Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ ОБРАБОТКИ ДРОЖЖЕЙ

СПОСОБ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ ОБРАБОТКИ ДРОЖЖЕЙ

Изобретение относится к контролю микробной контаминации в процессе размножения и хранения дрожжей рода Saccharomyces в бродильных производствах (спирта, пива, кваса, дрожжей). Предложен способ применения противомикробной композиции, включающей коллоидный раствор наночастиц серебра с размером частиц 10-15 нм, синтезированного путем химического восстановления водорастворимой соли серебра в водной среде аскорбатом или цитратом натрия, с дальнейшим добавлением стабилизатора гуарана или смеси стабилизаторов гуарана и глицина в соотношении 12:1 соответственно, в количестве 0,001-0,004 г/дм³ к дрожжевой суспензии.

Указанная композиция предназначена для контроля контаминации дрожжей бактериями Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas fluoresces, Sarcina flava, Lactobacillus brevis и другими, заражающими культурные дрожжи рода Saccharomyces, что приводит к конкуренции микрооганизмов за сбраживаемые сахара в сбраживаемой среде. Способ контроля микробной контаминации в процессе дрожжегенерации и хранения дрожжей предусматривает добавление к ним указанной композиции. Изобретение обеспечивает эффективное уменьшение количества микробиоты контаминантов без воздействия на ферментирующие дрожжи.

Несмотря на совершенствование технологических приемов, направленных на улучшение качества дрожжей и снижение микробиологического их заражения, пока отсутствует удовлетворительное решение по контролю за контаминацией дрожжей, как при их генерации, хранении и использовании, из-за трудоемкости и высоких затрат, связанных с контролем уровня контаминации исходного сырья, которое поступает на ферментацию, и оборудования, в котором осуществляется технологический процесс.

В настоящее время условия переработки сырья в процессе сбраживания дрожжами, как правило, приводят к появлению бактериальной микробиоты, которая обычно превышает 10⁴ клеток/см³ в сбраживаемой среде или в дрожжевой разводке при ее хранении. Кроме того, сусло, в котором размножают дрожжи или которое дрожжи сбраживают, будучи средой, благоприятной для бактериального роста, содержит помимо сбраживающих дрожжей Saccharomyces cerevisiae разновидности контаминантных бактерий, таких как Escherichia coli, Erwinia herbicola, Pseudomonas fluoresces, Micrococcus varians, Bacillus cereus, Pediococcus claussenii, Lactobacillus brevis.

Присутствие контаминантов может вызывать снижение продуктивности дрожжегенерации и брожения и другие производственные проблемы, например снижение продуктивности этих процессов и ослабление дрожжей. Например, бактерии могут конкурировать с культурными дрожжами, поглощая сахар в сусле без его превращения в спирт и снижая продуктивность при дрожжегенерации.

Кроме того, существенное повышение содержания органических кислот в сбраживаемой среде ухудшает вкус и аромат готового продукта (пива, спирта, кваса) и снижает продуктивность дрожжей за счет снижения их размножения, что может уменьшить производительность дрожжегенераторов (пропагаторов) на 10-20%.

Известен способ антибактериальной обработки дрожжей путем внесения хмелевых кислот в сочетании с фосфорной кислотой [US 6,326,185 В1]. В суспензию инфицированных дрожжей добавляют тетрагидро-изо-альфа хмелевую кислоту до концентрации 0,004% в среде. Далее смесь выдерживают не менее 5 мин и подкисляют фосфорной кислотой в таком количестве, чтобы получить значение рН 2,0-2,6. Для получения приемлемых результатов кислотная обработка дрожжей проводится не менее 3 ч. Данный способ позволяет эффективно уничтожать грамположительные бактериальные микроорганизмы, в том числе рода Pediococcus.

Из недостатков данного метода можно выделить негативное влияние фосфорной кислоты на жизнедеятельность и рост дрожжевых микроорганизмов. Кроме того, в известном способе не приведены данные по влиянию предложенной обработки на грамотрицательные бактерии, также являющиеся причиной микробиологического инфицирования дрожжей.

Известен способ антибактериальной обработки дрожжей, основанный на применении противомикробной композиции, включающей противомикробное вещество семейства гуанидиновых, антибиотик (Kamoran) и поверхностно-активное вещество (Genapol) [RU 2539792]. Данная композиция позволяет осуществлять деконтаминацию дрожжей S. cerevisiae от дрожжей дикого типа и бактериальной микробиоты.

Недостатком данного метода является применение антибиотиков, к которым, как известно, бактериальные микроорганизмы способны со временем вырабатывать резистентность. Необходимо также отметить, что снижение концентрации контаминирующих микроорганизмов должно приводить к усиленному накоплению биомассы S. cerevisiae. Согласно представленным данным наибольшее число клеток сахаромицетов накоплено в образцах, содержащих контаминирующие агенты, но не подвергшихся обработке в соответствии с известным способом. Что свидетельствует о негативном влиянии описанной композиции на ферментирующие дрожжи.

Используемый нами препарат наночастиц серебра обладает широким спектром действия в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов и не оказывает отрицательного влияния на S. cerevisiae в рамках заданных концентраций.

Наиболее близким аналогом является способ антибактериальной обработки дрожжей с использованием комплекса коллоидных частиц серебра CSC [Colloidal silver complex as an alternative to sulphur dioxide in winemaking P.M. Izquierdo-et al./Food Control 23 (2012) 73e81]. Используемый препарат представляет собой серый порошок, состоящий из наночастиц серебра размером 10 нм, стабилизированных неорганическим инертным материалом. Коллоидный комплекс применяется при сбраживании виноградного сырья дрожжами рода Saccharomyces. Средство вносится в виноградное сусло перед подачей дрожжей. Затем проводится процесс брожения без добавления дополнительных консервантов, вроде SO₂. Технология позволяет сдерживать развитие лактобактерий и уксуснокислых бактерий, не оказывая явного негативного влияния на жизнедеятельность дрожжей.

В наиболее близком аналоге показано, что применяемый препарат наносеребра позволяет добиться результатов, аналогичных обработке диоксидом серы. Что ставит вопрос об экономической целесообразности замены более дешевых и простых в изготовлении препаратов на более комплексные и дорогостоящие. Также не указаны минимальные ингибирующие концентрации для используемого средства, позволяющие определить оптимальное количество препарата, необходимое для внесения в сусло. В наиболее близком аналоге отсутствуют данные относительно действия коллоидного комплекса наночастиц на спорообразующие бактерии, проявляющие высокую устойчивость к различным биоцидным средствам.

Изучение доступных источников информации показало, что коллоидные растворы серебра с размером частиц менее 15 нм, стабилизированные полисахаридами, ранее не применялись для обеспечения микробиологической чистоты дрожжей. В данном исследовании впервые было рассмотрено селективное влияние коллоидных растворов наночастиц серебра на дрожжевые и бактериальные микроорганизмы в зависимости от концентрации частиц в среде, агрегатного состояния среды и рН.

Задачей изобретения является предотвращение развития бактериальных инфекций дрожжей S. cerevisiae в процессе культивирования и сбраживания сырья при получении продукции на основе этилового спирта.

Поставленная задача решается тем, что в ходе культивирования S. cerevisiae в суспензию вносят коллоидный раствор наночастиц серебра, стабилизированных гуараном до концентрации частиц в среде 0,001-0,002 г/дм³. После накопления достаточного количества биомассы дрожжи подают в бродильное отделение, где происходит сбраживание крахмалсодержащего сырья. При необходимости очистки инфицированных дрожжей для повторного использования в дрожжевую суспензию вносят препарат наносеребра до концентрации частиц в среде 0,003-0,004 г/дм³. После выдержки в течение 3-6 часов при температуре 5-15°С обработанные дрожжи можно повторно вводить в технологический процесс.

Техническим результатом заявленного изобретения является отсутствие контаминантных бактерий в биомассе дрожжей, накопленной при разведении чистой культуры; а в случае обработки инфицированных дрожжей - снижение количества КОЕ бактерий на 98,9%.

Во основу изобретения поставлено применение коллоидного раствора наночастиц серебра с размером частиц 10-15 нм, синтезированного путем химического восстановления водорастворимой соли серебра в водной среде аскорбатом или цитратом натрия, с дальнейшим добавлением стабилизирующего агента - гуарана, или смеси стабилизирующих агентов - гуарана и глицина в соотношении 12:1 соответственно. Препарат обладает выраженными бактерицидными свойствами благодаря малому размеру частиц и уникальным характеристикам серебра. Используемые стабилизаторы являются веществами, разрешенными для применения в пищевой промышленности в качестве пищевых добавок.

Антибактериальное действие препаратов наночастиц изучали на основе выявления минимальных ингибирующих концентраций (МИК) для ряда грамотрицательных и грамположительных микрорганизмов. Исследование для твердых сред проводили луночно-диффузионным методом, а для жидких - путем контрольного посева на мясопептонный агар после культивирования в неохмеленном солодовом сусле. Результаты представлены в таблице 1. Таким образом, МИК в твердых питательных средах составляет 0,002 г/дм³, а в жидких - 0,001 г/дм³.

Эффективность обработки наносеребром проверяли в процессе культивирования дрожжей S. cerevisiae в присутствии М. varians (шаровидные неспорообразующие грамположительные бактерии), В. cereus (спорообразующие палочковидные грамположительные бактерии), Е. coli (палочковидные грамотрицательные бактерии). В течение 48 ч контролировали накопление биомассы дрожжевых клеток (табл. 2). В контрольные образцы не вносили наносеребро и клетки бактерий. В образцах А концентрация наночастиц серебра 0 г/дм³, в образцах В - 0,001 г/дм³, в образцах С - 0,002 г/дм³.

По окончании культивирования замеряли концентрацию мертвых клеток S. cerevisiae, наличие бактериальной инфекции проверяли путем контрольного посева на мясопептонный агар (табл. 3).

Как видно из представленных данных, внесение наночастиц серебра в питательную среду не оказывает негативного влияния на процессы роста и накопления биомассы дрожжей в рамках заданных концентраций. Кроме того, очевидна разница между инфицированными образцами, подвергшимися обработке наносеребром, и образцами, не прошедшими обработку.

Необходимо также отметить, что при обработке дрожжей наночастицами серебра до концентрации 0,004 г/дм³, в соответствии с традиционной технологией получения пива, для брожения в сусло вносится 0,8-1,2% дрожжей от общего объема сусла. Таким образом, сброженное сусло будет содержать не более 0,00005 г/дм³ коллоидного серебра, что допускается санитарными правилами и нормами РФ.

Примеры конкретного выполнения способа

Пример 1. На стадии накопления чистой культуры S. cerevisiae в сусло-дрожжевую суспензию вносится коллоидный раствор наночастиц серебра, стабилизированных гуараном в таком количестве, чтобы концентрация частиц составила 0,001-0,003 г/дм³. Дальнейшее дрожжегенерирование проводят в соответствии с применяемой на производстве технологией. В случае отбора части накопленной биомассы и повторного добавления сусла концентрацию наночастиц в объеме среды доводят до 0,001 г/дм³. Данная обработка позволит избежать возникновения инфекции в случае попадания контаминирующих бактерий в процесс накопления чистой культуры по технологии, подразумевающей использование нестерильного сусла или основанной на применении открытых систем, характерных для небольших предприятий.

Пример 2. Инфицированные дрожжи S. cerevisiae второй и более генерации в процессе очистки для дальнейшего введения в технологический процесс обрабатываются коллоидным раствором наночастиц серебра, стабилизированных гуараном. Препарат вносится в таком количестве, чтобы концентрация наночастиц составила 0,002 г/дм³. Далее дрожжевую суспензию выдерживают 4-6 часов, а затем направляют на хранение под слоем воды или пива.

Примеры 3 и 4 осуществляют аналогично примерам 1 и 2, однако в качестве антимикробного агента вносят раствор наночастиц серебра, стабилизированных смесью гуарана и глицина в соотношении 12:1 соответственно.