исходного сырья для ферментации. Способ получения сахарного сиропа из содержащей целлюлозу биомассы может быть любым, и примеры раскрытых способов получения подобного сахара включают способ, в котором сахарный сироп получают путем кислотного гидролиза биомассы с использованием концентрированной серной кислоты (патент Японии H11-506934 A, патент Японии 2005-229821 A), и способ, в котором биомассу подвергают гидролизу с помощью разбавленной серной кислоты, а затем подвергают ферментативной обработке целлюлазой и т.п. с получением сахарного сиропа (A.Aden et al., “Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Co-Current Dilute Acid Prehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Stover” NREL Technical Report (2002). Кроме того, примеры раскрытых способов, где кислоты не используются, включают способ, в котором биомассу гидролизуют с помощью субкритической воды при температуре от приблизительно 250 до 500°С с получением сахарного сиропа (патент Японии №2003-212888 A), способ, в котором биомассу подвергают обработке субкритической водой, а затем подвергают ферментативной обработке и получают сахарный сироп (патент Японии №2001-95597 A), и способ, в котором биомассу подвергают гидролизу горячей водой с температурой от 240 до 280° под давлением, а затем подвергают ферментативной обработке и получают сахарный сироп (патент Японии №3041380 B). За указанными обработками может последовать очистка полученного сахарного сиропа. Пример указанного способа приведен в WO 2010/067785.

Массовое отношение между пентозой и гексозой, содержащимися в смеси сахаров, не ограничивается и, предпочтительно, изменяется в диапазоне от 1:9 до 9:1 отношения (пентоза):(гексоза) в терминах массового соотношения между пентозой и гексозой в смеси сахаров. Оно обозначает соотношение сахаров в тех случаях, когда предполагается, что смесь сахаров представляет собой сахарный сироп, полученный из содержащей целлюлозу биомассы.

Общая концентрация сахара в исходном сырье для ферментации, которое используют в настоящем изобретении, не ограничивается и, преимущественно, является наибольшей в диапазоне, в котором не ингибируется продуцирование химического вещества микроорганизмом(ами). В частности, концентрация источника углерода в культуральной среде, предпочтительно, составляет от 15 до 500 г/л, более предпочтительно, составляет от 20 до 300 г/л. В тех случаях, когда общая концентрация не превышает 15 г/л, эффект пентозы на увеличение выхода снижается. Кроме того, в тех случаях, когда общая концентрация сахара низкая, продуктивность получения химического вещества также уменьшается.

Концентрация гексозы в исходном сырье для ферментации, которое используют в настоящем изобретении, не ограничивается, при условии, что общая концентрация сахара и отношение между пентозой и гексозой находится в вышеуказанном диапазоне. Применение способа получения химического вещества по настоящему изобретению позволяет получить хороший выход даже в том случае, когда используют смешанный сахарный сироп, содержащий гексозу с концентрацией не менее чем 5 г/л.

Исходное сырье для ферментации, которое используют в настоящем изобретении, преимущественно, представляет собой обычную жидкую среду, содержащую источник углерода, источник азота, неорганическую соль и, если необходимо, органическое(ие) питательное(ые) вещество(ва), такое(ие) как аминокислота(ты) и витамин(ы).

Примеры источника азота, который используют в настоящем изобретении, включают газообразный аммиак, водный аммиак, соли аммония, мочевину и соли азотной кислоты, а также другие органические источники азота, используемые в качестве вспомогательных веществ, такие как жмых, гидролизаты соевых бобов, гидролизаты казеина, другие аминокислоты, витамины, кукурузный экстракт, дрожжи или дрожжевые экстракты, мясной экстракт, пептиды, такие как пептон, и клетки различных используемых для ферментации микроорганизмов и их гидролизаты. Примеры неорганических солей, которые могут быть, соответственно, добавлены, включают соли фосфорной кислоты, соли магния, соли кальция, соли железа и соли марганца.

В тех случаях, когда микроорганизм(ы), используемый(ые) в настоящем изобретении, требует(ют) для своего роста определенное питательное вещество, то указанное питательное вещество добавляют в виде препарата или натурального продукта, содержащего питательное вещество. Если необходимо, добавляют пеногаситель. В настоящем изобретении культуральная жидкость обозначает жидкость, которую получают в результате роста микроорганизма(ов) в сырье для ферментации. Состав добавляемого сырья для ферментации может быть соответствующим образом изменен, по сравнению с составом сырья для ферментации, используемого на начальной стадии выращивания в питательной среде, таким образом, чтобы продуктивность представляющего интерес химического вещества увеличивалась.

Ниже поясняются микроорганизмы, которые могут быть использованы в способе получения химического вещества по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение отличается тем, что в нем применяется(ются) микроорганизм(ы), имеющий(ие) метаболический путь, в котором для метаболизма пентозы используется изомераза пентозы. Изомераза пентозы определяется как фермент, который катализирует изомеризацию альдопентозы и кетопентозы, при этом обе пентозы являются структурными изомерами друг друга. Изомераза пентозы, которую используют в настоящем изобретении, специально не ограничивается, при условии, что она способна катализировать прямую изомеризацию пентозы, и примеры изомеразы пентозы включают изомеразу ксилозы (EC 5.3.1.5) и изомеразу арабинозы (EC 5.3.1.3). Например, изомераза ксилозы представляет собой фермент, который катализирует прямую изомеризацию D-ксилозы (альдопентозы) в D-ксилулозу (кетопентозу) и/или их обратную изомеризацию, и известна также как кетоизомераза D-ксилозы. Прямая изомеризации означает одностадийную изомеризацию, катализируемую изомеразой пентозы, которая отлична от двухстадийного превращения, которое катализируется редуктазой пентозы и пентолдегидрогеназой, при этом указанное превращение проходит через стадию образования промежуточного сахарного спирта.

Микроорганизм(ы), которые используются в настоящем изобретении, специально не ограничивается(ются), при условии, что микроорганизм(ы), имеют метаболический путь, в котором для метаболизма пентозы используется изомераза пентозы. Может(могут) применяться микроорганизм(ы), которые изначально имеют изомеразу пентозы, или же может(могут) применяться микроорганизм(ы), полученный(ые) введением гена изомеразы пентозы подходящему хозяину таким образом, чтобы могли использоваться функции изомеразы пентозы. Используемый(ые) микроорганизм(ы) может(могут) быть микроорганизмом(ами), выделенным(ыми) из окружающей среды, или микроорганизмом(ами), свойства которых(ого) частично изменены путем мутации или генной рекомбинации. Кроме того, может(могут) использоваться микроорганизм(ы), имеющий(ие) фермент, активность которого достаточно высока, чтобы катализировать фосфорилирование кетопентозы. Примеры фермента, способного катализировать фосфорилирование кетопентозы, включают ксилулокиназу (EC 2.7.1.17) и рибулокиназу (EC 2.7.1.16).

Примеры микроорганизма, имеющего метаболический путь, который использует изомеразу пентозы для метаболизма пентозы, включают энтеробактерии, такие как Clostridium, Enterobacter, Escherichia, Klebsiella, Bacteroides и Erwinia; молочнокислые бактерии, такие как Lactobacillus; актиномицеты, такие как Actinoplanes, Arthrobacter и Streptomyces; низшие грибы, такие как Piromyces и cyllamyces; и микроорганизмы, принадлежащие к Bacillus, Paenibacillus, Aerobacter, Ampullariella, Staphylococcus, Thermoanaerobacter или Thermus. Конкретные примеры микроорганизма включают микроорганизмы, принадлежащие к Escherichia, Bacillus или Paenibacillus, а более конкретные примеры микроорганизма включают Escherichia coli, Bacillus coagulans и Paenibacillus polymyxa. Тот факт, что они имеют изомеразу пентозы, может быть легко установлен путем поиска в базах данных, опубликованных в Интернете, таких как KEGG (Киотская энциклопедия генов и геномов) и NCBI (Национальный центр биотехнологической информации). Кроме того, для микроорганизма, информация о котором отсутствует в базах данных, тот факт, что микроорганизм имеет или не имеет изомеразу пентозы, может быть установлен путем измерения ферментативной активности, как описано ниже.

Активность изомеразы пентозы можно подтвердить путем проведения ферментативной реакции в присутствии пентозы с последующим определением концентрации пентола, полученного в результате изомеризации, с помощью ВЭЖХ и т.п. Например, активность изомеразы ксилозы можно определить с помощью метода, раскрытого в патенте Японии 2008-79564 A. Аналогичный метод может быть использован для изомеразы арабинозы.

Примеры микроорганизма, который получают путем введения гена изомеразы пентозы подходящему хозяину таким образом, что он приобретает функции изомеразы пентозы, включают пример, раскрытый в патенте Японии 2006-525029 A. Ген изомеразы пентозы, который необходимо ввести, специально не ограничивается, и он может представлять собой либо геномную ДНК, либо кДНК. Кроме того, указанный ген может быть геном, полученным из любого организма, включая животных, растения, грибы (дрожжи, плесневые грибы и т.п.) и бактерии. Информацию об указанных генах можно легко найти, выполнив поиск в базах данных, опубликованных в Интернете, таких как NCBI.

Далее поясняется пористая мембрана, которую используют в качестве разделительной мембраны по настоящему изобретению.

Пористая мембрана, которую используют по настоящему изобретению, специально не ограничивается, при условии, что она способна отделять от микроорганизма(ов) путем фильтрации культуральную жидкость, получаемую при культивировании микроорганизма(ов) в процессе перемешивания в сосуде для выращивания в питательной среде или в процессе перемешивания в биореакторе. Примеры пористых мембран, которые можно использовать, включают пористые керамические мембраны, пористые стеклянные мембраны, пористые органические полимерные мембраны, ткани из металлических волокон и нетканые материалы. Среди них пористые органические полимерные мембраны и керамические мембраны являются наиболее предпочтительными.

Состав пористой мембраны, которую используют в качестве разделительной мембраны по настоящему изобретению, поясняется ниже. Пористая мембрана, используемая по настоящему изобретению, обладает разделительной способностью и проницаемостью, которая подходит по свойствам и применению для жидкости, обработку которой проводят.

Пористая мембрана, предпочтительно, представляет собой пористую мембрану, имеющую пористый полимерный слой, выбранный с учетом блокирующей способности, проницаемости и разделительной способности, например, сопротивляемости засорению.

Пористая мембрана, включающая пористый полимерный слой, предпочтительно, имеет пористый полимерный слой, который выступает в качестве функционального разделительного слоя на поверхности основного пористого вещества. Основное пористое вещество несет на себе пористый полимерный слой и придает прочность разделительной мембране.

В тех случаях, когда пористая мембрана, которую используют по настоящему изобретению, имеет пористый полимерный слой на поверхности основного пористого вещества, основное пористое вещество может быть импрегнировано пористым полимерным слоем или может не быть импрегнировано пористым полимерным слоем, что можно выбрать в зависимости от применения мембраны.

Средняя толщина основного пористого вещества, предпочтительно, составляет от 50 мкм до 3000 мкм.

Основное пористое вещество состоит из органического вещества и/или неорганического вещества и т.п., и, преимущественно, используют органическое волокно. Предпочтительные примеры основного пористого вещества включают тканые материалы и нетканые материалы, состоящие из органических волокон, таких как целлюлозные волокна, волокна на основе триацетата целлюлозы, полиэфирные волокна, полипропиленовые волокна и полиэтиленовые волокна. Более предпочтительно, используют нетканый материал, поскольку его плотность относительно легко контролировать; его сравнительно легко получать; и он не является дорогим.

В качестве пористого полимерного слоя, предпочтительно, может быть использована органическая полимерная мембрана. Примеры веществ для органической полимерной мембраны включают полиэтиленовые смолы, полипропиленовые смолы, поливинилхлоридные смолы, поливинилиденфторидные смолы, полисульфоновые смолы, полиэфирсульфоновые смолы, полиакрилонитриловые смолы, смолы на основе целлюлозы смолы и смолы на основе триацетата целлюлозы. Органическая полимерная мембрана может представлять собой смесь смол, содержащую одну или несколько указанных смол в качестве основного компонента. Основной компонент в данном описании означает, что указанный компонент содержится в количестве не менее чем 50% масс., предпочтительно, не менее чем 60% масс. Предпочтительные примеры веществ для органической полимерной мембраны включают такие, которые легко получаются из растворов и обладают превосходной физической прочностью и химической стойкостью, такие как поливинилхлоридные смолы, поливинилиденфторидные смолы, полисульфоновые смолы, полиэфирсульфоновые смолы и полиакрилонитриловые смолы. Наиболее предпочтительно используют поливинилиденфторидную смолу или смолу, содержащую ее в качестве основного компонента.

В качестве поливинилиденфторидной смолы, предпочтительно, используют гомополимер винилиденфторида. Кроме того, в качестве поливинилиденфторидной смолы, предпочтительно, используется также сополимер с виниловыми мономерами, способными к сополимеризации с винилиденфторидом. Примеры виниловых мономеров, способных к сополимеризации с винилиденфторидом, включают тетрафторэтилен, гексафторпропилен и фтортрихлорэтилен.

Пористая мембрана, которая может использоваться в качестве разделительной мембраны по настоящему изобретению, специально не ограничивается, при условии, что микроорганизм(ы), используемый(ые) в процессе ферментации, не может(могут) проходить сквозь мембрану, и мембраны, преимущественно, выбирают из диапазона, в котором секреции из микроорганизма(ов), используемого(ых) в процессе ферментации, или частицы из исходного сырья для ферментации не вызывают закупоривание мембраны, а фильтрационная способность стабильно поддерживается в течение длительного периода времени. Таким образом, средний размер пор пористой разделительной мембраны, предпочтительно, составляет не меньше чем 0,01 мкм и меньше чем 5 мкм. Средний размер пор, более предпочтительно, составляет не меньше чем 0,01 мкм и меньше чем 1 мкм, поскольку в указанном диапазоне может поддерживаться высокая блокирующая способность, которая препятствует утечке микроорганизмов, и высокая проницаемость для воды, при этом проницаемость можно поддерживать с высокой точностью и воспроизводимостью в течение длительного периода времени.

В тех случаях, когда размер пор близок к размеру микроорганизма(ов), поры могут блокироваться микроорганизмом(ами). Поэтому средний размер пор пористой мембраны, предпочтительно, составляет менее 1 мкм. Чтобы предотвратить утечку микроорганизма(ов), т.е. снизить скорость удаления микроорганизма(ов), средний размер пор мембраны, преимущественно, не должен быть слишком большим, по сравнению с размером микроорганизма(ов). В тех случаях, когда используют микроорганизм с малым размером клетки, такой как бактерия, средний размер пор, предпочтительно, составляет не более 0,4 мкм, более предпочтительно, составляет меньше чем 0,2 мкм.

В некоторых случаях микроорганизм(ы) может(могут) продуцировать вещества, отличные от представляющего интерес химического вещества, например, вещества, которые имеют тенденцию к агрегированию, такие как белки и полисахариды. Кроме того, в некоторых случаях отмирание части микроорганизма(ов) в ферментативной культуральной жидкости может привести к образованию клеточного дебриса. Чтобы предотвратить закупорку пористой мембраны указанными веществами, средний размер пор, еще более предпочтительно, составляет не более 0,1 мкм.

В тех случаях, когда средний размер пор слишком мал, проницаемость пористой мембраны снижается и, таким образом, эффективную работу трудно осуществить даже с чистой мембраной. Поэтому средний размер пор пористой мембраны по настоящему изобретению, предпочтительно, составляет не меньше чем 0,01 мкм, более предпочтительно, не меньше чем 0,02 мкм, а еще более предпочтительно, не меньше чем 0,04 мкм.

Средний размер пор можно определить путем измерения диаметров всех пор, которые можно наблюдать на площади 9,2 мкм × 10,4 мкм в сканирующем электронном микроскопе при 10000-кратном увеличении, а затем усредняя измеренные значения. В качестве альтернативы, средний размер пор можно определить, сделав фотографию поверхности мембраны при 10000-кратном увеличении с помощью сканирующего электронного микроскопа и произвольно выбрав не менее 10 пор, предпочтительно, не менее 20 пор, а затем измерить диаметры указанных пор и рассчитать среднечисловые значения. Если пора не круглой формы, ее размер можно определить с помощью метода, в котором определяют круг (эквивалентный круг), площадь которого равна площади поры, с помощью устройства компьютерной обработки изображений и т.п., и диаметр эквивалентного круга принимают за диаметр поры.

Стандартное отклонение σ от среднего размера пор пористой мембраны, которую используют по настоящему изобретению, предпочтительно, составляет не больше чем 0,1 мкм. Стандартное отклонение σ от среднего размера пор, предпочтительно, должно быть как можно меньшим. Стандартное отклонение σ от среднего размера пор рассчитывают в соответствии с приведенным ниже уравнением 1, где N соответствует числу пор, которые можно наблюдать в пределах указанной выше площади 9,2 мкм × 10,4 мкм, X_k обозначает соответствующие измеренные диаметры, а X(ave) обозначает средний диаметр пор.

Одной из наиболее важных характеристик пористой мембраны, которую используют по настоящему изобретению, является проницаемость для ферментативной культуральной жидкости. В качестве показателя проницаемости может быть использован коэффициент проницаемости пористой мембраны для чистой воды перед использованием мембраны. В настоящем изобретении коэффициент проницаемости пористой мембраны для чистой воды, предпочтительно, составляет не менее чем 5,6×10^-10 м³/м²/с/Па, если его рассчитывать путем измерения количества водного пермеата при высоте головки 1 м, используя очищенную воду с температурой 25°С, которую получают с помощью обратноосмотической мембраны. В том случае, когда коэффициент проницаемости чистой воды находится в интервале от 5,6×10^-10 м³/м²/с/Па до 6,7×10^-7 м³/м²/с/Па, может быть получено количество пермеата, которое достаточно с практической точки зрения.

Для пористой мембраны, которую используют по настоящему изобретению, шероховатость поверхности представляет собой среднее значение высоты в вертикальном направлении к поверхности. Шероховатость поверхности мембраны, является одним из факторов, которые влияют на то, насколько легко микроорганизм, прикрепившийся к поверхности разделительной мембраны, удаляется с поверхности при отмывке поверхности мембраны под действием потока жидкости, возникающего при перемешивании или с помощью циркуляционного насоса. Шероховатость поверхности пористой мембраны специально не ограничивается, при условии, что она входит в диапазоне, в котором микроорганизм(ы) и другие твердые вещества, прикрепившиеся к мембране, могут быть удалены. Шероховатость поверхности, преимущественно, составляет не более 0,1 мкм. В том случае, когда шероховатость поверхности не больше чем 0,1 мкм, микроорганизм(ы) и другие твердые вещества, присоединенные к мембране, могут быть легко удалены.

Установлено, что операцию, которая не требует избыточной мощности для очистки поверхности мембраны, можно проще осуществить путем использования, что более предпочтительно, пористой мембраны, шероховатость поверхности которой не превышает 0,1 мкм, средний размер пор составляет не меньше чем 0,01 мкм и меньше чем 1 мкм, а коэффициент проницаемости пористой мембраны для чистой воды составляет не менее 2×10^-9 м³/м²/с/Па. В тех случаях, когда шероховатость поверхности пористой мембраны не превышает 0,1 мкм, силу сдвига, создаваемую на поверхности мембраны при фильтрации микроорганизма(ов), можно снизить и тем самым уменьшить разрушение микроорганизма(ов), а также можно подавить закупоривание пористой мембраны. Таким образом, можно легче осуществить стабильную фильтрацию в течение длительного времени. Кроме того, в тех случаях, когда шероховатость поверхности пористой мембраны не превышает 0,1 мкм, непрерывную ферментацию можно осуществить при меньшей разнице трансмембранного давления. Таким образом, даже в тех случаях, когда произошло закупоривание пористой мембраны, можно добиться лучшего восстановления проницаемости с помощью промывки, по сравнению с теми случаями, когда операцию проводят при большей разнице трансмембранного давления. Поскольку подавление закупорки пористой мембраны позволяет провести устойчивую непрерывную ферментацию, то шероховатость поверхности пористой мембраны, предпочтительно, должна быть как можно меньшей.

Шероховатость пористой мембраны в настоящем изобретении измеряют с помощью атомного силового микроскопа (AFM) в следующих условиях.

- Устройство

Атомно-силовой микроскоп ("Nanoscope IIIa", производитель - Digital Instruments, Inc.)

- Условия

Зонд:

консоль из SiN (производитель - Digital Instruments, Inc.)

Режим сканирования:

Контактный режим (измерение на воздухе)

Подводный полуконтактный режим (измерение под водой)

Площадь сканирования:

10 мкм × 25 мкм (измерение на воздухе)

5 мкм × 10 мкм (измерение под водой)

Разрешение сканирования:

512×512

- Приготовление образца

При проведении измерений образец мембраны на 15 мин помещают в этанол при комнатной температуре, а затем помещают в воду RO на 24 ч, чтобы промыть его, а затем сушат на воздухе. Вода RO означает воду, которую получают фильтрацией через обратноосмотическую мембрану (RO мембрану), которая представляет собой разновидность фильтрационной мембраны, с целью удаления примесей, таких как ионы и соли. Размер пор обратноосмотической мембраны составляет не более чем приблизительно 2 нм.

Шероховатость поверхности мембраны d_rough рассчитывают по приведенному ниже уравнению (2) из высоты в каждой точке в направлении оси Z, которую определяют с помощью атомно-силового микроскопа (AFM).

: Средняя шероховатость поверхности (мкм)

: Высота в направлении оси Z (мкм)

: Средняя высота сканированной площади (мкм)

Формой пористой мембраны, используемой по настоящему изобретению, предпочтительно, является плоская мембрана. В том случае, когда формой пористой мембраны является плоская мембрана, ее среднюю толщину выбирают в зависимости от применения. Средняя толщина в тех случаях, когда формой пористой мембраны является плоская мембрана, предпочтительно, составляет от 20 мкм до 5000 мкм, более предпочтительно, от 50 мкм до 2000 мкм.

Кроме того, формой пористой мембраны, используемой по настоящему изобретению, предпочтительно, является мембрана из полого волокна. В том случае, когда пористая мембрана представляет собой мембрану из полого волокна, внутренний диаметр полого волокна, предпочтительно, составляет от 200 мкм до 5000 мкм, а толщина мембраны, предпочтительно, составляет от 20 мкм до 2000 мкм. Внутри полых волокон могут содержаться ткани или трикотаж, которым путем формования органических волокон или неорганических волокон придают цилиндрическую форму.

Описанную выше пористую мембрану можно получить, например, по способу получения, описанному в WO 2007/097260.

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения разделительная мембрана по настоящему изобретению может быть мембраной, включающей, по меньшей мере, керамику. Керамика в настоящем изобретении означает вещество, которое содержит оксид металла и которое обжигают в процессе тепловой обработки при высокой температуре. Примеры оксида металла включают оксид алюминия, оксид магния, оксид титана и оксид циркония. Разделительная мембрана может быть сформирована только из оксида(ов) металла или может включать в себя оксид кремния, и/или карбид кремния, и/или муллит, и/или кордиерит, которые представляют собой соединения оксида кремния и оксида(ов) металла (металлов).

Отличные от керамики компоненты, которые образуют разделительную мембрану, не ограничиваются, при условии, что указанные компоненты могут образовать пористое тело в качестве разделительной мембраны.

Даже в тех случаях, когда разделительная мембрана содержит керамику, форма разделительной мембраны не ограничивается, и она может быть любой из монолитной мембраны, плоской мембраны и трубчатой мембраны и т.п. С точки зрения эффективности упаковки в контейнер, разделительная мембрана, преимущественно, имеет столбчатую форму, в которой в продольном направлении образуются сквозные отверстия. С точки зрения увеличения эффективности упаковки, разделительная мембрана, предпочтительно, представляет собой монолитную мембрану.

Причина, по которой разделительная мембрана, преимущественно, имеет сквозные отверстия в продольном направлении, заключается в следующем. В тех случаях, когда разделительную мембрану, имеющую столбчатую структуру, помещают в модульный контейнер для использования в качестве разделительной мембраны, модульность разделительной мембраны можно обеспечить за счет выбора предпочтительного режима из давления внешнего типа и давления внутреннего типа, а фильтрацию можно осуществлять с помощью модуля. В настоящем изобретении сторону, где разделительная мембрана контактирует с ферментативной культуральной жидкостью, далее в данном описании обозначают как первичную сторону, а сторону, в которой путем фильтрации получают фильтрат, содержащий химическое вещество, далее в данном описании обозначают как вторичную сторону.

В тех случаях, когда применяют модуль с давлением внутреннего типа, канал в первичной стороне узкий. Таким образом, можно сохранить выходную мощность циркуляционного насоса в процессе фильтрации в перекрестном потоке. Кроме того, воздействие, с целью убрать суспендированное вещество, которое накапливается на поверхности разделительной мембраны, является сильным, а потому поверхность разделительной мембраны легко содержать в чистоте. Тем не менее, для того чтобы добиться указанного эффекта, разделительная мембрана с давлением внутреннего типом должна иметь входное и выходное отверстие для ферментативной культуральной жидкости. Входное и выходное отверстие находятся в таком состоянии, что они располагаются на прямой линии, образуя сквозное отверстие, поскольку в этом случае сопротивление потоку является низким. Кроме того, в тех случаях, когда разделительная мембрана имеет столбчатую форму и сквозное(ые) отверстие(ия) открывается(ются) в продольном направлении, контейнер, содержащий разделительную мембрану, можно сделать тонким. Тонкий модуль разделительной мембраны является предпочтительным с точки зрения производительности и легкости манипулирования.

Пористость разделительной мембраны не ограничивается, однако в тех случаях, когда пористость слишком низкая, эффективность фильтрации мала; а в случаях, когда пористость слишком высокая, прочность оказывается низкой. Чтобы можно было добиться и высокой эффективности фильтрации, и высокой прочности разделительной мембраны, а также обеспечить стойкость к многократной стерилизации паром, пористость, предпочтительно, должна составлять от 20% до 60%.

Пористость определяют, используя следующее уравнение.

Пористость [%]=100×(вес влажной мембраны [г] - вес сухой мембраны [г])/удельный вес воды [г/см³]/(объем мембраны [см³]).

Средний размер пор разделительной мембраны, предпочтительно, составляет от 0,01 мкм до 1 мкм, и мембрана, средний размер пор которой попадает в указанный диапазон, меньше подвержена закупориванию и обладает превосходной эффективностью фильтрации. Кроме того, для среднего диаметра пор в диапазоне от 0,02 мкм до 0,2 мкм вещества, которые легко вызывают закупоривание разделительной мембраны, такие как побочные продукты ферментации при использовании микроорганизма или выращенных в питательной среде клеток, включая белки и полисахариды, а также клеточный дебрис, образующийся в культуральной жидкости в результате отмирания микроорганизма/выращенных в питательной среде клеток, с меньшей вероятностью вызывают закупоривание мембраны, что является особенно предпочтительным.

Для разделительной мембраны, имеющей сквозные отверстия и столбчатую структуру, наружная поверхность находится на вторичной стороне. Таким образом, более удобно применять модульный контейнер для сбора фильтрата, а разделительная мембрана должна быть упакована в контейнер, образуя модуль, который и будет использоваться. В один модуль упаковывают одну или несколько мембран.

Модульный контейнер, преимущественно, изготовлен из материала, который способен выдерживать неоднократную стерилизацию паром. Примеры веществ, устойчивых к стерилизации паром, включают нержавеющую сталь и керамику с низкой средней пористостью.

Подобный керамический мембранный модуль может быть, например, изготовлен, как указано в способе, приведенном в WO 2012/086763, или же можно использовать коммерчески доступный мембранный модуль. Конкретные примеры коммерчески доступного модуля включают микрофильтрационную мембрану MEMBRALOX (Pall Corporation) и керамический мембранный фильтр Cefilt MF Membrane (NGK Insulators, Ltd.).

Далее поясняется процесс непрерывной ферментации.

Непрерывная ферментация по настоящему изобретению отличается тем, что она представляет собой непрерывную ферментацию, при которой культуральную жидкость микроорганизма(ов) фильтруют через разделительную мембрану; не прошедшая через фильтр жидкость сохраняется в культуральной жидкости или обратным потоком возвращается в культуральную жидкость; исходное сырье для ферментации добавляют к культуральной жидкости; и продукт извлекают из фильтрата.

При выращивании микроорганизма(ов) в питательной среде можно задать величину рН и температуру, подходящую для используемого(ых) микроорганизма(ов), и значения рН и температуры специально не ограничиваются, при условии, что микроорганизм(ы) может(могут) быть выращен(ы). Значение рН и температуры обычно находятся в диапазоне от 4 до 8 и от 20 до 75°С, соответственно. Величину рН культуральной жидкости заранее регулируют в соответствии с заданным значением, которое обычно находится в интервале от 4 до 8, используя неорганическую или органическую кислоту, щелочь, мочевину, карбонат кальция, газообразный аммиак и т.п.

Для обеспечения непрерывного роста клеток в культуральную среду может(могут) добавлять нутриент(ы), необходимый(ые) для роста микроорганизма. Концентрация микроорганизма в культуральной среде не ограничивается, при условии, что она является концентрацией, предпочтительной для эффективного продуцирования химического вещества. Хорошую продуктивность можно обеспечить, поддерживая концентрацию микроорганизма в культуральной среде, например, на уровне не менее чем 5 г/л в пересчете на сухой вес.

С точки зрения условий для содержания кислорода при выращивании в питательной среде по настоящему изобретению коэффициент переноса кислорода Kla (ч^-1) (далее в настоящем описании обозначают просто как Kla), предпочтительно, равен не более чем 150 ч^-1.

Kla характеризует способность образовывать растворенный кислород за счет переноса кислорода из газовой фазы в жидкую фазу в единицу времени при аэрации и перемешивании, и его определяют в соответствии с приведенным ниже уравнением (3). (Laboratory Manual for Bioengineering. The Society for Biotechnology, Japan ed., Baifukan Co., Ltd., p. 310 (1992)).

В приведенном уравнении C обозначает концентрацию растворенного кислорода DO (в частях на миллион) в культуральной жидкости; C* обозначает концентрацию растворенного кислорода DO (в частях на миллион) в состоянии равновесия в газовой фазе в отсутствие потребления кислорода микроорганизмом(ами); а Kla обозначает коэффициент переноса кислорода (ч^-1). Поскольку приведенное ниже уравнение (4) получено из приведенного выше уравнения (3), то Kla можно определить, нанося на график логарифма величины C*-C в зависимости от периода аэрации.

Kla в настоящем изобретении представляет собой величину, которую измеряют методом вытеснения газа (динамическим методом). Метод вытеснения газа (динамический метод) представляет собой способ, в котором воду и используемую культуральную среду помещают в перемешиваемую путем аэрации установку для выращивания в питательной среде, которая снабжена помещенным внутрь электродом для измерения растворенного кислорода, и кислород в жидкости замещают газообразным азотом, чтобы снизить концентрацию кислорода в жидкости, а затем заменяют газообразный азот сжатым воздухом и контролируют процесс увеличения количества растворенного кислорода при определенной скорости аэрации, скорости перемешивания и температуре, чтобы рассчитать величину Kla.

Kla можно определить, соответственно, комбинируя условия аэрации и условия перемешивания с тем, чтобы провести выращивание в питательной среде при аэрации и перемешивании. В таком случае выращивание в питательной среде можно осуществить либо при аэрации, либо без аэрации, а газ, который предполагается использовать для аэрации, может быть изменен в зависимости от условий выращивания в питательной среде. Например, для поддержания низкой концентрации растворенного кислорода, контейнер может быть плотно закрыт с тем, чтобы предотвратить аэрацию; аэрацию можно проводить с помощью инертного газа, такого как газообразный азот; или аэрацию можно проводить с помощью инертного газа, содержащего газообразный диоксид углерода. С другой стороны, например, для поддержания высокого уровня растворенного кислорода, концентрацию кислорода можно поддерживать на уровне не менее 21% путем добавления кислорода в воздух; или можно повышать давление культуральной жидкости.

В том случае, когда значение Kla попадает в диапазон, определенный в настоящем изобретении, известно, что при постоянной скорости перемешивания величина Kla пропорциональна скорости аэрации, как указано в приведенном ниже уравнении (5). Таким образом, определенное значение Kla, которое используют при выращивании в питательной среде в соответствии с настоящим изобретением, можно установить путем измерения Kla при постоянной скорости перемешивания, в то время как скорость аэрации соответствующим образом изменяют, а полученные значения Kla нанести на график в зависимости от скорости аэрации, а затем определить константы a и b, которые удовлетворяют уравнению (5).

В данном уравнении V обозначает скорость аэрации (vvm); a и b являются константами.

Микроорганизм, который может использоваться по настоящему изобретению и имеет метаболический путь, где для метаболизма пентозы используется изомераза пентозы, не требует кофермента, такого как NADH, для реакции изомеризации пентозы в пентол. Таким образом, на метаболизм пентозы не влияют условия по кислороду. Следовательно, химическое вещество может быть получено без замедления метаболизм пентозы даже в анаэробных условиях, в которых кислород не используется. Значение Kla, которое используют при ферментативном выращивании в питательной среде по настоящему изобретению, не ограничивается и, в частности, значение Kla, предпочтительно, не превышает 150 ч^-1, более предпочтительно, не превышает 100 ч^-1, еще более предпочтительно, не превышает 60 ч^-1, наиболее предпочтительно, не превышает 30 ч^-1. При выращивании в питательной среде микроорганизма(ов), имеющего(их) изомеразу пентозы, в указанных кислородных условиях выход представляющего интерес химического вещества заметно возрастает.

В способе получения химического соединения по настоящему изобретению разность трансмембранного давления при фильтрации не ограничивается, при условии, что можно осуществить фильтрацию ферментативной культуральной жидкости. Тем не менее, в тех случаях, когда фильтрацию осуществляют через органическую полимерную мембрану с трансмембранным давлением выше, чем 150 кПа, велика вероятность разрушения структуры органической полимерной мембраны, а потому может пострадать продуктивность получения химических веществ. В тех случаях, когда разница трансмембранного значения меньше чем 0,1 кПа, можно недополучить существенную часть фильтрата ферментативной культуры, и продуктивность получения химического вещества снизится. Таким образом, в том случае, когда в способе получения химического вещества по настоящему изобретению применяют органическую полимерную мембрану, разница трансмембранного давления, которое равно давлению при фильтрации, предпочтительно, находится в диапазоне от 0,1 кПа до 150 кПа, поскольку в таком случае количество фильтрата ферментативной культуральной жидкости может быть большим, а снижение продуктивности получения химического вещества вследствие разрушения структуры мембраны не происходит. Таким образом, в этом случае можно поддерживать высокую продуктивность получения химического вещества. В тех случаях, когда используют органическую полимерную мембрану, разница трансмембранного давления, более предпочтительно, находится в диапазоне от 0,1 кПа до 50 кПА, еще более предпочтительно, находится в диапазоне от 0,1 кПа до 20 кПА.

И в тех случаях, когда используют керамическую мембрану, разница трансмембранного давления в процессе фильтрации не ограничивается, при условии, что можно осуществить фильтрацию ферментативной культуральной жидкости. Разница трансмембранного давления, предпочтительно, не превышает 500 кПа. В тех случаях, когда процесс проводят при давлении не меньше чем 500 кПа, возможно закупоривание мембраны, которое может вызвать проблемы при проведении непрерывной ферментации.

В качестве движущей силы фильтрации для создания разницы трансмембранного давления в разделительной мембране может применяться сифон, в котором используют разницу в уровне жидкости (разницу гидравлической головки) между ферментативной культуральной жидкостью и жидкостью, прошедшей через пористую мембрану, или может применяться циркуляционный насос с перекрестным потоком. Кроме того, в качестве внешней силы для фильтрации можно использовать всасывающий насос на вторичной стороне разделительной мембраны. В тех случаях, когда используют циркуляционный насос с перекрестным потоком, разницу трансмембранного давления можно регулировать с помощью давления всасывания. Разницу трансмембранного давления можно также регулировать с помощью давления газа или жидкости, которые применяют для создания давления на стороне ферментативной жидкости. В тех случаях, когда осуществляют подобное регулирование давления, разницу между давлением на стороне ферментативной жидкости и давлением на стороне жидкости, прошедшей через пористую мембрану, можно принимать за разницу трансмембранного давления и использовать ее для регулирования разницы трансмембранного давления.

В способе получения химического вещества по настоящему изобретению непрерывную ферментацию (фильтрацию культуральной жидкости) для порционной клеточной культуры или клеточной культуры с подпиткой можно начать на ранней стадии выращивания в питательной среде после того, как концентрация микроорганизма повысится. В качестве альтернативы, клетки микроорганизма можно высевать с большой концентрацией, а непрерывную ферментацию осуществлять с самого начала выращивания в питательной среде. В способе получения химического вещества по настоящему изобретению подачу культуральной среды и фильтрацию культуральной жидкости можно проводит в удобные моменты времени. Временные точки начала подачи культуральной среды и фильтрации культуральной жидкости необязательно могут совпадать. Подачу культуральной среды и фильтрацию культуральной жидкости можно осуществлять как непрерывным, так и прерывистым способом.

С точки зрения продуктивности, концентрация сахара в полном фильтрате при непрерывной ферментации, предпочтительно, не превышает 5 г/л. Концентрацию сахара в фильтрате можно контролировать скоростью подачи культуральной среды, скоростью фильтрации культуральной жидкости и/или с помощью концентрации сахара в культуральной среде.

Если необходимо, в процессе непрерывной ферментации в способе получения химического вещества по настоящему изобретению концентрацию микроорганизма в сосуде для выращивания в питательной среде можно регулировать, удаляя из биореактора часть культуральной жидкости, содержащей микроорганизм(ы) и затем разбавляя культуральную жидкость в сосуде для выращивания в питательной среде с помощью культуральной среды. Например, когда концентрация микроорганизм в биореакторе становится слишком высокой, то велика вероятность закупорки разделительной мембраны. Закупоривание разделительной мембраны можно предотвратить, удалив часть культуральной жидкости, содержащей микроорганизм(ы), и затем разбавив культуральную жидкость в биореакторе с помощью культуральной среды. Кроме того, продуктивность получения химического вещества может меняться в зависимости от концентрации микроорганизма в биореакторе. Продуктивность можно поддерживать путем удаления микроорганизма(ов), используя продуктивность в качестве показателя.

В тех случаях, когда непрерывную ферментацию осуществляют в соответствии со способом получения химического вещества по настоящему изобретению, можно получить более высокий выход, а также можно осуществить непрерывное ферментативное производство со значительно большей эффективностью, по сравнению с теми случаями, когда используют обычную клеточную культуру. Ферментативный выход при непрерывной ферментации в данном описании рассчитывают в соответствии с приведенным ниже уравнением (6)

Выход (г/г) = количество продукта (г)/{добавленный сахар (г) - не использованный сахар (г)} (6)

Установка для непрерывной ферментация, которую используют в настоящем изобретении, специально не ограничивается, при условии, что она представляет собой установку для получения химического вещества путем непрерывной ферментации, где ферментативную культуральную жидкость микроорганизма(ов) фильтруют через разделительную мембрану, а продукт извлекают из фильтрата, в то время как не прошедшая через фильтр жидкость сохраняется в ферментативной культуральной жидкости или обратным потоком возвращается в ферментативную культуральную жидкость; исходное сырье для ферментации добавляют к ферментативной культуральной жидкости; и продукт извлекают из фильтрата. Конкретные примеры установки, в которой используют органическую полимерную мембрану, включают установку, описанную в WO 2007/097260. Конкретные примеры установки, в которой используют керамическую полимерную мембрану, включают установку, описанную в WO 2012/086763.

Химическое вещество, полученное по способу получения химического вещества по настоящему изобретению, не ограничивается, при условии, что оно представляет собой вещество, продуцированное в ферментативной культуральной жидкости вышеуказанным микроорганизмом. Примеры химического вещества включают спирты, органические кислоты, аминокислоты и нуклеиновые кислоты, представляющие собой вещества, которые являются массовой продукцией бродильного производства. Примеры веществ включают спирты, такие как этанол, 1,3-пропандиол, 1,4-бутандиол, 2,3-бутандиол, глицерин, бутанол, изобутанол, 2-бутанол и изопропанол; органические кислоты, такие как уксусная кислота, молочная кислота, адипиновая кислота, пировиноградная кислота, янтарная кислота, яблочная кислота, итаконовая кислота и лимонная кислота; нуклеиновые кислоты, такие как нуклеозиды, включая инозин и гуанозин, и нуклеотиды, включая инозиновую кислоты и гуаниловую кислоту; и диаминовые соединения, такие как кадаверин. Среди них предпочтительными являются органические кислоты и спирты, а более предпочтительными являются лимонная кислота, этанол и 2,3-бутандиол. Кроме того, настоящее изобретение можно также применять для получения таких веществ, как ферменты, антибиотики и рекомбинантные белки. Указанные химические вещества можно выделить из фильтрата хорошо известными способами (мембранным разделением, концентрированием, дистилляцией, кристаллизацией, экстракцией и т.д.).

ПРИМЕРЫ

Далее настоящее изобретение будет подробно описано на примерах. Тем не менее, настоящее изобретение указанными примерами не ограничивается.

(Справочный пример 1) Метод анализа глюкозы, ксилозы, ксилулозы, этанола и 2,3-бутандиола

Концентрацию глюкозы, ксилозы, ксилулозы, этанола и 2,3-бутандиола в жидкости для ферментации количественно оценивают в указанных ниже условиях проведения ВЭЖХ путем сравнения со стандартными образцами.

Колонка: Shodex SH1011 (изготовитель - Showa Denko K.K.)

Подвижная фаза: 5 мМ раствор серной кислоты (скорость потока: 0,6 мл/мин)

Реакционная жидкость: отсутствует

Метод обнаружения: RI (дифференциальный показатель преломления)

Температура: 65°С.

(Справочный пример 2) Метод анализа молочной кислоты

Молочную кислоту в культуральной жидкости количественно оценивают в указанных ниже условиях проведения ВЭЖХ путем сравнения со стандартными образцами.

Колонка: Shim-Pack SPR-H (изготовитель - Shimadzu Corporation)

Подвижная фаза: 5 мМ раствор п-толуолсульфоновой кислоты (скорость потока: 0,8 мл/мин)

Реакционная жидкость: 5 мМ раствор п-толуолсульфоновой кислоты, 20 мМ Bis-Tris, 0,1 мМ ЭДТК-Na (скорость потока: 0,8 мл/мин)

Метод обнаружения: электропроводность

Температура: 45°С.

(Справочный пример 3) Определение Kla

Электрод для определения растворенного кислорода (изготовитель - Mettler-Toledo) помещают в сосуд для выращивания в питательной среде, чтобы измерить концентрацию растворенного кислорода для каждого условия аэрации/перемешивания, и определяют величину Kla динамическим способом с использованием газообразного азота. В сосуд для выращивания в питательной среде емкостью 1,5 л помещают воду, а затем через воду продувают достаточное количество газообразного азота, при этом температуру воды поддерживают на уровне 30°С или 50°С и перемешивают воду с постоянной скоростью. Когда электродная величина становится минимальной, проводят калибровку нуля электрода для определения растворенного кислорода. Затем используемый для аэрации газ меняют с газообразного азота на воздух при заданной скорости аэрации и для определения Kla измеряют изменения концентрации растворенного кислорода. В таблице 1 приведены значения Kla для различных условий аэрации/перемешивания.

Согласно таблице 1, константы (a, b) в уравнении (5), которые получают, помещая на график зависимость между скоростью аэрации и наблюдаемой величиной Kla, когда аэрацию проводят воздухом при скорости вращения 800 об/мин, равны (284, 0,49) и (257, -0,47) при температуре 30°С и 50°С, соответственно.

(Справочный пример 4) Определение активности изомеразы ксилозы в Escherichia coli

Штамм Escherichia coli KO11 инокулируют в 5 мл прекультуральной среды (20 г/л глюкозы, 10 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л триптона, 5 г/л NaCl) с помощью платиновой петли и выращивание в питательной среде проводят при температуре 30°С в течение ночи (прекультура). На следующий день прекультуральную жидкость инокулируют в 50 мл среды для ферментативного получения этанола (смесь сахаров), приведенной в таблице 2, которую помещают в колбу Эрленмейера емкостью 500 мл, и выращивание в питательной среде проводят при температуре 30°С в течение 24 ч. После извлечения культуральную жидкость дважды промывают с помощью 200 мМ раствора малеатного буфера (рН 5,5). Клетки микроорганизма вновь суспендируют в 200 мМ раствора малеатного буфера (рН 5,5) и гомогенизуют с помощью гомогенизатора шарового типа (0,6 г шариков φ0,5, 4000 об/мин 1 минута × 5 раз), а затем центрифугируют и отделяют полученную надосадочную жидкость, при этом надосадочную жидкость используют в качестве экстракта клеток микроорганизма. Затем 100 мкл экстракта клеток микроорганизма добавляют к 900 мкл 200 мМ раствора малеатного буфера (рН 5,5), дополненного с помощью 20 мМ MgSO₄, 1 мМ CoCl₂, 1 мМ MnCl₂ и 10 мМ ксилозы, и дают реакции протекать при температуре 35°С в течение 2 ч, а затем проводят анализ жидкости методом ВЭЖХ. В результате было показано, что пик ксилозы уменьшается, а пик ксилулозы увеличивается, по сравнению с соответствующими значениями до проведения реакции. Указанным образом можно подтвердить активность изомеразы ксилозы.

(Сравнительный пример 1) Получение этанола путем периодической ферментации с помощью Escherichia coli с использованием гексозы в качестве исходного сырья для ферментации

Штамм Escherichia coli KO11 выращивают в 2 мл прекультуральной среды (20 г/л глюкозы, 10 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л триптона, 5 г/л NaCl) в пробирке при температуре 30°С в течение ночи (препрекультура). Полученную культуральную жидкость инокулируют в 50 мМ прекультуральной среды, помещенной в колбу Эрленмейера емкостью 500 мл, и выращивание в питательной среде проводят в течение ночи (прекультура). Прекультуральную жидкость инокулируют в 1 л среды для ферментативного получения этанола (глюкоза), имеющей состав, приведенный в таблице 3, и порционную ферментацию проводят в течение 16 ч в следующих условиях проведения реакции, контролируя при этом температуру, и получают этанол (таблица 4).

Объем сосуда для выращивания в питательной среде: 2 (л)

Регулирование температуры: 30 (°С)

Kla: 30 (ч^-1)

Регулирование pH: доводят рН до 6 с помощью 5 N раствора Са(OH)₂

Стерилизация: сосуд для выращивания в питательной среде и используемую среду подвергают стерилизации паром в автоклаве под высоким давлением при температуре 121°С в течение 20 мин.

(Сравнительный пример 2) Получение этанола порционной ферментацией с помощью Escherichia coli с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации

Используя среду для ферментативного получения этанола (смесь сахаров), состав которой приведен в таблице 2, в качестве культуральной среды, осуществляют порционное выращивание в питательной среде в течение 33 ч в тех же условиях, что и в сравнительном примере 1, и получают этанол (таблица 4).

(Сравнительный пример 3) Получение этанола непрерывной ферментацией с помощью Escherichia coli с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации

Непрерывную ферментацию проводят, используя смесь сахаров в качестве исходного сырья для ферментации и не используя разделительную мембрану. Штамм Escherichia coli KO11 выращивают в 2 мл прекультуральной среды (20 г/л глюкозы, 10 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л триптона, 5 г/л NaCl) в пробирке при температуре 30°С в течение ночи (предпрепрекультура). Полученную культуральную жидкость инокулируют в 50 мМ прекультуральной среды, помещенной в снабженную перегородкой колбу Эрленмейера емкостью 500 мл, и выращивание в питательной среде проводят в течение ночи (препрекультура). Препрекультуральную жидкость инокулируют в среду для ферментативного получения этанола (смесь сахаров) имеющей состав, приведенный в таблице 2, которая помещена в устройство для непрерывного выращивания в питательной среде (то же устройство, которое показано на фигуре 2 документа WO 2007/097260, за исключением того, что элемент разделительной мембраны удаляют), и порционную ферментацию проводят в течение 33 ч в указанных ниже условиях, контролируя температуру и кислотность среды (прекультура). Сразу же по окончании прекультивирования начинают непрерывную ферментацию для получения этанола. Для подачи среды для ферментативного получения этанола (смеси сахаров), состав которой приведен в таблице 2, и сбора культуральной жидкости, содержащей микроорганизм, используют насос Perista BioMini Pump Type AC-2120 (ATTO) для подачи культуральной среды непосредственно в сосуд для выращивания в питательной среде и сбора культуральной жидкости, содержащей микроорганизм, непосредственно из сосуда для выращивания в питательной среде. Скорость подачи культуральной среды регулируют таким образом, чтобы количество культуральной жидкости в сосуде для выращивания в питательной среде составляло 1,5 л при постоянной скорости отбора культуральной жидкости, содержащей микроорганизм, и получают этанол в течение 300 ч (таблица 4).

Объем сосуда для выращивания в питательной среде: 2 (л)

Регулирование температуры: 30 (°С)

Kla: 30 (ч^-1)

Регулирование pH: доводят рН до 6 с помощью 5 N раствора Са(OH)₂

Скорость отбора ферментативной жидкости: 2 л/день

Стерилизация: сосуд для выращивания в питательной среде и используемую среду подвергают стерилизации паром в автоклаве под высоким давлением при температуре 121°С в течение 20 мин.

(Пример 1) Получение этанола непрерывной ферментацией с помощью Escherichia coli с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации и с использованием разделительной мембраны 1

Используя смесь сахаров в качестве исходного сырья для ферментации, проводят непрерывную ферментацию с использованием разделительной мембраны. Штамм Escherichia coli KO11 выращивают в 2 мл прекультуральной среды (20 г/л глюкозы, 10 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л триптона, 5 г/л NaCl) в пробирке при температуре 30°С в течение ночи (предпрепрекультура). Полученную культуральную жидкость инокулируют в 50 мМ прекультуральной среды, помещенной в снабженную перегородкой колбу Эрленмейера емкостью 500 мл, и выращивание в питательной среде проводят в течение ночи (препрекультура). Препрекультуральную жидкость инокулируют в среду для ферментативного получения этанола (смесь сахаров), имеющей состав, приведенный в таблице 2, которая помещена в ферментер непрерывного действия, снабженный интегрированной мембраной, параметры которого приведены ниже (то же устройство, которое показано на фигуре 2 документа WO 2007/097260), и порционную ферментацию проводят в течение 24 ч в указанных ниже условиях, контролируя температуру и кислотность среды (прекультура). Сразу же по окончании прекультивирования начинают непрерывную ферментацию для получения этанола. Для подачи среды для ферментативного получения этанола (смеси сахаров), состав которой приведен в таблице 2, и фильтрации культуральной жидкости используют насос Perista BioMini Pump Type AC-2120 (ATTO). Культуральную среду непосредственно подают в сосуд для выращивания в питательной среде, а культуральную жидкость отфильтровывают через элемент, имеющий неподвижную разделительную мембрану. Скорость подачи культуральной среды регулируют таким образом, чтобы количество культуральной жидкости в сосуде для выращивания в питательной среде составляло 1,5 л при постоянной скорости фильтрации культуральной жидкости, а трансмембранное давление в процессе фильтрации может меняться в диапазоне от 0,1 до 19,8 кПа, и проводят непрерывную ферментацию в течение 290 ч для получения этанола (таблица 4).

Объем сосуда для выращивания в питательной среде: 2 (л)

Используемая разделительная мембрана: фильтрационная мембрана из поливинилиденфторида

Эффективная площадь фильтрации разделительного элемента мембраны: 120 см²

Коэффициент проницаемости разделительной мембраны для чистой воды: 50×10^-9 м³/м²/с/Па

Средний размер пор разделительной мембраны: 0,1 мкм

Стандартное отклонение среднего размера пор: ±0,035 мкм

Шероховатость поверхности разделительной мембраны: 0,06 мкм

Регулирование температуры: 30 (°С)

Kla: 30 (ч^-1)

Регулирование pH: доводят рН до 6 с помощью 5 N раствора Са(OH)₂

Скорость отбора ферментативной жидкости: 2 л/день

Стерилизация: сосуд для выращивания в питательной среде, снабженный элементом разделительной мембраны, и используемую среду подвергают стерилизации паром в автоклаве под высоким давлением при температуре 121°С в течение 20 мин.

(Пример 2) Получение этанола непрерывной ферментацией с помощью Escherichia coli с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации и с использованием разделительной мембраны 2

Используя штамм Escherichia coli KO11, проводят непрерывную ферментацию с использованием разделительной мембраны. Непрерывную ферментацию осуществляют в течение 300 ч в тех же условиях, что и в примере 1, за исключением того, что значение Kla равно 0, и получают этанол (таблица 4).

(Пример 3) Получение этанола непрерывной ферментацией с помощью Escherichia coli с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации и с использованием разделительной мембраны 3

Используя штамм Escherichia coli KO11, проводят непрерывную ферментацию с использованием разделительной мембраны. Непрерывную ферментацию осуществляют в течение 280 ч в тех же условиях, что и в примере 1, за исключением того, что значение Kla устанавливают равным 60, и получают этанол (таблица 4).

(Пример 4) Получение этанола непрерывной ферментацией с помощью Escherichia coli с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации и с использованием разделительной мембраны 4

Используя штамм Escherichia coli KO11, проводят непрерывную ферментацию с использованием разделительной мембраны. Непрерывную ферментацию осуществляют в течение 290 ч в тех же условиях, что и в примере 1, за исключением того, что значение Kla устанавливают равным 100, и получают этанол (таблица 4).

(Пример 5) Получение этанола непрерывной ферментацией с помощью Escherichia coli с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации и с использованием разделительной мембраны 5

Используя штамм Escherichia coli KO11, проводят непрерывную ферментацию с использованием разделительной мембраны. Непрерывную ферментацию осуществляют в течение 270 ч в тех же условиях, что и в примере 1, за исключением того, что значение Kla устанавливают равным 150, и получают этанол (таблица 4).

(Справочный пример 5) Определение активности изомеразы ксилозы в Paenibacillus polymyxa

Штамм Paenibacillus polymyxa ATCC12321 инокулируют в 5 мл прекультуральной среды (5 г/л глюкозы, 5 г/л пептона, 3 г/л дрожжевого экстракта, 3 г/л экстракта солода) с помощью платиновой петли и выращивание в питательной среде проводят при температуре 30°С в течение ночи (прекультура). На следующий день прекультуральную жидкость инокулируют в 50 мл среды для ферментативного получения 2,3-бутандиола (смесь сахаров), приведенной в таблице 5, которую помещают в колбу Эрленмейера емкостью 500 мл, и выращивание в питательной среде проводят при температуре 30°С в течение 24 ч. После извлечения культуральную жидкость дважды промывают с помощью 200 мМ раствора малеатного буфера (рН 5,5). Клетки микроорганизма вновь суспендируют в 200 мМ раствора малеатного буфера (рН 5,5) и гомогенизуют с помощью гомогенизатора шарового типа (0,6 г шариков φ 0,5, 4000 об/мин 1 минута × 5 раз), а затем центрифугируют и отделяют полученную надосадочную жидкость, при этом надосадочную жидкость используют в качестве экстракта клеток микроорганизма. Затем 100 мкл экстракта клеток микроорганизма добавляют к 900 мкл 200 мМ раствора малеатного буфера (рН 5,5), дополненного с помощью 20 мМ MgSO₄, 1 мМ CoCl₂, 1 мМ MnCl₂ и 10 мМ ксилозы, и дают реакции протекать при температуре 35°С в течение 2 ч, а затем проводят анализ жидкости методом ВЭЖХ. В результате было показано, что пик ксилозы уменьшается, а пик ксилулозы увеличивается, по сравнению с соответствующими значениями до проведения реакции. Указанным образом можно подтвердить активность изомеразы ксилозы.

(Сравнительный пример 4) Получение 2,3-бутандиола порционной ферментацией с помощью Paenibacillus polymyxa с использованием гексозы в качестве исходного сырья для ферментации

Штамм Paenibacillus polymyxa ATCC12321 выращивают в 2 мл прекультуральной среды (5 г/л глюкозы, 5 г/л пептона, 3 г/л дрожжевого экстракта, 3 г/л экстракта солода) в пробирке при температуре 30°С в течение ночи (препрекультура). Полученную культуральную жидкость инокулируют в 50 мМ прекультуральной среды, помещенной в снабженную перегородкой колбу Эрленмейера емкостью 500 мл, и выращивание в питательной среде проводят в течение ночи (прекультура). Прекультуральную жидкость инокулируют в 1 л среды для ферментативного получения 2,3-бутандиола (глюкоза), состав которой приведен в таблице 6, и порционное выращивание в питательной среде проводят в течение 27 ч в приведенных ниже условиях, контролируя температуру и рН среды, и получают 2,3-бутандиол (таблица 8)

Объем сосуда для выращивания в питательной среде: 2 (л)

Регулирование температуры: 30 (°С)

Kla: 30 (ч^-1)

Регулирование pH: доводят рН до 6,5 с помощью 5 N раствора Са(OH)₂

Стерилизация: ферментер и используемую среду подвергают стерилизации паром в автоклаве под высоким давлением при температуре 121°С в течение 20 мин.

(Сравнительный пример 5) Получение 2,3-бутандиола порционной ферментацией с помощью Paenibacillus polymyxa с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации

Используя среду для ферментативного получения 2,3-бутандиола (смесь сахаров), состав которой приведен в таблице 5, в качестве культуральной среды, осуществляют порционное выращивание в питательной среде в течение 50 ч в тех же условиях, что и в сравнительном примере 4, и получают 2,3-бутандиол (таблица 8).

(Сравнительный пример 6) Получение 2,3-бутандиола непрерывной ферментацией с помощью Paenibacillus polymyxa с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации

Непрерывную ферментацию проводят, используя смесь сахаров в качестве исходного сырья для ферментации и не используя разделительную мембрану. Штамм Paenibacillus polymyxa ATCC12321 выращивают в 2 мл прекультуральной среды (5 г/л глюкозы, 5 г/л пептона, 3 г/л дрожжевого экстракта, 3 г/л экстракта солода) в пробирке при температуре 30°С в течение ночи (предпрепрекультура). Полученную культуральную жидкость инокулируют в 50 мМ прекультуральной среды, помещенной в снабженную перегородкой колбу Эрленмейера емкостью 500 мл, и выращивание в питательной среде проводят в течение ночи (препрекультура). Препрекультуральную жидкость инокулируют в среду 1 для ферментативного получения 2,3-бутандиола (смесь сахаров), имеющей состав, приведенный в таблице 5, которая помещена в устройство для непрерывного выращивания в питательной среде (то же устройство, которое показано на фигуре 2 документа WO 2007/097260, за исключением того, что элемент разделительной мембраны удаляют), и порционную ферментацию проводят в течение 30 ч в указанных ниже условиях, контролируя температуру и рН среды (прекультура). Сразу же по окончании прекультивирования начинают непрерывную ферментацию для получения 2,3-бутандиола. Для подачи среды 2 для ферментативного получения 2,3-бутандиола (смеси сахаров), состав которой приведен в таблице 7, и сбора культуральной жидкости, содержащей микроорганизм, используют насос Perista BioMini Pump Type AC-2120 (ATTO) для подачи культуральной среды непосредственно в сосуд для выращивания в питательной среде и сбора культуральной жидкости, содержащей микроорганизм, непосредственно из сосуда для выращивания в питательной среде. Скорость подачи культуральной среды регулируют таким образом, чтобы количество культуральной жидкости в сосуде для выращивания в питательной среде составляло 1,5 л при постоянной скорости отбора культуральной жидкости, содержащей микроорганизм, и получение 2,3-бутандиола осуществляют течение 280 ч (таблица 8).

Объем сосуда для выращивания в питательной среде: 2 (л)

Регулирование температуры: 30 (°С)

Kla: 30 (ч^-1)

Регулирование pH: доводят рН до 6,5 с помощью 5 N раствора Са(OH)₂

Скорость отбора ферментативной жидкости: 1 л/день

Стерилизация: ферментер и используемую среду подвергают стерилизации паром в автоклаве под высоким давлением при температуре 121°С в течение 20 мин.

(Пример 6) Получение 2,3-бутандиола непрерывной ферментацией с помощью Paenibacillus polymyxa с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации и с использованием разделительной мембраны 1

Непрерывную ферментацию проводят, используя смесь сахаров в качестве исходного сырья для ферментации, с использованием разделительной мембраны. Штамм Paenibacillus polymyxa ATCC12321 выращивают в 2 мл прекультуральной среды (5 г/л глюкозы, 5 г/л пептона, 3 г/л дрожжевого экстракта, 3 г/л экстракта солода) в пробирке при температуре 30°С в течение ночи (предпрепрекультура). Полученную культуральную жидкость инокулируют в 50 мМ прекультуральной среды, помещенной в снабженную перегородкой колбу Эрленмейера емкостью 500 мл, и выращивание в питательной среде проводят в течение ночи (препрекультура). Препрекультуральную жидкость инокулируют в среду 1 для ферментативного получения 2,3-бутандиола (смесь сахаров), имеющей состав, приведенный в таблице 5, которая помещена в устройство для непрерывного выращивания в питательной среде (устройство, приведенное на фиг. 2 документа WO 2007/097260), и порционную ферментацию проводят в течение 30 ч в указанных ниже условиях, контролируя температуру и рН среды (прекультура). Сразу же по окончании прекультивирования начинают непрерывную ферментацию для получения 2,3-бутандиола. Для подачи среды 2 для ферментативного получения 2,3-бутандиола (смеси сахаров), состав которой приведен в таблице 7, и сбора культуральной жидкости используют насос Perista BioMini Pump Type AC-2120 (ATTO). Культуральную среду непосредственно подают в сосуд для выращивания в питательной среде, а культуральную жидкость отфильтровывают через элемент, имеющий неподвижную разделительную мембрану. Скорость подачи культуральной среды регулируют таким образом, чтобы количество культуральной жидкости в сосуде для выращивания в питательной среде составляло 1,5 л при постоянной скорости фильтрации культуральной жидкости, а трансмембранное давление в процессе фильтрации менялось в диапазоне от 0,1 до 19,4 кПа, и непрерывную ферментацию для получения 2,3-бутандиола проводят в течение 280 ч (таблица 8).

Объем сосуда для выращивания в питательной среде: 2 (л)

Используемая разделительная мембрана: фильтрационная мембрана из поливинилиденфторида

Эффективная площадь фильтрации разделительного элемента мембраны: 120 см²

Коэффициент проницаемости разделительной мембраны для чистой воды: 50×10^-9 м³/м²/с/Па

Средний размер пор разделительной мембраны: 0,1±0,035 мкм

Шероховатость поверхности разделительной мембраны: 0,06 мкм

Регулирование температуры: 30 (°С)

Kla: 30 (ч^-1)

Регулирование pH: доводят рН до 6,5 с помощью 5 N раствора Са(OH)₂

Скорость отбора ферментативной жидкости: 1 л/день

Стерилизация: ферментер, снабженный элементом разделительной мембраны, и используемую среду подвергают стерилизации паром в автоклаве под высоким давлением при температуре 121°С в течение 20 мин.

(Пример 7) Получение 2,3-бутандиола непрерывной ферментацией с помощью Paenibacillus polymyxa с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации и с использованием разделительной мембраны 2

Используя штамм Paenibacillus polymyxa ATCC12321, проводят непрерывную ферментацию с использованием разделительной мембраны. Непрерывную ферментацию осуществляют в течение 300 ч в тех же условиях, что и в примере 6, за исключением того, что значение Kla устанавливают равным 0, и получают 2,3-бутандиол (таблица 8).

(Пример 8) Получение 2,3-бутандиола непрерывной ферментацией с помощью Paenibacillus polymyxa с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации и с использованием разделительной мембраны 3

Используя штамм Paenibacillus polymyxa ATCC12321, проводят непрерывную ферментацию с использованием разделительной мембраны. Непрерывную ферментацию осуществляют в течение 270 ч в тех же условиях, что и в примере 6, за исключением того, что значение Kla устанавливают равным 60, и получают 2,3-бутандиол (таблица 8).

(Пример 9) Получение 2,3-бутандиола непрерывной ферментацией с помощью Paenibacillus polymyxa с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации и с использованием разделительной мембраны 4

Используя штамм Paenibacillus polymyxa ATCC12321, проводят непрерывную ферментацию с использованием разделительной мембраны. Непрерывную ферментацию осуществляют в течение 280 ч в тех же условиях, что и в примере 6, за исключением того, что значение Kla устанавливают равным 100, и получают 2,3-бутандиол (таблица 8).

(Пример 10) Получение 2,3-бутандиола непрерывной ферментацией с помощью Paenibacillus polymyxa с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации и с использованием разделительной мембраны 5

Используя штамм Paenibacillus polymyxa ATCC12321, проводят непрерывную ферментацию с использованием разделительной мембраны. Непрерывную ферментацию осуществляют в течение 270 ч в тех же условиях, что и в примере 6, за исключением того, что значение Kla устанавливают равным 150, и получают 2,3-бутандиол (таблица 8).

(Справочный пример 6) Определение активности изомеразы ксилозы в Bacillus coagulans

Штамм Bacillus coagulans NBRC12714 инокулируют в 5 мл прекультуральной среды (10 г/л полипептона, 2 г/л дрожжевого экстракта, 1 г/л сульфата магния 7Н₂О, 30 г/л карбоната кальция) с помощью платиновой петли и выращивание в питательной среде проводят при температуре 50°С в течение ночи (прекультура). На следующий день прекультуральную жидкость инокулируют в 50 мл среды для ферментативного получения L-молочной кислоты (смесь сахаров), приведенной в таблице 5 и дополненной с помощью 30 г/л карбоната кальция, которую помещают в колбу Эрленмейера емкостью 500 мл, и выращивание в питательной среде проводят при температуре 50°С в течение 24 ч. После извлечения культуральную жидкость дважды промывают с помощью 200 мМ раствора малеатного буфера (рН 5,5). Клетки микроорганизма вновь суспендируют в 200 мМ раствора малеатного буфера (рН 5,5) и гомогенизуют с помощью гомогенизатора шарового типа (0,6 г шариков φ0,5, 4000 об/мин 1 минута × 5 раз), а затем центрифугируют и отделяют полученную надосадочную жидкость, при этом надосадочную жидкость используют в качестве экстракта клеток микроорганизма. Затем 100 мкл экстракта клеток микроорганизма добавляют к 900 мкл 200 мМ раствора малеатного буфера (рН 5,5), дополненного с помощью 20 мМ MgSO₄, 1 мМ CoCl₂, 1 мМ MnCl₂ и 10 мМ ксилозы, и дают реакции протекать при температуре 35°С в течение 2 ч, а затем проводят анализ жидкости методом ВЭЖХ. В результате было показано, что пик ксилозы уменьшается, а пик ксилулозы увеличивается, по сравнению с соответствующими значениями до проведения реакции. Указанным образом можно подтвердить активность изомеразы ксилозы.

(Сравнительный пример 7) Получение L-молочной кислоты порционной ферментацией с помощью Bacillus coagulans с использованием гексозы в качестве исходного сырья для ферментации

Штамм Bacillus coagulans NBRC12714 инокулируют в 2 мл прекультуральной среды (10 г/л полипептона, 2 г/л дрожжевого экстракта, 1 г/л сульфата магния 7Н₂О, 30 г/л карбоната кальция) в пробирке при температуре 50°С в течение ночи (препрекультура). Полученную культуральную жидкость инокулируют в 50 мМ прекультуральной среды, помещенной в снабженную перегородкой колбу Эрленмейера емкостью 500 мл, и выращивание в питательной среде проводят в течение ночи (прекультура). Прекультуральную жидкость инокулируют в 1 л среды для ферментативного получения L-молочной кислоты (глюкоза), состав которой приведен в таблице 10, и порционное выращивание в питательной среде проводят в течение 96 ч в приведенных ниже условиях, контролируя температуру и рН среды, и получают L-молочную кислоту (таблица 13).

Объем сосуда для выращивания в питательной среде: 2 (л)

Регулирование температуры: 50 (°С)

Kla: 30 (ч^-1)

Регулирование pH: доводят рН до 7 с помощью 5 N раствора Са(OH)₂

Стерилизация: ферментер и используемую среду подвергают стерилизации паром в автоклаве под высоким давлением при температуре 121°С в течение 20 мин.

(Сравнительный пример 8) Получение L-молочной кислоты порционной ферментацией с помощью Bacillus coagulans с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации

Используя среду для ферментативного получения L-молочной кислоты (смесь сахаров), состав которой приведен в таблице 9, в качестве культуральной среды, осуществляют порционное выращивание в питательной среде в течение 128 ч в тех же условиях, что и в сравнительном примере 7, и получают L-молочную кислоту (таблица 13).

(Сравнительный пример 9) Получение L-молочной кислоты непрерывной ферментацией с помощью Bacillus coagulans с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации

Непрерывную ферментацию проводят, используя смесь сахаров в качестве исходного сырья для ферментации и не используя разделительную мембрану. Штамм Bacillus coagulans NBRC12714 выращивают в 2 мл прекультуральной среды (10 г/л полипептона, 2 г/л дрожжевого экстракта, 1 г/л сульфата магния 7Н₂О, 30 г/л карбоната кальция) в пробирке при температуре 50°С в течение ночи (предпрепрекультура). Полученную культуральную жидкость инокулируют в 50 мМ прекультуральной среды, помещенной в снабженную перегородкой колбу Эрленмейера емкостью 500 мл, и выращивание в питательной среде проводят в течение ночи (препрекультура). Препрекультуральную жидкость инокулируют в среду для ферментативного получения L-молочной кислоты (смесь сахаров), имеющей состав, приведенный в таблице 9, которая помещена в устройство для непрерывного выращивания в питательной среде (то же устройство, которое показано на фиг. 2 документа WO 2007/097260, за исключением того, что элемент разделительной мембраны удаляют), и порционную ферментацию проводят в течение 124 ч в указанных ниже условиях, контролируя температуру и рН среды (прекультура). Сразу же по окончании прекультивирования начинают непрерывную ферментацию для получения L-молочной кислоты. Для подачи среды 2 для ферментативного получения L-молочной кислоты (смеси сахаров), состав которой приведен в таблице 9, и сбора культуральной жидкости, содержащей микроорганизм, используют насос Perista BioMini Pump Type AC-2120 (ATTO) для подачи культуральной среды непосредственно в сосуд для выращивания в питательной среде и сбора культуральной жидкости, содержащей микроорганизм, непосредственно из сосуда для выращивания в питательной среде. Скорость подачи культуральной среды регулируют таким образом, чтобы количество культуральной жидкости в сосуде для выращивания в питательной среде составляло 1,5 л при постоянной скорости отбора культуральной жидкости, содержащей микроорганизм, и получение L-молочной кислоты осуществляют течение 300 ч (таблица 13).

Объем сосуда для выращивания в питательной среде: 2 (л)

Регулирование температуры: 50 (°С)

Kla: 30 (ч^-1)

Регулирование pH: доводят рН до 7 с помощью 5 N раствора Са(OH)₂

Скорость отбора ферментативной жидкости: 1 л/день

Стерилизация: ферментер и используемую среду подвергают стерилизации паром в автоклаве под высоким давлением при температуре 121°С в течение 20 мин.

(Пример 11) Получение L-молочной кислоты непрерывной ферментацией с помощью Bacillus coagulans с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации и с использованием разделительной мембраны 1

Непрерывную ферментацию проводят, используя смесь сахаров в качестве исходного сырья для ферментации, с использованием разделительной мембраны. Штамм Bacillus coagulans NBRC12714 выращивают в 2 мл прекультуральной среды (10 г/л полипептона, 2 г/л дрожжевого экстракта, 1 г/л сульфата магния 7Н₂О, 30 г/л карбоната кальция) в пробирке при температуре 50°С в течение ночи (предпрепрекультура). Полученную культуральную жидкость инокулируют в 50 мМ прекультуральной среды, помещенной в снабженную перегородкой колбу Эрленмейера емкостью 500 мл, и выращивание в питательной среде проводят в течение ночи (препрекультура). Препрекультуральную жидкость инокулируют в среду для ферментативного получения L-молочной кислоты (смесь сахаров), имеющей состав, приведенный в таблице 9, которая помещена в устройство для непрерывного выращивания в питательной среде (устройство, приведенное на фиг. 2 документа WO 2007/097260), и порционную ферментацию проводят в течение 126 ч в указанных ниже условиях, контролируя температуру и рН среды (прекультура). Сразу же по окончании прекультивирования начинают непрерывную ферментацию для получения L-молочной кислоты. Для подачи среды 1 для ферментативного получения L-молочной кислоты (смеси сахаров), состав которой приведен в таблице 9, и сбора культуральной жидкости используют насос Perista BioMini Pump Type AC-2120 (ATTO). Культуральную среду непосредственно подают в сосуд для выращивания в питательной среде, а культуральную жидкость отфильтровывают через элемент, имеющий неподвижную разделительную мембрану. Скорость подачи культуральной среды регулируют таким образом, чтобы количество культуральной жидкости в сосуде для выращивания в питательной среде составляло 1,5 л при постоянной скорости фильтрации культуральной жидкости, а трансмембранное давление в процессе фильтрации менялось в диапазоне от 0,1 до 19,7 кПа, и непрерывную ферментацию для получения L-молочной кислоты проводят в течение 290 ч (таблица 13).

Объем сосуда для выращивания в питательной среде: 2 (л)

Используемая разделительная мембрана: фильтрационная мембрана из поливинилиденфторида

Эффективная площадь фильтрации разделительного элемента мембраны: 120 см²

Коэффициент проницаемости разделительной мембраны для чистой воды: 50×10^-9 м³/м²/с/Па

Средний размер пор разделительной мембраны: 0,1 ± 0,035 мкм

Шероховатость поверхности разделительной мембраны: 0,06 мкм

Регулирование температуры: 50 (°С)

Kla: 30 (ч^-1)

Регулирование pH: доводят рН до 7 с помощью 5 N раствора Са(OH)₂

Скорость отбора ферментативной жидкости: 3 л/день

Стерилизация: ферментер, снабженный элементом разделительной мембраны, и используемую среду подвергают стерилизации паром в автоклаве под высоким давлением при температуре 121°С в течение 20 мин.

(Пример 12) Получение L-молочной кислоты непрерывной ферментацией с помощью Bacillus coagulans с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации и с использованием разделительной мембраны 2

Используя штамм Bacillus coagulans NBRC12714, проводят непрерывную ферментацию с использованием разделительной мембраны. Непрерывную ферментацию осуществляют в течение 280 ч в тех же условиях, что и в примере 11, за исключением того, что значение Kla устанавливают равным 0, и получают L-молочную кислоту (таблица 13).

(Пример 13) Получение L-молочной кислоты непрерывной ферментацией с помощью Bacillus coagulans с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации и с использованием разделительной мембраны 3

Используя штамм Bacillus coagulans NBRC12714, проводят непрерывную ферментацию с использованием разделительной мембраны. Непрерывную ферментацию осуществляют в течение 270 ч в тех же условиях, что и в примере 11, за исключением того, что значение Kla устанавливают равным 60, и получают L-молочную кислоту (таблица 13).

(Пример 14) Получение L-молочной кислоты непрерывной ферментацией с помощью Bacillus coagulans с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации и с использованием разделительной мембраны 4

Используя штамм Bacillus coagulans NBRC12714, проводят непрерывную ферментацию с использованием разделительной мембраны. Непрерывную ферментацию осуществляют в течение 300 ч в тех же условиях, что и в примере 11, за исключением того, что значение Kla устанавливают равным 100, и получают L-молочную кислоту (таблица 13).

(Пример 15) Получение L-молочной кислоты непрерывной ферментацией с помощью Bacillus coagulans с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации и с использованием разделительной мембраны 5

Используя штамм Bacillus coagulans NBRC12714, проводят непрерывную ферментацию с использованием разделительной мембраны. Непрерывную ферментацию осуществляют в течение 290 ч в тех же условиях, что и в примере 11, за исключением того, что значение Kla устанавливают равным 150, и получают L-молочную кислоту (таблица 13).

(Пример 16) Непрерывное выращивание в питательной среде Bacillus coagulans с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации и с использованием разделительной мембраны 6

Используя среду 2 для ферментативного получения молочной кислоты (смесь сахаров), приведенную в таблице 11, непрерывное выращивание в питательной среде осуществляют в течение 305 ч в тех же условиях, что и в примере 12, с использованием разделительной мембраны и получают L-молочную кислоту (таблица 13).

(Пример 17) Непрерывное выращивание в питательной среде Bacillus coagulans с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации и с использованием разделительной мембраны 7

Используя среду 3 для ферментативного получения молочной кислоты (смесь сахаров), приведенную в таблице 12, непрерывное выращивание в питательной среде осуществляют в течение 300 ч в тех же условиях, что и в примере 12, с использованием разделительной мембраны, и получают L-молочную кислоту (таблица 13).

(Сравнительный пример 10) Получение этанола порционной ферментацией с помощью Escherichia coli с использованием сахарного сиропа, полученного из биомассы, в качестве исходного сырья для ферментации

Ферментацию проводят с использованием сахарного сиропа, полученного из биомассы, в качестве сырья для ферментации. Для приготовления ферментативной среды используют жидкость, которую готовят путем осахаривания целлюлозы с использованием нанофильтрационной мембраны по способу получения, раскрытому в примере 2 документа WO 2010/067785, и состав ферментативной среды подбирают, как указано в таблице 14, используя соответствующие реагенты. Порционную ферментацию проводят в течение 24 ч в тех же условиях, что и в сравнительном примере 2, за исключением того, что для регулирования рН используют 4 N раствор KOH, и получают этанол (таблица 17).

(Сравнительный пример 11) Получение этанола непрерывной ферментацией с помощью Escherichia coli с использованием сахарного сиропа, полученного из биомассы, в качестве исходного сырья для ферментации

Непрерывную ферментацию проводят с использованием сахарного сиропа, полученного из биомассы, в качестве сырья для ферментации, без использования разделительной мембраны. Для приготовления ферментативной среды используют жидкость, которую получают путем осахаривания целлюлозы, используя нанофильтрационную мембрану, по способу получения, раскрытому в примере 2 документа WO 2010/067785. Соответствующие реагенты используют для приготовления среды 1 для ферментативного получения этанола (сахарный сироп), приведенной в таблице 14, в качестве прекультуральной среды и среды 2 для ферментативного получения этанола (сахарный сироп), приведенной в таблице 15, в качестве культуральной среды, используемой при непрерывном выращивании в питательной среде. Непрерывную ферментацию проводят в течение 280 ч в тех же условиях, что и в сравнительном примере 3, за исключением того, что для регулирования рН используют 4 N раствор KOH, и получают этанол (таблица 17).

(Пример 18) Получение этанола непрерывной ферментацией с помощью Escherichia coli с использованием сахарного сиропа, полученного из биомассы, в качестве исходного сырья для ферментации и с использованием разделительной мембраны

Непрерывную ферментацию проводят с использованием сахарного сиропа, полученного из биомассы, в качестве сырья для ферментации, и с использованием разделительной мембраны. Как и ранее в сравнительном примере 17, среду 1 для ферментативного получения этанола (сахарный сироп), приведенную в таблице 14, используют в качестве прекультуральной среды и, как и ранее в сравнительном примере 17, среду 2 для ферментативного получения этанола (сахарный сироп), приведенную в таблице 15, используют в качестве культуральной среды при непрерывном выращивании в питательной среде. Непрерывную ферментацию проводят в течение 290 ч в тех же условиях, что и в примере 1, за исключением того, что для регулирования рН используют 4 N раствор KOH, и получают этанол (таблица 17).

(Сравнительный пример 12) Получение L-молочной кислоты порционной ферментацией с помощью Bacillus coagulans с использованием сахарного сиропа, полученного из биомассы, в качестве исходного сырья для ферментации

Ферментацию проводят с использованием сахарного сиропа, полученного из биомассы, в качестве сырья для ферментации. Для приготовления ферментативной среды используют жидкость, которую готовят путем осахаривания целлюлозы с использованием нанофильтрационной мембраны по способу получения, раскрытому в примере 2 документа WO 2010/067785, и состав ферментативной среды подбирают, как указано в таблице 16, используя соответствующие реагенты. Порционную ферментацию проводят в течение 70 ч в тех же условиях, что и в сравнительном примере 8, за исключением того, что для регулирования рН используют 4 N раствор KOH, а значение Kla устанавливаю равным 0 (ч^-1), и получают L-молочную кислоту (таблица 17).

(Сравнительный пример 13) Получение L-молочной кислоты непрерывной ферментацией с помощью Bacillus coagulans с использованием сахарного сиропа, полученного из биомассы, в качестве исходного сырья для ферментации

Непрерывную ферментацию проводят с использованием сахарного сиропа, полученного из биомассы, в качестве сырья для ферментации и с использованием разделительной мембраны. Аналогично сравнительному примеру 12, в качестве ферментативной среды используют культуральную среду, приведенную в таблице 16. Непрерывную ферментацию проводят в течение 250 ч в тех же условиях, что и в сравнительном примере 9, за исключением того, что для регулирования рН используют 4 N раствор KOH, а значение Kla устанавливаю равным 0 (ч^-1), и получают L-молочную кислоту (таблица 17).

(Пример 19) Получение L-молочной кислоты непрерывной ферментацией с помощью Bacillus coagulans с использованием сахарного сиропа, полученного из биомассы, в качестве исходного сырья для ферментации и с использованием разделительной мембраны

Непрерывную ферментацию проводят с использованием сахарного сиропа, полученного из биомассы, в качестве сырья для ферментации и с использованием разделительной мембраны. Аналогично сравнительному примеру 12, в качестве ферментативной среды используют культуральную среду, приведенную в таблице 16. Непрерывную ферментацию проводят в течение 260 ч в тех же условиях, что и в сравнительном примере 11, за исключением того, что для регулирования рН используют 4 N раствор KOH, а значение Kla устанавливаю равным 0 (ч^-1), и получают L-молочную кислоту (таблица 17).

(Пример 20) Получение 2,3-бутандиола непрерывной ферментацией с помощью Paenibacillus polymyxa с использованием смеси сахаров в качестве исходного сырья для ферментации и с использованием керамической разделительной мембраны 6

Непрерывную ферментацию проводят, используя штамм Paenibacillus polymyxa ATCC12321 и керамическую разделительную мембрану. Штамм Paenibacillus polymyxa ATCC12321 выращивают в 2 мл прекультуральной среды (5 г/л глюкозы, 5 г/л пептона, 3 г/л дрожжевого экстракта, 3 г/л экстракта солода) в пробирке при температуре 30°С в течение ночи (предпрепрекультура). Полученную культуральную жидкость инокулируют в 50 мМ прекультуральной среды, помещенной в снабженную перегородкой колбу Эрленмейера емкостью 500 мл, и выращивание в питательной среде проводят в течение ночи (препрекультура). Препрекультуральную жидкость инокулируют в среду 1 для ферментативного получения 2,3-бутандиола (смесь сахаров), имеющей состав, приведенный в таблице 5, которая помещена в устройство для непрерывного выращивания в питательной среде (устройство, приведенное на фигуре 2 документа WO 2007/097260), и порционную ферментацию проводят в течение 30 ч в указанных ниже условиях, контролируя температуру и рН среды (прекультура). Сразу же по окончании прекультивирования начинают непрерывную ферментацию для получения 2,3-бутандиола, используя среду 2 для ферментативного получения 2,3-бутандиола (смесь сахаров), имеющую состав, приведенный в таблице 7. Трансмембранное давление в процессе фильтрации регулируют таким образом, чтобы оно не превышало 500 кПа, и непрерывную ферментацию проводят в течение 260 ч, получая 2,3-бутандиол (таблица 17).

Объем ферментера: 2 (л)

Используемая разделительная мембрана: Celfit микрофильтрации мембраны Monolith φ4-19 (NGK Insulators, Ltd.)

Длина мембранного разделительного элемента: 500 мм

Средний размер пор разделительной мембраны: 0,1 мкм

Регулирование температуры: 30 (°С)

Kla: 30 (ч^-1)

Регулирование pH: доводят рН до 6,5 с помощью 5 N раствора Са(OH)₂

Скорость отбора ферментативной жидкости: 0,7 л/день

Как показывают представленные выше результаты, химические вещества могут быть с высоким выходом получены из смешанных сахаров пентоз и гексоз.

ПРИМЕНИМОСТЬ В ПРОМЫШЛЕННОСТИ

Применение настоящего изобретения позволяет значительно повысить эффективность ферментативного получения различных химических веществ с использованием исходного сырья для ферментации, содержащего гексозы и пентозы.