Результат интеллектуальной деятельности: ПРИМЕНЕНИЕ УСТОЙЧИВЫХ К НИЗИНУ МУТАНТОВ ДЛЯ СНИЖЕНИЯ ПОСТ-ОКИСЛЕНИЯ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ

Настоящее изобретение относится к снижению пост-окисления пищевых продуктов.

Во время срока хранения, в частности хранения и транспортировки, в пищевых продуктах, содержащих живые микроорганизмы, микробиологическая метаболическая активность которых главным образом выражается через кислотообразование, рН продукта продолжает снижаться, вызывая ухудшение органолептических свойств и, в частности, слишком кислый вкус продукта в конце срока хранения. Этот механизм кислотообразования называется пост-окислением и хорошо известен. Эта проблема особенно заметна у продуктов, в которые не добавлены дополнительные сахара или ароматизаторы.

Для снижения этого явления продукты должны храниться при низких температурах, например при температуре 10°C. В развивающихся странах не всегда возможно хранение при низкой температуре и обеспечение полной холодильной цепи, и это является недостатком, очень сильно снижающим срок хранения пищевых продуктов.

Также предотвращение пост-окисления является очень важной проблемой в области производства пищевых продуктов.

До настоящего времени сообщалось о снижении кислотообразования за счет снижения числа активных клеток в заквасочной культуре или инактивации их в конечном продукте при использовании пастеризации. В некоторых из исследований показано, что антибактериальный агент низин, продуцируемый Lactococcus lactis subsp. lactis в среду, подавляет рост заквасочной культуры и контролирует образование кислот. В EP 0505164 описывается, что ферментированное молоко может быть получено добавлением в сырое молоко низинпродуцирующих молочнокислых бактерий, принадлежащих к роду Lactococcus lactis, вместе с другими молочнокислыми бактериями, используемыми для ферментации молочного сырья. Низин, продуцируемый и аккумулированный в ферментированном молоке, подавляет рост бактерий, вызывающих кислотообразование, контролируя, таким образом, повышение кислотности в процессе хранения и транспортировки. Kalra et al. (Indian Journal of Dairy Science 28: 71-72 (1975)) вводят низинпродуцирующую культуру Streptococcus lactis (в настоящее время известную как L. lactis subsp. lactis) вместе с йогуртовой культурой перед ферментацией. Другие вводят низин в молоко перед ферментацией (Bayoumi, Chem. mikrobiol. technol. lebensm. 13:65-69 (1991)) или после ферментации (Gupta et al., Cultured Dairy Products Journal 23: 17-18 (1988); Gupta et al., Cultured Dairy Products Journal 23: 9-10 (1989)). Во всех случаях скорость пост-окисления только частично ингибируется такой обработкой, и ферментированное молоко продолжает становиться кислее в течение срока хранения. Попытки остановить продуцирование кислоты йогуртовыми культурами путем добавления низина или низинпродуцирующей культуры перед или после ферментации молока не были успешными. Как указано выше, это оказывает воздействие на живые бактерии, которые представляют большой интерес для пищевой промышленности. В частности, сообщалось, что штаммы Lactobacillus casei group обладают свойствами, способствующими поддержанию здоровья, и используются в качестве пробиотиков в различных пищевых продуктах. Дополнительно, добавление культуры, продуцирующей низин (L. lactis), невозможно в случае получения йогурта для сохранения названия «йогурт».

Во-вторых, в предшествующем уровне техники было описано несколько штаммов с низким подкислением для контроля подкисления и пост-окисления свежего ферментированного продукта.

Пост-окисление по существу является результатом использования бактериями оставшейся лактозы в продукте. Для предотвращения этого предлагалось использование штаммов молочнокислых бактерий, которые не ферментируют лактозу или ферментируют ее очень слабо. В патентах EP 1078074 и EP 1893032 описываются молочнокислые бактерии, которые более не способны ферментировать лактозу или обладают низкой способностью ферментации лактозы в процессе хранения. Соответственно, патент EP 1078074 относится к мутантам L. Bulgaricus, не обладающим бета-галактозидазной активностью, содержащим нонсенс-мутацию по меньшей мере в одном из генов лактозного оперона, а в патенте EP 1893032 описываются мутанты, модифицированные по активности транспорта лактозы за счет мутации пермеазы лактозы. Однако эти решения не могут быть использованы при ферментации овощных, или фруктовых продуктов, или в молочных продуктах, содержащих сахара, иные, чем лактоза.

В EP 1802652 описывается решение для снижения популяции молочнокислых бактерий по окончании процесса ферментации за счет манипуляции концентрации аминокислот. Но это решение имеет высокую стоимость в рамках обязательно добавляемых аминокислот или специфических пептидов для обеспечения хорошего роста молочнокислых бактерий. Это решение показано только для Streptococcus thermophilus, что ограничивает применение.

В JP7236416 описывается решение, разработанное при использовании мутантов молочнокислых бактерий, устойчивых к неомицину с измененной H⁺-ATPase активностью. Предполагается, что бактерии останавливают подкисление, когда они более не способны продуцировать градиент pH между средой и цитоплазмой клетки. Однако применение бактерий, резистентных к антибиотикам, всегда спорно с точки зрения безопасности. Как правило, устойчивость к антибиотикам является критерием для отказа при отборе штамма.

Все решения имеют преимущества и недостатки в зависимости от типа применения. Следовательно, приветствуются новые решения, позволяющие избежать избыточного пост-окисления, в качестве различных инструментов для различных видов снижения пост-окисления.

Неожиданно авторы настоящего изобретения обнаружили, что добавление в пищевые продукты устойчивых к низину мутантов молочнокислых бактерий, в частности L. helveticus и L. bulgaricus, позволяет снизить пост-окисление.

Объект настоящего изобретения относится к применению в пищевых продуктах по меньшей мере одного устойчивого к низину мутанта для снижения пост-окисления.

Другой объект настоящего изобретения относится к способу снижения пост-окисления в пищевых продуктах и пищевому продукту, полученному этим способом.

Настоящее изобретение относится к применению по меньшей мере одного штамма молочнокислых бактерий, устойчивого к низину, для снижения пост-окисления в пищевом продукте.

Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «молочнокислые бактерии» относится ко всем видам рода Lactobacillus subsp. Они представляют очень важную часть группы молочнокислых бактерий для промышленности и по существу используются для ферментации молочных продуктов в комбинации с Streptococcus thermophilus. Также их используют в качестве пробиотиков в некоторых пищевых продуктах для оказания положительного влияния на состояние здоровья (Lebeer et al., 2008) [ссылка: Lebeer S., Vanderleyden J., and De Keersmaecker S. C. J. Genes and molecules of lactobacilli supporting probiotic action. Microbiology And Molecular Biology Reviews, Dec. 2008, 72(4), стр. 728-764].

Молочнокислые бактерии, как правило, выбирают из группы, состоящей из Lactobacillus helveticus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. delbrueckii subsp. delbrueckii, L. delbrueckii subsp. lactis, L. casei, L. paracasei, L. acidophilus, L. rhamnosus, L. plantarum, L. reuteri, L. brevis и L. fermentum.

Предпочтительно они принадлежат к видам L. helveticus, L. delbrueckii и их подвидам, в частности L. delbrueckii subsp. bulgaricus.

Конкретные предпочтительные молочнокислые бактерии выбирают из группы, состоящей из CNCM I-4452, CNCM I-4453 и CNCM I-4454.

Молочнокислые бактерии, используемые в настоящем изобретении, предпочтительно получены из материнских штаммов, выбранных из группы, состоящей из L. bulgaricus CNCM I-2836 и L. helveticus CNCM I-3435.

В настоящем изобретении используемые молочнокислые бактерии предпочтительно представляют живые бактерии. Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «живые» относится к молочнокислым бактериям, которые живы во время использования и в продукте до окончания его срока хранения, в частности, в течение 28 дней при температуре 10°C. Это состояние очень важно, в частности, в йогуртах, для которых официальные нормативные документы (кодекс Алиментариус (codex Alimentarius), разработанный Комиссией кодекса Алиментариуса под руководством ФАО и ODM и опубликованный информационным дивизионом ФАО, доступный он-лайн на http://www.codexalimentarius.net) требуют, чтобы продукт обозначался как йогурт, если он содержит по меньшей мере один штамм S. thermophilus и по меньшей мере один штамм L. bulgaricus в живой форме в количестве по меньшей мере 1*10⁷ КОЕ/г молочной части продукта.

Штаммы молочнокислых бактерий, по существу более подходящие для применения в настоящем изобретении, имеют устойчивость к низину по меньшей мере 6,25 мкг/мл M.I.С, в частности по меньшей мере 12,5 мкг/мл M.I.C. Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «MIC» относится к минимальной ингибирующей концентрации и обозначается в описании настоящей патентной заявки как самая низкая концентрация низина, которая ингибирует рост молочнокислых бактерий после инкубации в течение ночи. MIC может быть определена при использовании нескольких хорошо известных методов, таких как метод микроразведения в жидкой или твердой среде (Klare et al., 2005). Ссылка Ingo Klare, Carola Konstabel, Sibylle Muller-Bertling, Rolf Reissbrodt, Geert Huys, Marc Vancanneyt, Jean Swings, Herman Goossens, and Wolfgang Witte Evaluation of New Broth Media for Microdilution Antibiotic Susceptibility Testing of Lactobacilli, Pediococci, Lactococci, and Bifidobacteria Applied and Eenvironmental Microbiology, 2005, 8982-8986, 71(12).

Как хорошо известно из предшествующего уровня техники, низин представляет собой пищевой антимикробный пептид, лантибиотик, полученный при использовании нескольких штаммов Lactococcus lactis, и действует против широкого ряда граммположительных бактерий. Низин очень важен для пищевой промышленности, где его используют для контроля роста споровых форм в консервированных продуктах и нежелательной микробиологической флоры в молочных продуктах.

В настоящем изобретении низин не используют, как указано выше, а используют в качестве селективного агента для отбора штаммов со свойствами низкого пост-окисления. Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «молочнокислые бактерии, устойчивые к низину» относится к штаммам, отобранным для роста в присутствии низина. Другими словами, штаммы, которые способны расти с низином, были выделены из культуры молочнокислых бактерий дикого типа.

Также используемый в описании настоящей патентной заявки термин «пищевой продукт» относится к продуктам, выбранным из группы, состоящей из молочных продуктов, фруктовых соков, овощных продуктов, смесей для детского питания, сухого молока.

В одном предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения пищевой продукт представляет собой ферментированный продукт. Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «ферментированный пищевой продукт» относится к пищевому продукту, подвергшемуся по меньшей мере одной стадии ферментации.

В предпочтительном конкретном варианте выполнения настоящего изобретения ферментированные продукты выбирают из группы, состоящей из ферментированных молочных продуктов, ферментированных соков, ферментированных овощных продуктов.

Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «ферментированные соки» относится к продукту, полученному ферментацией фруктовых соков, в частности апельсинового сока, лимонного сока, персикового сока.

Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «ферментированные овощные продукты» относится к продукту, полученному ферментацией овощных соков, включая соевый сок, овсяный сок и рисовый сок, или ферментацией источника растительного молока, или ферментацией овощей в твердом состоянии.

В одном более предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения ферментированные молочные продукты выбирают из группы, состоящей из йогуртов, ферментированного молока, ферментированных молочных смесей для детского питания, ферментированных напитков. Используемые в описании настоящей патентной заявки термины «ферментированное молоко» и «йогурт» имеют значение, в котором они обычно используются в молочной промышленности, то есть продукты, предназначенные для потребления животными, в частности людьми, и полученные подкислением за счет молочнокислой ферментации молочного субстрата (животное молоко, в частности коровье молоко). Указанные продукты могут содержать вспомогательные ингредиенты, такие как фрукты, овощи, сахара, ароматизаторы, крахмал, загустители и тому подобное, подходящие для потребления человеком или животным. В частности, определение «ферментированное молоко» (указа номер 88.-1203 от 30 декабря 1988) относится к молочному продукту, полученному из обезжиренного или необезжиренного молока или концентрированного молока, или сухого молока, подвергшегося тепловой обработке, по меньшей мере эквивалентной пастеризации, в который внесены микроорганизмы, продуцирующие молочную кислоту, такие как молочнокислые бактерии (Lactobacillus acidophilus, L. casei, L. plantarum, L. reuteri, L. johnsonii), некоторые стрептококки (Streptococcus thermophilus), бифидобактерии (Bifidobacterium bifidum, B. longum, B. short, B. animalis) и лактококки. Дополнительно, используемый в описании настоящей патентной заявки термин «йогурт» относится к ферментированному молоку, полученному при использовании стандартных методов, при использовании специфических термофильных молочнокислых бактерий, указанных как Lactobacillus bulgaricus (также указанные как Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus) и Streptococcus thermophilus, которые должны быть живыми в конечном продукте в количестве по меньшей мере 1*10⁷ КОЕ S. thermophilus и L. bulgaricus bacteria на грамм продукта, выраженного как молочная часть продукта.

Предпочтительно согласно настоящему изобретению ферментированные пищевые продукты ферментированы при использовании по меньшей мере одного штамма молочнокислых бактерий, устойчивых к низину.

В одном более предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения пищевой продукт содержит другие живые бактерии, выбранные из группы, состоящей из Streptococcus spp.; Lactobacillus spp, в частности, L. bulgaricus, L. acidophilus и L. casei; L. helveticus, Lactococcus spp. и Bifidobacterium spp.

В одном более предпочтительном варианте выполнения настоящего изобретения пищевой продукт хранят при комнатной температуре или при температуре от 0°C до 25°C, более предпочтительно при температуре от 4°C до 10°C, еще более предпочтительно при температуре от 6°C до 8°C в течение по меньшей мере 20 дней, более предпочтительно по меньшей мере 28 дней. В качестве альтернативы, пищевой продукт может храниться при температуре от 0°C до 25°C и при комнатной температуре или наоборот. В последнем случае холодильная цепочка разрушена.

Согласно настоящему изобретению пищевой продукт имеет пониженное пост-окисление по сравнению с пищевым продуктом, в котором не использовали молочнокислые бактерии, устойчивые к низину. Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «снижение пост-окисления» относится к способности молочнокислых бактерий, устойчивых к низину, продуцировать меньше кислоты в процессе хранения пищевого продукта. В настоящем изобретении молочнокислые бактерии, устойчивые к низину, имеют более низкое пост-окисление, чем материнский штамм, из которого они получены. При тех же условиях хранения (28 дней хранения при температуре 4°C) ΔрН (разница между pH на день 0 (D0) и pH на 28 день (D28)) составляет порядка 0,3 в случае материнских штаммов, и ΔрН составляет порядка от 0,1 до 0,2 в случае мутантных штаммов.

Согласно настоящему изобретению снижение пост-окисления представляет собой снижение ΔрН по меньшей мере на 0,1 pH единицу (upH), в частности на 0,2 upH.

Настоящее изобретение также относится к способу снижения пост-окисления в пищевых продуктах, где указанный способ включает стадию добавления по меньшей мере одного штамма молочнокислых бактерий, устойчивых к низину, в матрицу пищевого продукта.

Используемый в описании настоящей патентной заявки термин «матрица пищевого продукта» относится к пищевому продукту перед добавлением молочнокислых бактерий, устойчивых к низину, в частности, относится к продуктам, выбранным из группы, состоящей из молочных продуктов, фруктовых соков, овощных продуктов, смесей для детского питания, сухого молока.

В преимущественном варианте выполнения способа по настоящему изобретению молочнокислые бактерии выбирают из группы, состоящей из Lactobacillus helveticus, L. casei, L. paracasei, L. acidophilus, L. rhamnosus, L. plantarum, L. reuteri, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. delbrueckii subsp. lactis, L. delbrueckii subsp. delbrueckii, L. brevis и L. fermentum.

В преимущественном варианте выполнения способа по настоящему изобретению молочнокислые бактерии выбирают из группы, состоящей из CNCM I-4452, CNCM I-4453 и CNCM I-4454.

В предпочтительном варианте выполнения способа по настоящему изобретению штамм имеет устойчивость к низину по меньшей мере 6,25 мкг/мл M.I.C, предпочтительно по меньшей мере 12,5 мкг/мл M.I.C.

Согласно предпочтительному варианту выполнения способа по настоящему изобретению добавление молочнокислых бактерий, устойчивых к низину, проводят перед или после стадии ферментации ферментированного пищевого продукта. В случае не ферментированного продукта добавление молочнокислых бактерий, устойчивых к низину, проводят перед хранением.

Согласно предпочтительному варианту выполнения ферментированные продукты выбирают из группы, состоящей из ферментированных молочных продуктов, ферментированных соков и ферментированных овощных продуктов.

Согласно предпочтительному варианту выполнения способа по настоящему изобретению ферментацию проводят в присутствии по меньшей мере одного другого вида живых бактерий.

Указанные живые бактерии выбирают из группы, состоящей из Streptococcus spp.; Lactobacillus spp, в частности L. bulgaricus, L. acidophilus и L. casei; L. helveticus, Lactococcus spp. и Bifidobacterium spp.

В преимущественном варианте выполнения способ по настоящему изобретению включает следующие стадии:

a) обеспечение штамма молочнокислых бактерий, устойчивого к низину,

b) инокуляцию пищевой матрицы штаммом, полученным на стадии a),

с) ферментацию инокулированного пищевого продукта при температуре от 4°C до 50°C до достижения заданного целевого pH,

d) извлечение и хранение продукта, полученного на стадии c), при температуре от 4 до 40°C в течение по меньшей мере 28 дней.

В конкретном варианте выполнения настоящего изобретения показатель целевого pH составляет от 3,6 до 5,0.

Также настоящее изобретение относится к пищевому продукту, получаемому способом по настоящему изобретению.

Продукт по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой ферментированный молочный продукт.

Также настоящее изобретение относится к мутантному штамму L. bulgaricus, депонированному в соответствии с условиями Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры 10 марта 2011 г. в CNCM [национальная коллекция культур микроорганизмов] в институте Пастера под номером I-4452.

Также настоящее изобретение относится к мутантному штамму L. bulgaricus, депонированному 3 марта 2011 г. в CNCM под номером I-4453, мутантному штамму L. helveticus, депонированному 10 марта 2011 г. в CNCM под номером I-4454. Эти штаммы получены из L. bulgaricus CNCM I-2836 (депонированный в CNCM 4 апреля 2002 г.) и L. helveticus CNCM I-3435 (депонированный в CNCM 25 мая 2005 г.), соответственно. Мутантные штаммы CNCM I-4452, 4453 и 4454 обладают устойчивостью к низину по меньшей мере 6,25 мкг/мл M.I.C, в частности по меньшей мере 12,5 мкг/мл M.I.C.

Также настоящее изобретение относится к мутантным штаммам L. bulgaricus и L. helveticus, характеризующимся тем, что указанные мутанты обладают устойчивостью к низину по меньшей мере 6,25 мкг/мл M.I.C, в частности по меньшей мере 12,5 мкг/мл M.I.C.

Следовательно, настоящее изобретение относится к молочной закваске (заквасочной культуре), содержащей по меньшей мере один мутантный штамм, как указано выше. Согласно конкретному варианту выполнения настоящего изобретения молочная закваска по изобретению содержит по меньшей мере один мутантный штамм L. bulgaricus и/или L. helveticus, скомбинированный по меньшей мере с одним другим штаммом молочнокислых бактерий, например, Streptococcus spp., Lactobacillus spp, в частности L. bulgaricus, L. acidophilus и L. casei; L. helveticus, Lactococcus spp и Bifidobacterium spp.

ЧЕРТЕЖИ

Настоящее изобретение проиллюстрировано следующими чертежами:

На фиг.1 представлена кинетика подкисления штаммом CNCM I-2836 и клонами I-4452 и I-4453. Ось ординат соответствует pH, а ось абсцисс соответствует времени (в часах). Черная линия соответствует штаммам L. bulgaricus CNCM I-4452. Серая линия соответствует штаммам L. bulgaricus CNCM I-4453. Серая линия с кругом (которая дает толстую серую линию с множеством галочек в виду большого количества данных или экспериментальных точек) соответствует штаммам L. bulgaricus CNCM I-2836.

На фиг.2 представлено измерение pH и кислотности 3 свежих молочных продуктов (с I-2836, I-4453 или I-4452) после 28 дней хранения. Гистограмма представляет измерения кислотности в течение 28 дней (в °D), и кривая представляет измерения pH в течение 28 дней.

ПРИМЕРЫ

Далее настоящее изобретение будет описано со ссылкой на примеры, которые приведены только для иллюстрации и не ограничивают объем притязаний настоящего изобретения.

ПРИМЕР 1: ПОЛУЧЕНИЕ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ, УСТОЙЧИВЫХ К НИЗИНУ

Выбранные для такого применения материнские штаммы I-2836 и I-3435 представляют промышленные штаммы, используемые для получения ферментированного молока, и продемонстрировали значительное пост-окисление в процессе хранения.

1) Оценка чувствительности Lactobacillus bulgaricus и L. helveticus к низину

Для оценки чувствительности штаммов L. bulgaricus I-2836 и L. helveticus I-3435 к низину штаммы вырастили в ряде пробирок с MRS, содержавших повышенные количества низина. После 16 часов при температуре 37°C измерили оптическую плотность каждой культуры.

2) Получение молочнокислых бактерий, устойчивых к низину

Штаммы L. bulgaricus I-2836 и L. helveticus I-3435 вырастили в MRS среде с ингибирующей концентрацией низина. После 16 часов при температуре 37°C центрифугировали 10 мл культуры. Осадок суспендировали в 100 мкл пептон-солевого раствора и распылили на агаровую MRS среду в чашках Петри. Кусочек промокательной бумаги поместили в середину чашки и затем пропитали 15 мкл раствора низина 2,5 мг/мл. После 72-часовой инкубации при температуре 37°C в зоне ингибирования вокруг диска из промокательной бумаги появились устойчивые клоны. Клоны, расположенные ближе всего к диску, брали на анализ. В частности, их чувствительность к низину протестировали в жидкой среде при использовании повышенных количеств концентрации низина.

Все полученные клоны, в частности I-4452, I-4453 и I-4454, имели минимальную ингибирующую концентрацию по меньшей мере 6,25 мкг/мл мкМ. Такой MIC подтверждает устойчивость клонов к низину.

Затем полученные клоны I-4452 и I-4453 тестировали ферментацией молока. Кинетика подкисления обеспечила информацию о способности этих клонов подкислять молоко.

3) Кинетика подкисления молока клонами, полученными из штамма I-2836

a) Получение свежего молочного продукта

Инокулят заквасочных культур состоял из:

- штамма I-4452,

- штамма I-4453,

- штамма I-2836.

Штаммы выращивали дважды в MRS среде, содержавшей 6,25 мкг низина/мл.

Заквасочные культуры получили в 100 мл стерилизованного молока (135 г/л сухого молока и 2 г/л экстракта дрожжей). Показатель инокуляции составил 2%, и молоко инокулировали при температуре 44°C до достижения 70 градусов кислотности Дорника. Ферментированное молоко хранили в течение ночи при температуре 4°C.

Молочные продукты получили из 100 мл стерилизованного молока инокуляцией указанной выше смесью культур. Культуры выращивали при температуре 44°C до достижения показателя pH около 4,75. Затем их охладили до температуры 4°C и хранили при температуре 4°C в течение 28 дней.

b) Результаты кинетики подкисления

Кинетику подкисления отслеживали непрерывно при использовании системы CINAC (Ysebaert, France), которая позволяла непрерывно измерять показатели pH.

Из фиг.1 видно, что кинетика подкисления была более медленной у клонов, чем у материнского штамма I-2836.

4) Измерение pH и кислотности свежего молочного продукта после 28 дней хранения

Проводили измерение 3 свежих молочных продуктов, содержавших 2 клона, полученных из штамма I-2836 (I-4452 и I-4453), и один, содержавший штамм I-2836.

Кислотность измерили после 28 дней хранения при температуре 4°C.

Эти результаты приведены на фиг.2.

Продукты с молочнокислыми бактериями, устойчивыми к низину, продемонстрировали только слабое пост-окисление после 28 дней.