СПОСОБ ГЕНЕРАЦИИ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ КЛЕТОК С АКТИВНОСТЬЮ ПРОТИВ КЛЕТОК НЕМЕЛКОКЛЕТОЧНОГО РАКА ЛЕГКОГО

Изобретение относится к иммунологии и биотехнологии, а именно к способам генерации клеток с цитостатической активностью против клеток немелкоклеточного рака легкого.

Первое место в структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями мужского населения России на 2012 год занимают опухоли трахеи, бронхов, легкого (18,7%), при этом средний возраст заболевших составляет 64,6 лет. В структуре смертности обоих полов населения России от злокачественных новообразований наибольший удельный вес составляют опухоли трахеи, бронхов, легкого (17,3%). [Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. Злокачественные новообразования в России в 2012 году (заболеваемость и смертность) М.: ФГБУ «МНИОИ им. П.А. Герцена» Минздрава России. - 2014. илл. - 250 с. ISBN 978-5-85502-193-6]. Хотя операция рассматривается как оптимальное лечение, только в 25-30% случаев немелкоклеточного рака легкого опухоли потенциально резектабельны. 5-летняя выживаемость после оперативного вмешательства для Ia стадии немелкоклеточного рака легкого составляет до 73% и 25% для IIIa стадии [Besse В., Le Chevalier Т. Developments in the treatment of early NSCLC: when to use chemotherapy // Annals of Oncology. - 2012. - 23. - V 23 (10). - p. 52-59]. Согласно рекомендациям в качестве химиотерапии первой линии предпочтительнее использовать комбинации на основе производных платины, при этом частота лечебного эффекта составляет 20-40%, а медиана общей выживаемости (ОВ) - 7-12 мес [Azzoli С.G., Baker S.Jr., Temin S. et al. American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guideline update on chemotherapy for stage IV nonsmallcell lung cancer // J. Clin. Oncol. - 2009. - Vol. 27. - Р.6251-6266].

В основе патогенеза злокачественных новообразований может лежать ряд причин, среди которых нарушение механизмов иммунной регуляции, низкая иммуногенность опухоли, подавление функциональной активности антиген-презентирующих клеток, таких как дендритные клетки [Pinzon-Charry Α., Maxwell Т., López J.A. Dendritic cell dysfunction in cancer: a mechanism for immunosuppression Review // Immunol Cell Biol. - 2005. - V. 83(5). - P. 451-61], у которых в процессе канцерогенеза возникает большая вероятность изменения механизмов дифференцировки в зрелые формы и кросс-презентации антигенов [Gabrilovich D. Mechanisms and functional significance of tumour-induced dendritic-cell defects Review // Nat Rev Immunol. - 2004. - V. 4(12). - Р. 941-52]. Дендритные клетки принадлежат к профессиональным антиген-презентирующим клеткам, обладают уникальной способностью к захвату антигена, его процессингу и представлению в комплексе с HLA I или II для праймирования наивных Т-клеток или активации Т-клеток, со свойствами натуральных киллеров, во вторичных лимфоидных органах [Lan Ch.-Y., Liu Ji-H., Xia J-Ch., Zheng Li-M., Biological characteristics of dendritic cells derived from peripheral blood of patients with epithelial ovarian cancer // Chinese Journal of Cancer - 2009 - V. 28 (2). - P. 132-137]. В настоящее время наряду с прочими методами консервативной терапии злокачественных новообразований специфическая иммунотерапия является современным и перспективным способом лечения, основной целью которой является индукция и поддержание длительного иммунного ответа, направленного на распознавание и элиминацию опухолевых клеток [Stiff P. J., Czerlanis Ch., Drakes M. L. Dendritic cell immunotherapy in ovarian cancer // Expert Rev. Anticancer Ther. - 2013. - V. 13 (1). - Р. 43-53]. Особую роль в иммунотерапии занимает развитие новых подходов, в частности вакцинотерапия на основе дендритных клеток. Конечная цель реализации эффекта такой ДК-вакцинотерапии заключается в достижении достаточной иммуногенности опухолевых антигенов; создании условий для их эффективной презентации; преодолении местной или системной иммуносупрессии [Zhang S., Li W.F., Zhang H.J., Wang Q. Antitumor reactivity of splenocytes primed in vivo with dendritic-cell-based vaccine and secondarily activated with a cocktail of cytokines in vitro // Exp Oncol. - 2004. - V. 26 (3). - P. 243-245]. В настоящее время ведутся исследования по оптимизации подходов получения и применения дендритных клеток для формирования клеточного цитотоксического противоопухолевого иммунного ответа. Одним из способов преодоления негативных последствий, вызванных канцерогенезом, и усиления эффективности противоопухолевого иммунного ответа является получение дендритных клеток онкологического больного, нагруженных антигеном ex vivo, применяя в качестве адъювантов рекомбинантные цитокины (IL-2, IFN-α, GM-CSF) [Santini S., Lapenta С, Logozzi M., Parlara S., Spada M., Di Pucchio T., Bellardelli F. Type I Interferon as a powerful adjuvant for monocyte derived dendritic cells development and activity in vitro and in HU-PBL-SCID mice // J. Exp. Med. - 2000 - V. 191. - P. 1777-1788]. В литературе описан способ (прототип), при котором незрелые ДК получали из моноцитов прилипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК) периферической крови больных немелкоклеточным раком легкого путем культивирования в полной среде с добавлением рекомбинантного человеческого гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (рчГМ-КСФ) и интерлейкина-4 (рчИЛ-4) в течение 7 дней. Нагружение антигенами осуществлялось путем совместного культивирования незрелых ДК с опухолевым лизатом в течение 16 часов. На 8-й день достигалось окончательное созревание дендритных клеток путем добавления рекомбинантного человеческого фактора некроза опухоли-α (рчФНО-α) на 24 часов. Таким образом, весь процесс генерации нагруженных лизатом, зрелых ДК занял 9 суток. Далее, полученные ДК вводились интранодально пациентам, больным немелкоклеточным раком легкого. Затем оценивали клинический эффект вакцинации. Была доказана безопасность и хорошая переносимость вакцинации, а также незначительное либо умеренное повышение Т-клеточного ответа против опухолевых антигенов после вакцинации у шести из восьми пациентов, хотя стабилизация заболевания отмечена только у двух [Chang G.-C, Lan H.-Ch., Juang S.-H., Wu Y.-Ch., Lee H.-Ch., Hung Y.-M., Yang H.-Y., Peng J. W., LiuK.-J. A pilot clinical trial of vaccination with dendritic cells pulsed with autologous tumor cells derived from malignant pleural effusion in patients with late-stage lung carcinoma // Cancer. - 2005. - V. 103 (4) - P. 763-771].

Описанный способ получения антиген-активированных дендритных клеток достаточно длителен (9 суток), а также требует использования большого объема рекомбинантных цитокинов (рчГМ-КСФ, рчИЛ-4, рчФНО-α). Все это ведет к значительному удорожанию технологии.

Тип иммунного ответа с преимущественным развитием тканевого воспаления, гуморальных или клеточных реакций определяется в первую очередь тем, как антиген взаимодействует с антиген-представляющими клетками и какие цитокины при этом синтезируются. Одним из регуляторов клеточного иммунного ответа является ИЛ-12. Впервые описан в 1989 г.в качестве активатора натуральных киллеров (НК) и цитотоксических лимфоцитов. Источники его синтеза - моноциты, макрофаги, дендритные клетки, нейтрофилы, В-лимфоциты. Этот цитокин стимулирует дифференцировку Т-лимфоцитов в Thl, усиливает синтез ИФН-γ и IgG и тем самым индуцирует противоопухолевый иммунный ответ. Известно применение ИЛ-12 с другим провоспалительным цитокином ИЛ-18, который также активирует продукцию ИФН-γ Τ- и НК-клетками. Показано, что такой синергический эффект ИЛ-12 и ИЛ-18 вызывает стимуляцию продукции ИНФ-γ [Munk R.В., Sugiyama К., Ghosh P., Sasaki С.Y., Rezanka L., Banerjee К., Takahashi H., Sen R., Longo D.L. Antigen-independent IFN-γ production by human naive CD4+ Τ Cells activated by IL-12 Plus IL-18 // Plos One. - 2011, Vol. 6 (5). - e18553].

Задачей настоящего изобретения является создание эффективного и экономичного способа генерации цитотоксических клеток из клеток периферической крови больных немелкоклеточным раком легкого.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в следующем: Мононуклеарные клетки неприлипшей фракции периферической крови больных немелкоклеточным раком легкого культивируют с нагруженными лизатом дендритными клетками, полученными из моноцитов прилипшей фракции МНК. Нагрузка дендритных клеток антигенами проводится с использованием аутологичных опухолевых клеток, а для созревания ДК используют рекомбинантные человеческие провоспалительные цитокины - фактор некроза опухоли (рчФНО-α) интерлейкин 1β (ИЛ-1β).

Техническим результатом изобретения является генерация in vitro клонов Т-клеток с активностью Т-хелперов 1 типа, необходимых для формирования эффективного противоопухолевого ответа против клеток немелкоклеточного рака легкого.

Задачей изобретения является повышение эффективности генерации цитотоксических клеток, а также сокращение сроков сокультивирования ДК и МНК, что в итоге приводит к снижению стоимости способа.

Для решения поставленной задачи предложен способ генерации цитотоксических клеток с активностью против клеток немелкоклеточного рака легкого, в котором для совместного культивирования в присутствии рекомбинантного человеческого интерлейкина-12 и рекомбинантного человеческого интерлейкина-18 используют неприлипающую фракцию мононуклеарных клеток (МНК), выделенных из периферической крови больного немелкоклеточным раком легкого, и дендритные клетки, полученные из моноцитов прилипающей фракции МНК, для получения зрелых ДК после трех суток культивирования прилипающей фракции МНК, полученные незрелые ДК сначала сутки сокультивируют с опухолевым лизатом клеток немелкоклеточного рака легкого с последующим добавлением ФНО-α, в течение суток после нагружения лизатом одновременно с добавлением провоспалительного цитокина ФНО-α вносят цитокин ИЛ-1β и проводят созревание нагруженных лизатом ДК в присутствии обоих цитокинов.

Изобретение осуществляется следующим образом.

Выделенная из периферической крови больных немелкоклеточным раком легкого прилипающая фракция мононуклеарных клеток культивируется в концентрации 1 млн/мл в полной среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глютамина, 10 мМ HEPES, 5×10^-5 мМ 2-меркаптоэтанола, 80 мкг/мл гентамицина, 100 мкг/мл ампициллина в атмосфере 5% CO₂ при 37°С с добавлением рчГМ-КСФ (50 нг/мл), рчИЛ-4 (100 нг/мл). Через 72 часа (трое суток) культивирования к полученным незрелым ДК добавляется опухолевый антиген (лизат аутологичных опухолевых клеток) в дозе 100 мкг/мл, а еще через 24 часа (одни сутки) для созревания незрелых дендритных клеток в течение последующих 24 часов (одни сутки) вносится рчФНО-α в дозе 25 нг/мл и рчИЛ1-β в дозе 10 нг/мл.

Полученные за пять суток зрелые нагруженные лизатом дендритные клетки культивируются с неприлипшей фракцией мононуклеарных клеток в соотношении 1:10 с добавлением рчИЛ-12 в дозе 10 нг/мл и рчИЛ-18 в дозе 100 нг/мл.

Для определения индукции цитотоксической активности Т-лимфоцитов с помощью полученных ДК оценивали гибель опухолевых клеток в цитотоксическом тесте. Для этого к мононуклеарным клеткам больного, которые предварительно сокультивировали со зрелыми нагруженными лизатом ДК, добавляли аутологичные опухолевые клетки. Цитотоксичность оценивали по увеличению содержания высвободившегося из клетки фермента лактатдегидрогеназы в кондиционной среде в результате гибели опухолевых клеток. Показано достоверное повышение значения цитотоксичности МНК, культивированных в присутствии зрелых нагруженных лизатом ДК, рчИЛ-12 и рчИЛ-18 по сравнению с контрольными группами, что служит показателем активации противоопухолевых цитотоксических клеток, необходимых для уничтожения опухолевых клеток (табл.1).

Совместное культивирование ДК и МНК больного немелкоклеточным раком легкого в сочетании с рчИЛ-12 и рчИЛ-18 усиливает индукцию ответа Т хелперов 1 типа, что статистически достоверно увеличивает цитотоксическую активность мононуклеарных клеток in vitro.

Существенным достоинством предложенного способа является то, что для получения цитотоксических лимфоцитов с активностью против аутологичных опухолевых клеток в способе используются ДК, генерированные за 5 суток (вместо 9) с применением в качестве созревающих факторов одновременного добавления цитокинов ФНО-α и ИЛ-1β.

Таким образом, в результате проведенных исследований разработан способ генерации противоопухолевых цитотоксических клеток с активностью против клеток немелкоклеточного рака легкого.