Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ КОМБИНИРОВАННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ, ОКСИДОВ ОЛЕФИНОВ И ИХ СМЕСИ НА РАБОТНИКОВ НЕФТЕХИМИЧЕСКИХ И ХИМИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВ

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к медицине труда и может быть использовано для оценки комбинированного воздействия ароматических углеводородов, оксидов олефинов и их смеси на работников нефтехимических производств.

Нефтехимическая промышленность занимает одно из ведущих мест по потенциальной опасности химического воздействия [Профессиональные риски здоровья работающих при переработке нефти / Л.К.Каримова, Г.Г.Гимранова, Т.М.Зотова [и др.] // Медицина труда и промышленная экология. - 2009. - №11. - С.9-12]. В условиях современных нефтехимических производств в воздушной среде могут присутствовать многокомпонентные смеси, содержащие одновременно от 2 ингредиентов [Мирзакаримова, М.А. Гигиеническая оценка комбинированного действия загрязнений в атмосферном воздухе населенных мест / М.А.Мирзакаримова, Ш.Т.Искандарова // Гигиена и санитария. - 2008. - №4. - С.10-13]. При комбинированном воздействии структурно-родственных химических соединений или веществ с близким механизмом действия можно ожидать усиление токсического эффекта химических веществ [Кравченко, Л.В. Оценка комбинированного действия микотоксинов вомитоксина и Т-2 токсина на крыс / Л.В.Кравченко, Л.И.Авреньева, В.А.Тутельян // Токсикологический вестник. - 2000. - №1. - С.2-7].

Во многих технологических процессах нефтехимических и химических производств чаще присутствуют ароматические углеводороды (бензол, этилбензол, стирол), оксиды олефинов (оксид пропилена, оксид этилена), или их смеси [Профессиональная патология: национальное руководство / под. ред. Н.Ф.Измерова. - М.: ГЕОТАР-Медиа, 2011. - 784 с.]. Оксиды олефинов и ароматические углеводороды являются важнейшими продуктами нефтехимического производства и используются для получения синтетических волокон, каучуков, различных пластмасс, синтетической резины, красителей и ряда продуктов органического синтеза. Одновременное присутствие в воздухе рабочей зоны оксидов олефинов и ароматических углеводородов возможно в производствах полиэфирных смол, фенилэтилового спирта, полигликолевых эфиров, некоторых видов полиуретанов и др.

В настоящее время многие авторы особое внимание уделяют влиянию химических веществ на субклеточные структуры, поскольку в основе механизма действия различных химических соединений лежит их взаимодействие с компонентами клеток, молекулами клеточных органелл и мембран [Иванова, Л.А. Лабораторные исследования в клинике профессиональных заболеваний / Л.А.Иванова, М.Н.Горизонтова, Т.Р.Захарова [и др.] // Медицина труда и промышленная экология. - 2003. - №6. - С.20-24; Мышкин, А.В. Окислительный стресс и повреждения печени при химических воздействиях / А.В.Мышкин, А.Б.Бакиров. - Уфа, 2010.- 176 с.].

Известно, что чрезмерная активация свободнорадикальных и перекисных реакций и внутриклеточных ферментов отражает тонкие сдвиги обменных процессов, которые предшествуют появлению выраженных клинических признаков повреждения, в т.ч. повреждения химическими веществами [Савлуков, А.И. Метаболические процессы в организме при воздействии химических загрязнителей / А.И.Савлуков, Р.Ф.Камилов, В.М.Самсонов [и др.] // Клиническая лабораторная диагностика. - 2010, - №7. - С.33-39].

Прототипом изобретения является способ оценки характера воздействия на клетку различных химических агентов [Патент RU №2089905, 1997 г.], заключающийся в том, что в неокрашенных мазках буккального эпителия при внутриклеточном электрофорезе измеряют напряжения и частоты до и после добавления исследуемого химического препарата. При увеличении амплитуды по сравнению с контролем констатируют биостимулирующий эффект, при уменьшении угнетающий. Недостатком данного метода является отсутствие специфических показателей, которые могут выступать в качестве критериев изменения состояния клетки, внутриклеточных структур и организма в целом при воздействии ароматических углеводородов, оксидов олефинов и их смеси.

Задачей изобретения является разработка способа оценки комбинированного воздействия ароматических углеводородов, оксидов олефинов и их смеси на работников, занятых в условиях нефтехимических и химических производств.

Технический результат при использовании изобретения - получение критериев диагностики комбинированного воздействия ароматических углеводородов, оксидов олефинов и их смеси на работников, занятых в условиях нефтехимических и химических производств.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе оценки воздействия химических агентов, включающем исследование биологического материала, согласно изобретению у работников нефтехимических и химических производств в сыворотке периферической крови спектрофотометрическим методом определяют активность каталазы, аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы и количественное содержание перекисей в липидах, при снижении активности каталазы, увеличении активности аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы и количественного содержания перекисей в липидах диагностируют комбинированное воздействие смеси ароматических углеводородов и оксидов олефинов; при увеличении активности аланинаминотрансферазы и количественного содержания перекисей в липидах диагностируют комбинированное воздействие оксидов олефинов; при увеличении количественного содержания перекисей в липидах диагностируют комбинированное воздействие ароматических углеводородов.

Определение активности каталазы в сыворотке крови

Содержание каталазы в сыворотке периферической крови обследованных лиц определяют спектрофотометрическим методом.

Реактивы и их приготовление: 1.4% раствор молибдата натрия (4 г реактива растворяют в 100 мл воды). 2.0,03%) раствор перекиси водорода (готовят непосредственно перед использованием: берем 1 мл 3% перекиси водорода, доводят до 100 мл).

Кровь из вены отбирают в пробирку. По истечении 20 минут кровь центрифугируют при 1500 оборотов в минуту в течение 15 мин при +4°C для отделения сыворотки крови. Анализ выполняют сразу же после отбора сыворотки крови. Параллельно с опытными образцами ставят контроли для каждого образца В пробирку 1 (опытный образец) вносят 0,1 мл сыворотки крови, добавляют 2 мл перекиси водорода 0,03%, инкубируют 10 минут при комнатной температуре. После инкубации останавливают реакцию добавлением 1 мл молибдата натрия, центрифугируют 15 минут при 3000 оборотах в минуту. Измеряют оптическую плотность образцов при длине волны 410 нм против дистиллированной воды.

В пробирку 2 (контрольный образец) отмеривают 0,1 мл сыворотки крови, добавляют 1 мл молибдата натрия, инкубируют 10 минут при комнатной температуре. По истечению времени инкубации добавляют 2 мл перекиси водорода 0,03%, центрифугируют 15 минут при 3000 оборотов в минуту.

Измеряют оптическую плотность образцов при длине волны 410 нм против дистиллированной воды.

Рассчитывают по формуле:

А=(Ек-Ео)*75;

А - активность фермента в мКат/л

Ек - оптическая плотность контроля, Ео - оптическая плотность пробы.

Референтные значения 10,6-23,0 мКат/л (Королюк М.А. и др. Определение активности каталазы. / Лабораторное дело. - №1, 1988, С.16-19).

Определение перекисей в липидах сыворотки крови

Для оценки интенсивности процессов перекисного окисления определяют количественное содержание продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке периферической крови спектрофотометрическим методом. Кровь из вены отбирают в пробирку. По истечении 20 минут кровь центрифугируют при 1500 оборотов в минуту в течение 15 мин при +4°C для отделения сыворотки крови, которую сразу подвергают анализу.

Реактивы и их приготовление. 1. Серная кислота, 0,1 N. 2. Фосфорновольфрамовая кислота (ФВК), 10%. 3. Тиобарбитуровая кислота (ТБК) - 0,67%. Готовят перед применением при нагревании и смешивают с ледяной уксусной кислотой (1:1). 4. Н-бутанол (хч).

1. К 0,25 мл сыворотки крови добавляют 5 мл 0,1 N серной кислоты, 0,5 мл 10% раствора ФВК, перемешивают, выдерживают 5 минут при комнатной температуре, потом центрифугируют при 1500 оборотах в минуту в течение 5 минут. Одновременно с опытными образцами ставят холостую пробу (без сыворотки крови), все остальные этапы проводят параллельно с опытными образцами.

2. Супернатант сливают, к осадку приливают 4 мл дистиллированной воды, добавляют 1,0 мл раствора тиобарбитуровой кислоты, перемешивают и инкубируют на водяной бане в течение 60 мин при 95°C.

3. По истечении времени пробы охлаждают, к пробе добавляют 4 мл н-бутанола и экстрагируют в течение 1 мин на вортексе. Для разделения слоев пробы центрифугируют в течение 5 мин в пробирках с пробками при 1500 оборотах в минуту.

4. Сразу после центрифугирования отбирают 3 мл супернатанта и измеряют оптическую плотность опытной пробы против холостой пробы при двух длинах волн 535 и 570 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. Измерение проводят не позднее 1,5 часов после центрифугирования.

5. Расчет содержания продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови проводят по формуле:

C=(D₅₃₅-D₅₇₀/0.156)×16, где

С - содержание продуктов перекисного окисления липидов в опытной пробе, мкмоль/л;

D₅₃₅ - оптическая плотность опытной пробы при 535 нм;

D₅₇₀ - оптическая плотность опытной пробы при 570 нм;

0.156 - коэффициент молярной экстинкции комплекса малоновый диальдегид - ТБК в л/мкмоль×см; 16 - коэффициент разведения сыворотки.

Референтные значения 1,43-4,31 мкмоль/л. (Архипова О.Г. Шацкая Н.Н., Семенова Л.С. и др. Методы исследования в профпатологии. М., 1988 - 208 с.).

Определение аланинаминотрансферазы

Определение активности аланинаминотрансферазы (АЛТ) в сыворотке периферической крови проводят спектрофотометрическим кинетическим методом. Для определения активности аланинаминотрансферазы используют реагенты фирмы Human. Реактивы и их приготовление.

1. Субстрат, в котором содержится 2-оксоглутарат (90 ммоль/л) и NADH (0,18 ммоль/л).

2. Буфер, в котором содержится ТРИС буфер (рН 7,5), L-аланин (750 ммоль/л) и лактатдегидрогеназа (≤1,2 кЕд/л). Субстрат из флакона SUB смешивают с содержимым флакона BUF перед применением.

Кровь для определения отбирают из вены. По истечении 20 минут кровь центрифугируют при 1500 оборотов в минуту в течение 15 мин при +4°C для отделения сыворотки крови, которую сразу подвергают анализу.

В пробирку вносят 1 мл готового реагента, прогревают при температуры 37° не менее 30 секунд, добавляют 0,1 мл сыворотки крови, тщательно перемешивают, запускают секундомер. Измеряют оптическую плотность опытной пробы ровно через 1 минуту. Повторяют измерение 3 раза с интервалом 1 минута.

Вычисление: вычисляют среднее изменение оптической плотности за 1 минуту (ΔА/мин). Для расчета активности АЛТ в пробе полученное значение ΔА/мин умножают на фактор 1745.

Референтные значения: мужчины - не более 42 Ед/л, женщины - не более 32 Ед/л (по инструкциям к наборам согласно рекомендациям IFCC - Международной Федерации по Клинической Химии).

Определение аспартатаминотрансферазы

Определение активности аспартатаминотрансферазы (ACT) в сыворотке периферической крови проводят спектрофотометрическим методом. Для определения активности аспартатаминотрансферазы используют реагенты фирмы Human Реактивы и их приготовление.

1. Субстрат, в котором содержится 2-оксоглутарат (65 ммоль/л) и NADH (0,18 ммоль/л).

2. Буфер, в котором содержится ТРИС буфер (рН 7,8), L-аспартат (290 ммоль/л), лактатдегидрогеназа (≥10 кЕд/л), малатдегидрогеназа (≥0,5 кЕд/л). Субстрат из флакона SUB смешивают с содержимым флакона BUF перед применением, готовый реагент прогревают до температуры 37°. Субстрат из флакона SUB смешивают с содержимым флакона BUF перед применением, готовый реагент прогревают до температуры 37°.

Кровь для определения отбирают из вены. По истечении 20 минут кровь центрифугируют при 1500 оборотов в минуту в течение 15 мин при +4°C для отделения сыворотки крови, которую сразу подвергают анализу.

В пробирку вносят 1 мл готового реагента, прогревают при температуре 37° не менее 30 секунд, добавляют 0,1 мл сыворотки крови, тщательно перемешивают, запускают секундомер. Измеряют оптическую плотность опытной пробы ровно через 1 минуту. Повторяют измерение 3 раза с интервалом 1 минута.

Вычисление: вычисляют среднее изменение оптической плотности за 1 минуту (ΔА/мин). Для расчета активности ACT в пробе полученное значение ΔА/мин умножают на фактор 1745.

Референтные значения: у мужчин не более 37 Ед/л, у женщин не более 31 Ед/л (по инструкциям к наборам согласно рекомендациям IFCC - Международной Федерации по Клинической Химии).

При снижении активности каталазы, увеличении активности аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы и количественного содержания перекисей в липидах диагностируют комбинированное воздействие смеси ароматических углеводородов и оксидов олефинов.

При увеличении активности аланинаминотрансферазы и количественного содержания перекисей в липидах диагностируют комбинированное воздействие оксидов олефинов.

При увеличении количественного содержания перекисей в липидах диагностируют комбинированное воздействие ароматических углеводородов.

Нами были обследованы работники (n=549) нефтехимического производства (ОАО «Нижнекамскнефтехим», республика Татарстан). Все обследованные работники были мужского пола, возраст которых составлял от 20 до 55 лет.

Контрольную группу составили 168 работников нефтехимического производства, не подвергающихся воздействию химических веществ. Группы обследованных работников и контроля были сопоставимы по возрасту, полу. Средний возраст обследованных работников составил 37,4±1,3 лет при стаже работы 13,7±1,6 лет, средний возраст работников контрольной группы - 38,8±0,7 лет при стаже работы 14,6±0,7 лет.

Установлено, что при воздействии на работников (n=315) смеси оксидов олефинов и ароматических углеводородов в сыворотке крови у них наблюдается увеличение содержания продуктов ПОЛ, увеличение активности АЛТ, ACT и каталазы крови (р<0,05); при воздействии на работников (n=86) оксидов олефинов увеличение активности АЛТ и увеличение содержания продуктов ПОЛ (р<0,05); при воздействии на работников (n=148) ароматических углеводородов в сыворотке крови выявлено только увеличение содержания продуктов ПОЛ (р<0,05).

Предлагаемый способ легко воспроизводим в условиях клинической лаборатории и при его использовании достигается указанный технический результат. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию «промышленная применимость».

Определение маркеров воздействия на работников указанных химических веществ имеет большое практическое значение, поскольку выявление начальных обратимых форм, профессиональных заболеваний от химического фактора, является одним из приоритетных направлений профилактических заболеваний.

Предлагаемый способ диагностики иллюстрируется следующим клиническим материалом:

Пример 1. Работник А., занятый в условиях производства простых полиэфиров. Содержание продуктов ПОЛ = 6,35 мкмоль/л, активность каталазы = 19,05 мКат/л, активность АСТ = 31,3 Ед/л, активность АЛТ = 51,9 Ед/л. Имеет место комбинированное воздействие на работников оксидов олефинов.

Пример 2. Работник В., занятый в условиях производства стирола. Содержание продуктов ПОЛ = 8,71 мкмоль/л, активность каталазы = 15,97 мКат/л, активность АСТ = 24,1 Ед/л, активность АЛТ = 26,0 Ед/л. Имеет место комбинированное воздействие на работников ароматических углеводородов.

Пример 3. Работник В., занятый в условиях производства полиэфирных смол. Содержание продуктов ПОЛ = 6,05 мкмоль/л, активность каталазы = 9,5 мКат/л, активность АСТ = 41,6 Ед/л, активность АЛТ = 46,5 Ед/л. Имеет место комбинированное воздействие на работников смеси ароматических углеводородов и оксидов олефинов.