Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ АНАЛИЗА ЦИТОХРОМА С В ИНТАКТНЫХ МИТОХОНДРИЯХ С ПОМОЩЬЮ СПЕКТРОСКОПИИ ГИГАНТСКОГО КОМБИНАЦИОННОГО РАССЕИВАНИЯ НА НАНОСТРУКТУРИРОВАННЫХ ПОКРЫТИЯХ

Область техники

Изобретение относится к области медицинской диагностики и биоаналитических исследований, может быть применено для анализа цитохрома C в интактных митохондриях, изолированных из различных тканей, взятых путем биопсии.

Уровень техники

Спектроскопия гигантского комбинационного рассеяния (ГКР-спектроскопия) с использованием наноструктурированных материалов на основе серебра находит применение в самых разных областях, связанных с обнаружением единичных клеток и биологических молекул при наномолярных концентрациях. Важным направлением биомедицинской диагностики с использованием ГКР-спектроскопии является исследование молекул в составе живых клеток и клеточных структур, в частности цитохромов электронно-транспортной цепи (ЭТЦ) митохондрий. Конформация и окислительно-восстановительное состояние цитохромов ЭТЦ митохондрий динамически меняются в зависимости от активности электронного транспорта и синтеза АТФ, и, в свою очередь, патологические нарушения в структуре и свойствах цитохромов могут привести к нарушениям работы ЭТЦ и замедлению и/или прекращению синтеза АТФ. Изменения свойств цитохромов могут быть вызваны как изменениями в ионном составе цитоплазмы и митохондриальном межмембранном пространстве, так и различными заболеваниями (сахарным диабетом, сердечно-сосудистыми патологиями, генетическими нарушениями и проч.). Известно, что ЭТЦ митохондрий содержит цитохромы типов A, C и B. Традиционная спектроскопия КР при исследовании митохондрий с использованием зеленых и синих лазеров позволяет зарегистрировать спектры КР только от восстановленных форм цитохромов C и B-типов, а при использовании лазера 633 нм - от восстановленной формы цитохромов типа A. Окисленные формы цитохромов обладают КР низкой интенсвности, в 20-50 раз меньшей, чем у восстановленных форм. Поэтому при изучении интактных митохондрий методом традиционной КР спектроскопии невозможно получить информацию об окисленных цитохромах. При этом в функционирующих митохондриях в ЭТЦ содержатся преимущественно окисленные переносчики электронов и, в том числе, окисленные цитохромы. В связи с этим необходимо усиление сигнала КР от обеих форм цитохромов - окисленной и восстановленной. В ЭТЦ митохондрий все цитохромы, кроме цитохрома C, являются компонентами трансмембранных комплексов внутренней мембраны. Цитохром C локализован в межмембранном пространстве и при переносе электрона от комплекса III к комплексу IV осуществляет двух- и трехмерную диффузии между митохондриальными мембранами. В случае ГКР-спектроскопии митохондрий усиление сигнала происходит от цитохрома C, так как он находится в большей близости от поверхности митохондрий и наночастиц покрытий. Таким образом, по спектрам ГКР митохондрий можно судить о конформации и окислительно-восстановительном состоянии цитохрома C. Известно, что нормальное функционирование митохондрий, а также их патологии, связанные с генерацией активных форм кислорода и нарушением транспорта электронов в ЭТЦ связаны с динамически меняющимся окислительно-восстановительным состоянием комплексов ЭТЦ и, во многом, с состоянием цитохрома C (Nicholls, D.G. & Ferguson, S.J. Bioenergetics. Waltham, MA: Academic Press Elsevier Science Ltd. 2002; Murphy, M.P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem. J., 2009. 417: p. 1-13). Существующие в настоящее время подходы и методы исследования митохондрий не позволяют проводить анализ окислительно-восстановительного состояния и конформации цитохрома C в интактных функционирующих митохондриях. При этом исследование изменений, происходящих с цитохромом C как при нормальном, так и патологическом функционировании ЭТЦ митохондрий, необходимо как для понимания фундаментальных механизмов регуляции активности электронного транспорта в ЭТЦ, так и для выявления причинно-следственных связей в заболеваниях, связанных с патологиями митохондрий.

Известен способ исследования изолированного очищенного цитохрома C методом ГКР-спектроскопии (Chen, L. et al. Detection of proteins on Silica-Silver Core-Shell substrates by surface-enhanced Raman spectroscopy. Journal of Colloid and Interface Science, 2011. 360: p. 482-487). В указанной работе раствор цитохрома C в фосфатном буфере при концентрациях 100, 10, 1 и 0.1 мкг/мл наносили на стеклянные поверхности с нанокомпозитным покрытием «оксид кремния-серебро-ядро-оболочка» (Silica-Silver Core-Shell). Для получения указанных покрытий очищенные стекла погружали в 0,5% раствор полимерного хлорида диаллилдиметиламмония на 30 мин, затем высушивали и погружали на 2 ч коллоидные наночастицы оксида кремния, декорированные золотыми наночастицами. После высушивания стекла помещали в раствор гидрохинона: нитрата серебра (1:1) на 90 с, затем промывали дистиллированной водой и высушивали в потоке азота. Спектры ГКР цитохрома C получали с использованием лазера 514,5 нм. Спектры демонстрировали все основные пики окисленного гемопорфирина типа C с наибольшим усилением сигнала КР для пиков с положением максимумов 1639, 1588, 1569 см^-1. Возможность зарегистрировать спектры ГКР от очищенного изолированного цитохрома C была показана еще ранее, однако подробный анализ спектров не проводился (Borden, W.Т. & Davidson, Е.R. Surface-enhanced resonance Raman scattering from cytochrome с and myoglobin adsorbed on a silver electrode. J. Am. Chem. SOC., 1980. 102: p. 7960-7962). В данной работе раствор цитохрома C наносили в ячейку с серебряным электродом, подавая на электрод разное напряжение. Таким образом, удалось зарегистрировать ГКР-спектры от окисленной и восстановленной форм цитохрома C.

Аналогов настоящего изобретения на данный момент не существует. Существенными недостатками указанных выше способов ГКР-исследований изолированного цитохрома C является ненативность системы и невозможность получить информацию о конформационных изменениях цитохрома C при функционировании ЭТЦ митохондрий и синтезе АТФ. Актуальная задача по регистрации спектров ГКР от цитохрома C в интактных фунционирующих митохондриях успешно решается в заявляемом изобретении с использованием наноструктурированных покрытий в виде кольцевых наноструктур серебра, имеющих иерархическую структуру.

Единственные работы, в которой наноструктурированные подложки использовались для ГКР-анализа живых клеток, - это работы по обнаружению бактерий в крови (Liu, T.Y., et al., Functionilized arrays of Raman-enhancing nanoparticles for capture and culture-free analysis of bacteria in human blood. Nature Communications. 2011. 2: 538. DOI: 10.1038/ncomms 1546; Semenova A.A. et al. Planar SERS nanostructures with stochastic silver ring morphology for biosensor chips. J. Mat. Chem., 2012. 22: 24530-24544). В первой из указанных работ предлагалось использовать подложки на основе анодного оксида алюминия, декорированного массивом наночастиц серебра и покрытого слоем ванкомицина. Недостаток таких подложек для мультифункционального использования биочипов определяется необходимостью замены слоя ванкомицина на другие гликопептиды для обнаружения других микроорганизмов. Кроме того, подобные подложки невозможно использовать для исследования небактериальных клеток. Во второй из указанных работ использовали наноструктурированные покрытия в виде кольцевых наноструктур серебра с иерархической структурой для исследования конформации гемопорфирина мембранно-связанного гемоглобина в интактных эритроцитах. Описанные покрытия с иерархической структурой продемонстрировали инертность и неинвазивность для живых эритроцитов, а также высокую иммобилизирующую способность относительно клеток и клеточных структур.

Раскрытие изобретения

Задача и технический результат настоящего изобретения заключаются в создании способа анализа конформации гемопорфирина цитохрома C функционирующих митохондрий с помощью спектроскопии гигантского комбинационного рассеивания на наноструктурированных покрытиях для диагностики клеток и органоидов. Использование наноструктурированных подложек с контролируемой морфологией позволяет осуществлять диагностику митохондрий методом ГКР в результате эффективного контакта наночастиц (НЧ) с функционирующими митохондриями.

Поставленная задача решается тем, что способ анализа цитохрома C в интактных митохондриях с помощью спектроскопии гигантского комбинационного рассеяния (ГКР), включающий подготовку митохондрий и их нанесение на подложку на основе диэлектрического химически инертного материала с наноструктурированным покрытием толщиной 1-10 мкм в виде кольцевых наноструктур серебра, при этом ободки серебряных колец состоят из сообщающихся друг с другом пористых агрегатов серебра, на поверхности которых расположены округлые наночастицы серебра размером 2-90 нм, с последующей иммобилизацией митохондрий на данные наноструктурированные покрытия, детектирование спектров ГКР с последующей расшифровкой характеристических колебаний анализируемой пробы спектров ГКР с использованием стандартного программного обеспечения.

В качестве диэлектрического химически инертного материала использован материал, выбранный из ряда: оксид алюминия, оксид магния, диоксид кремния, диоксид циркония, силикатное стекло.

Наноструктурированные покрытия в виде кольцевых наноструктур серебра обеспечивают эффективный контакт с митохондриями и позволяют осуществлять их диагностику методом ГКР, расстояние между наноструктурами и поверхностью митохондрий не более 20 нм.

В одном из вариантов для детектирования цитохрома C используют жидкие пробы объемом 300 микролитров путем их накалывания на наноструктурированное покрытие, предварительно помещенное в чашку Петри со стеклянным дном. Время иммобилизации митохондрий на наноструктурированных покрытиях составляет от 2 до 60 минут. ГКР-спектры получают с использованием зеленого лазера с длиной волны 532 нм.

Для обеспечения высокой скорости анализа при большом отношении сигнал/шум и отсутствии появления ложной спектральной информации мощность лазерного излучения не превышает 5% от номинальной величины при продолжительности набора спектров не более 20 секунд, при этом достигается высокая экспрессность анализа и не происходит фотоповреждение образца.

Возможен способ, при котором ГКР-спектры митохондрий отражают характеристические колебания связей гемопорфирина окисленного, соответствующие сигналам в спектрах ГКР с положением максимумов 748, 1127, 1170, 1313, 1371, 1565, 1638 см^-1 цитохрома C в митохондриях при разных степенях активности электронно-транспортной цепи (ЭТЦ) митохондрий. ГКР-спектры митохондрий отражают характеристические колебания связей гемопорфирина восстановленного, соответствующие сигналам в спектрах ГКР с положением максимумов 748, 1127, 1170, 1311, 1356, 1545, 1605 см^-1 цитохрома C в митохондриях при разных степенях активности электронно-транспортной цепи (ЭТЦ) митохондрий.

По соотношениям интенсивностей характеристических колебаний с положением максимумов 748 и 1638 см^-1 (I₇₄₈/I₁₆₃₈), 1605 и 1638 см^-1 (I₁₆₀₅/I₁₆₃₈) определяют относительное изменение содержания, восстановленного цитохрома C по сравнению с окисленным цитохромом C. По соотношениям интенсивностей пиков с положениями максимумов 1127 и 1356 см-1 (I₁₁₂₇/I₁₃₅₆) и 1170 и 1356 см^-1 (I₁₁₇₀/I₁₃₅₆) определяют степени выраженности колебаний боковый -CH₃ радикалов по отношению к симметричным колебаниям пиррольных колец, соответственно, в гемопорфирине восстановленного цитохрома C. По соотношениям интенсивностей пиков с положениями максимумов 1127 и 1371 см-1 (I₁₁₂₇/I₁₃₇₁) и 1170 и 1371 см^-1 (I₁₁₇₀/I₁₃₇₁) определяют степени выраженности колебаний боковый -CH₃ радикалов по отношению к симметричным колебаниям пиррольных колец, соответственно, в гемопорфирине окисленного цитохрома C в составе функционирующих митохондрий.

Также поставленная задача решается тем, что используемые в упомянутом выше способе анализа наноструктурированные покрытия с контролируемой морфологией не вызывают нарушения плазматической мембраны и позволяют осуществлять диагностику митохондрий методом ГКР. Нанесение на подложку наноструктурированного покрытия на основе наночастиц серебра до толщины не более 10 микрон осуществляют следующим образом: 0,1 М водный раствор гидроксида натрия (Aldrich NaOH, деионизированной вода высокой чистоты, Milli-Q, Millipore) добавляют по каплям в свежеприготовленный 0,01 М водный раствор нитрата серебра до полного осаждения коричневого осадка - оксида серебра(I). Полученный осадок тщательно промывают деионизированной водой высокой чистоты (Milli-Q) и растворяют в двукратном молярном избытке 10% водного раствора аммиака (полученного из 30% водного раствора гидроксида аммония, Aldrich). Затем прозрачный раствор аммиачного комплекса серебра фильтруют через сменный мембранный фильтр Millex-LCR (Millipore, размер пор 450 нм). Далее производят осаждение аэрозоля диаммиаката оксида серебра(I), при температуре 200-300°C с помощью ультразвукового нейбулайзера распыляют полученный раствор аммиачного комплекса оксида серебра(I) (размер капели 1-5 микрон) на разогретые до 200-270°C подложки на основе диэлектрического химически инертного материала в течение получаса.

Частным вариантом настоящего изобретения является упомянутый выше способ, включающий подготовку митохондрий. Митохондрии выделяли из сердца крысы. Каждое сердце гомогенизировали на льду в 10 мл охлажденного до 4°C буфера для выделения митохондрий (состав: 300 мМ сахароза, 2 мМ ЭГТА, 20 мМ пирофосфат натрия, 2 мМ ванадат натрия, 20 мМ бета-глицерофосфат, 10 мМ NaF, 3 мМ бензамидин, 2 мМ фенилметилсульфонилфторид, 10 мМ Трис-HCl, pH 7,1, 10 мкг/мл апротинина, 10 мкг/мл лейпептина). Сначала ткань сердца измельчали на тканевом дисрапторе фирмы Polytron в течение 20 секунд, а затем после небольшого перерыва повторяли эту процедуру в течение 10 секунд. 5 мл этого гомогената разбавляли добавлением 10 мл буфера для выделения митохондрий, и суспензию гомогенизировали в течение 2 мин с помощью гомогенизатора Potter-Elvehjem, оснащенного тефлоновым пестиком. Конечный гомогенат центрифугировали при 700 g при 4°C в течение 10 мин, с последующим центрифугированием супернатанта при 7000 g при 4°C в течение 10 мин. Осадок ресуспендировали в 2 мл охлажденного до 4°C буфера для измерения спектров комбинационного рассеяния (150 мМ KCl, 5 mM Tris-HCl, 1 mM EGTA, 5 mM Na2HPO4, 1.5 mM CaCl2, pH 7.4) и хранили на льду до анализа. Непосредственно перед регистрацией спектров ГКР в приготовленную пробу с митохондриями добавляли сукцинат натрия в концентрации 5 мМ, АДФ в конечной концентрации 2 мМ и MgCl₂ в конечной концентрации 3 мМ. Сукцинат является субстратом комплекса II ЭТЦ митохондрий (и ферментом фумарат-сукцинат-оксидоредуктазой цикла Кребса) и, таким образом, непосредственным донором электронов в ЭТЦ. АДФ используется в качестве субстрата комплекса V для синтеза АТФ, а иона Mg²⁺ необходимы для работы комплекс V. Содержание общего белка в митохондриях определяли по методу Лоури. Было получено, что пробы митохондрий, полученных, как описано выше, содержат белки в общей концентрации 4.4±0.41 мг/мл. Для регистрации спектров ГКР полученный осадок митохондрий разводили соответствующим буфером в 20-100 раз, после чего наносили 300 мкл суспензии митохондрий на наноструктурированную подложку, предварительно помещенную в чашку Петри со стеклянным дном. Частным вариантом настоящего изобретения является упомянутый выше способ, согласно которому время иммобилизации митохондрий на наноструктурированных покрытиях составляет от 2 до 60 минут.

Другим частным вариантом настоящего изобретения является упомянутый выше способ, согласно которому ГКР-спектры получают с использованием зеленых лазеров с длиной волны 532 нм.

Изобретение иллюстрируется фигурами и примерами.

Описание чертежей

Фигура 1. А: (1) Спектр комбинационного рассеяния буфера, используемого для разведения суспензии митохондрий; (2) спектр суспензии митохондрий при разведении, как в ГКР-измерений, полученный при помещении митохондрий на стеклянную поверхность без наноструктурированного серебряного покрытий; (3) спектр комбинационного рассеяния, зарегистрированный от плотного агрегата митохондрий; (4) ГКР-спектр митохондрий, помещенных на наноструктурированную серебряную поверхность после внесения сукцината натрия, АДФ и MgCl₂; (5) ГКР-спектр митохондрий после предварительной инкубации митохондрий с восстановителем дитионитом натрия. Спектры ГКР зарегистрированы при следующих условиях: концентрация общего белка в суспензии митохондрий 44 мкг/мл, мощность лазера 1,5 мВт, объектив ×5, NA 0.15, время регистрации спектра ГКР 20 с. Спектры КР митохондрий регистрировали от центра крупных агрегатов митохондрий при следующих оптимальных экспериментальных условиях: мощность лазера 1,5 мВт, объектив ×63, NA 0.9, время регистрации спектра 20 с. Б: ГКР-спектры митохондрий до и после внесения протонофора FCCP (Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone, 0,5 мкМ); В: ГКР-спектры митохондрий до и после внесения олигомицина (5 мкМ). Все спектры снимали с использованием лазера 532 нм.

Осуществление изобретения

Как видно из Фиг. 1, при помещении суспензии митохондрий на обычное стекло спектр ГКР гемопорфирина цитохрома C отсутствует. При этом помещение этой же суспензии митохондрий на наноструктурированное покрытие приводит к появлению интенсивного спектра (Фиг. 1, А, спектры 2 и 4). Без наноструктурированных поверхностей зарегистрировать обычный спектр КР от митохондрий практически невозможно (Фиг. 1, А, спектр 3), и даже увеличение локальной мощности лазера за счет использования объектива с большой числовой аппертурой не приводит к появлению сколько-нибудь значимых пиков. Это свидетельствует о том, что спектр КР не может быть зарегистрирован ни от разбавленных, ни от концентрированных суспензий митохондрий без использования наноструктурированных поверхностей. ГКР-спектры митохондрий содержат ряд интенсивных пиков, характерных для цитохромов C- и B-типов. Так, самые интенсивные пики имеют положение максимумов 748, 1127, 1172, 1370, 1566, 1588 и 1638-1640 см^-1 (Фиг. 1. А, спектр 4). Похожее положение пиков наблюдалось для ГКР-спектров изолированного окисленного цитохрома C, помещенного на композитные наноструктурированные покрытия (Chen, L. et al. Detection of proteins on Silica-Silver Core-Shell substrates by surface-enhanced Raman spectroscopy. Journal of Colloid and Interface Science, 2011. 360: p. 482-487) и для эритроцитов, помещенных на наноструктурированные подложки (Semenova А.А. et al. Planar SERS nanostructures with stochastic silver ring morphology for biosensor chips. J. Mat. Chem., 2012. 22: 24530-24544). Сходство со спектрами ГКР эритроцитов объясняется тем, что КР-активной молекулой в цитохромах и гемоглобине является гем (типа C или B). Следует отметить, что в спектре ГКР митохондрий ярко выражен пик с положением максимума 1313 см^-1, который является отличительным признаком цитохромов C-типа. При этом в спектре ГКР митохондрий отсутствуют пики с положениями максимумов 1300 и 1337 см^-1, которые являются специфичными пиками цитохромов типа В (Okada, М. et al. Label-free Raman observation of cytochrome с dynamics during apoptosis. Proc. Nat. Acad. Sci. USAб 2012. 109: p. 28-32). Данный факт является доказательством того, что спектр ГКР митохондрий происходит от цитохрома C, а не цитохромов типа B, содержащихся в комплексах II и III. Причиной такого избирательного усиления является тот факт, что цитохромы B-типа локализованы внутри второй митохондриальной мембраны и, таким образом, находятся дальше от наноструктурированной поверхности, чем цитохром С. Цитохром С1 также не может вносить заметный вклад в спектры ГКР, поскольку он также является трансмембранным белком, расположенным дальше от подложек, чем цитохром C. Из полученных спектров ГКР (без и с добавлением дитионита натрия) также следует, что часть молекул цитохрома C находятся в окисленном, часть - в восстановленном состоянии. При восстановлении гемопорфирина цитохрома C происходит смещение в более низкочастотную область некоторых пиков (1605 вместо 1638 см^-1, 1356 вместо 1371 см^-1), а также существенное увеличение интенсивности пика с положением максимума 748 см^-1. Внесение FCCP приводит к уменьшению относительной интенсивности пика 748 см^-1, что говорит об уменьшении относительного количества восстановленного цитохрома C (Фиг. 1, Б). Данный эффект связан с активацией ЭТЦ для того, чтобы восстановить разность потенциалов на внутренней митохондриальной мембране, уменьшившуюся при действии FCCP. Добавление олигомицина, напротив, приводит к увеличению относительной интенсивности пика 748 см^-1, что свидетельствует об увеличении относительного количества, восстановленного цитохрома C. Данный эффект связан с тем, что при ингибировании синтеза АТФ и накоплении протонов в межмембранном пространстве митохондрий происходит замедление электронного транспорта в ЭТЦ и увеличение времени жизни переносчиков электронов, в том числе цитохрома C, в восстановленном состоянии.

Таким образом, экспериментальные данные подтверждают, что заявленный способ позволяет анализировать цитохром C в функционирующих митохондриях с помощью спектроскопии гигантского комбинационного рассеивания.

Пример 1.

Для установления характерных пиков спектров ГКР, присущих окисленному и восстановленному гемопорфирину цитохрома C, в суспензию митохондрий, нанесенную на серебряное наноструктурированное покрытие, после записи спектра ГКР добавляли дитионит натрия (Фиг. 1, А). Дитионит натрия реагирует с кислородом среды, а также восстанавливает окисленные гемопорфирины, в том числе окисленный цитохром C. Таким образом, при добавлении дитионита натрия спектры ГКР митохондрий соответствуют спектрам ГКР восстановленного цитохрома C.

Пример 2.

В серии экспериментов после записи ГКР-спектров суспензии митохондрий, нанесенной на наноструктурированные серебряные покрытия, в экспериментальную среду вносили протонофор FCCP в концентрации 0,5 мкМ (Фиг. 1, Б). ГКР-спектры получали при тех же параметрах, что и контрольные ГКР-спектры митохондрий.

Пример 3.

В серии экспериментов после записи ГКР-спектров суспензии митохондрий, нанесенной на наноструктурированные серебряные покрытия, в экспериментальную среду вносили ингибитор АТФ-синтетазы (комплекса V ЭТЦ) в концентрации 1 мкМ (Фиг. 1, В). ГКР-спектры получали при тех же параметрах, что и контрольные ГКР-спектры митохондрий.

Пример 4.

Для проверки эффекта усиления комбинационного рассеяния света на цитохроме C интактных митохондрий проводили запись спектров КР митохондрий. Для этого фокусировали луч лазера на центральной части крупного агрегата митохондрий с использованием объектива ×5, NA 0,9. В этом случае весь объем, с которого регистрируется спектр, приходится на митохондрии. Для дополнительной проверки усиления КР на цитохроме C митохондрий суспензию митохондрий наносили на стекло без наноструктурированного серебряного покрытия.