×
10.01.2016
216.013.9f00

Результат интеллектуальной деятельности: АНТИБИОТИК ИНА 5812, ШТАММ-ПРОДУЦЕНТ Streptomyces roseoflavus ИНА-Ас-5812 И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА

Вид РИД

Изобретение

Аннотация: Изобретение относится к области биохимии, в частности к биологически активным соединениям, проявляющим антибактериальную активность. Заявлен природный гликопептидный антибиотик ИНА 5812, который может быть применен в качестве лекарственного препарата в медицинской практике. Также изобретение относится к штамму-продуценту Streptomyces roseoflavus ИНА-Ас-5812, образующему антибиотик ИНА 5812, и способу получения антибиотика ИНА 5812. Изобретение позволяет получить новый антибактериальный препарат с высокими показателями антибактериальной и химиотерапевтической активности и низкими значениями острой токсичности. 3 н.п. ф-лы, 4 табл.

Изобретение относится к биологически активным соединениям, проявляющим антибактериальную активность, а именно антибиотику ИНА 5812, который может быть применен в качестве лекарственного препарата в медицинской практике.

Предлагаемое соединение, штамм-продуцент и способ получения антибиотика в патентной и научно-технической литературе не описан.

Предлагаемее природное соединение, антибиотик ИНА 5812, относится к группе гликопептидных соединений, характеризующихся пептидной структурой из аминокислотных цепей и присутствием сахарного остатка.

Антибиотики этой группы обладают активностью в отношении грамположительных бактерий и микобактерий, в том числе и Mycobacterium tuberculosis. Преимуществом гликопептидных антибиотиков перед рядом антибиотиков других групп является бактерицидный тип действия и высокая активность в отношении микроорганизмов, устойчивых ко многим препаратам, включая β-лактамные антибиотики и фторхинолоны. Поиск новых лекарственных средств гликопептидного строения, менее токсичных и более активных, перспективен среди продуктов биосинтеза культур актиномицетов. Из числа таких природных гликопептидных соединений в настоящее время в медицинской практике применяются противобактериальные антибиотики ванкомицин, тейкопланин и рамапланин, эффективные при тяжелых гнойно-септических заболеваниях, вызываемых грамположительными микроорганизмами, особенно стафилококками, в том числе метициллинрезистентными штаммами (MRSA), энтерококками, пневмококками, стафилококковом сепсисе, а также мембранном колите в связи с их высокой активностью в отношении анаэробного возбудителя Clostridium difficile.

Целью изобретения является создание природного гликопептидного антибиотика, обладающего противобактериальной активностью и расширяющего арсенал средств воздействия на грамположительные бактерии.

Цель достигается выделением почвенного штамма Streptomyces roseoflavus ИНА-Ас-5812-продуцента нового гликопептидного антибиотика ИНА 5812, обладающего высокой антибактериальной активностью. Антибиотик ИНА 5812, образующийся при культивировании нового штамма ИНА-Ас-5812, имеет мол. массу (метод MALDI-TOF-MS) 1917,8 Да.

Антибиотик дает положительные реакции на свободные аминогруппы (с нингидрином), на углеводы (реакции Молиша и Фелинга), на фенольные гидроксилы (с FeCl3 и реакция Паули). Обладает сильной голубой флуоресценцией в УФ-свете и характерным УФ-спектром с λmax (метанол) при 237, 262 и 360 нм. В ИК-спектре имеются сильные полосы поглощения в области: νmax, см-1: 3301; 3062; 2927; 1645; 1538; 1382; 1231; 1072; 1003; 702.

Характерным отличительным признаком антибиотика ИНА 5812 как гликопептидного соединения является аминокислотный состав. В кислотном гидролизате антибиотика обнаружены следующие аминокислоты: β-аланин, глицин, орнитин, тирозин, α,β-диаминомасляная кислота, аланин, пролин, лейцин, аспарагиновая кислота, серии и три небелковые аминокислоты. Антибиотик содержит нейтральный сахар арабинозу.

Сущность изобретения состоит в том, что получен новый штамм-продуцент Streptomyces roseoflavus в результате систематического скрининга почвенных культур стрептомицетов, образующих противобактериальные гликопептидные антибиотики.

Полученный новый штамм депонирован в коллекции культур ФГБУ НИИНА им. Г.Ф. Гаузе РАМН под номером ИНА-Ас-5812.

Штамм ИНА-Ас-5812 накапливает антибиотик в культуральной жидкости (2-5 мкг/мл) и характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиологическими признаками.

Культурально-морфологические и физиологические признаки штамма ИНА-Ас-5812

Температура (28-37)°C; длительность выращивания (7-21) сутки. Споровый посевной материал десятидневной культуры штамма, выращенной на глицериннитратной агаровой среде Линденбайна. Цвет определен по таблице Бондарцева и Праузера (Таблица 1).

Морфологические признаки. Цепочки спор прямые, извитые, поверхность спор гладкая.

Физиолого-биохимические свойства. Аэроб. Растет при (24-37)°C, оптимум роста 28°C и в диапазонах значений pH (5,0-10,0) с оптимумом роста при pH 7,0; желатину разжижает. Молоко пептонизирует. Сахарозу инвертирует. Крахмал гидролизует. На клетчатке не растет. Восстанавливает нитраты до нитритов. Меланоидные пигменты не образует при росте на среде Треснера с пептоном и лимоннокислым железом. Отношение к углеводам: хорошо использует фруктозу, мальтозу, рамнозу; умеренно глюкозу, арабинозу, лактозу; слабо использует сахарозу, сорбит, маннит; не использует рафинозу и целлюлозу при росте на средах с неорганическим источником азота.

Хранение. Штамм хранится в виде спор на стерильной почве с кварцевым песком или на зернах пшена, а также в виде зрелой культуры на агаровых средах под вазелиновым маслом.

Антагонистические свойства. При испытании методом штриха на глюкозо-нитратном агаре №2 Гаузе штамм подавляет рост грамположительных бактерий и дрожжеподобных грибов. Штамм фагоустойчив. Фаг в культуре отсутствует.

Изобретение поясняется следующим примером.

Пример. Для получения спорового материала культуру Streptomyces roseoflavus штамм ИНА-Ас-5812 выращивают в течение (7-10) суток при 37°C на агаровой среде №2 Гаузе следующего состава, %:

Триптон 0,3
Глюкоза 1,0
Пептон 0,5
Агар 3,0
NaCl 0,5
Вода Водопроводная
pH до стерилизации 7,0-7,2

Среду стерилизуют в течение 30 мин при давлении в 1,0 атм и температуре 120°C.

Для получения посевного мицелия споры культуры засевают на питательную среду следующего состава, %:

Бульон Хоттингера (28-30 мг % аминного азота) 3,0
Пептон 0,5
Глюкоза 1,0
Кальция карбонат 0,2
Натрий хлористый 0,5
Вода Водопроводная
pH до стерилизации 7,0-7,2

Посевной материал выращивают при 28°C в течение 48 час в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл, количество среды в колбах 150 мл. Скорость вращения качалки (200-240) об/мин. Количество посевного материала для инокуляции - (5-7)%.

Ферментация проводится на качалке при 28°C на среде (100 мл в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл) следующего состава, %:

Соевая мука 3,0
Глюкоза 3,0
NaCl 0,3
CaCO3 0.3
Вода Водопроводная
pH до стерилизации 7,0-7,2

Антибиотик накапливается в культуральной жидкости продуцента.

Антибиотическую активность культуральной жидкости после 120 ч ферментации определяют методом диффузии в агар с использованием тест-микроорганизма Bacillus subtilis 6633 АТСС.

Для выделения антибиотика нативный раствор (отфильтрованная от мицелия культуральная жидкость) объемом 5 л, рН которого (6,8-7,3), пропускают через колонку с 500 мл смолы Амберлит XAD-2 (Serva, Германия) при скорости 120 мл/см2·ч. По окончании сорбции колонку промывают дистиллированной водой (1 л). Антибиотик ИНА 5812 элюируют со смолы смесью ацетон-н.-бутанол-вода (1:1:1) при pH 3,0. Органические растворители элюата упаривают в вакууме и из водного остатка антибиотик экстрагируют н.-бутанолом, сорбируют для дальнейшей очистки на колонке с DEAE-Сефадексом (в OH--форме). Активные фракции объединяют, удаляют растворитель в вакууме, и антибиотик осаждают из 50% водно-спиртового раствора ацетоном. Полученные сырцы антибиотика хроматографируют на колонке с обращенной фазой С-18 с использованием градиента ацетонитрила в воде и получают чистый антибиотик в виде белого порошка, хорошо растворимого в воде, метаноле, ограниченно - в этаноле и нерастворим в других органических растворителях. Из 5 л нативного раствора получают 10 мг вещества. Активность препарата в отношении Bacillus subtilis 6633 АТСС составляет 3000 ед. разведения/мг.

Таким образом, получен новый штамм Streptomyces roseoflavus ИНА-Ас-5812 - продуцент нового гликопептидного антибиотика ИНА 5812 и предложен способ биосинтеза, выделения и химической очистки, позволяющий получить биологически активное соединение - антибактериальный антибиотик ИНА 5812.

Новый препарат - антибиотик ИНА 5812 - имеет высокие показатели антибактериальной и химиотерапевтической активности и низкое значение острой токсичности

Значения МПК (минимальная подавляющая концентрация), определенные in vitro в отношении двух стандартных штаммов стафилококка, представлены в Таблице 2.

Показатели химиотерапевтической активности in vivo, полученные на модели стафилококкового сепсиса белых мышей, представлены в Таблице 3.

Результаты показывают высокую эффективность антибиотика ИНА 5812 как лекарственного препарата: доза 2,5 мкг/кг обеспечивает 100%-е излечивание стафилококкового сепсиса.

Острая токсичность антибиотика определена на белых мышах и результаты даны в Таблице 4. Максимально переносимая доза антибиотика ИНА 5812 в десять раз превосходит дозу 100%-го излечения опытных мышей от стафилококкового сепсиса.

Таблица 1
Культурально-морфологические признаки штамма Streptomyces roseoflavus ИНА-Ас-5812
Агаровая среда Рост воздушного мицелия* Цвет мицелия Растворимый пигмент
Воздушного Субстратного
№1 Гаузе +++ Серовато-белый до розоватого (Д-3, Р-2) Бледно-буроватый (Б-4) Слабый светло-желтый (Д-4)
Овсяная ++ Бледно-буроватый (Б-6) Серовато-желтый (Д-3, Ж-1) Нет
Чапека +++ Беловатый (Д-3) Буровато-желтоватый (Д-4) Нет
Глюкозо-аспарагиновая + Желтоватый (Ж-1) Бледно-буроватый (Б-4) Нет
Линденбайна (глицерин-нитратная) +++ Беловато-кремовый (Д-3, Coo6) Желтовато-кремовый (Б-6) Нет
Красильникова СР-1 Нет роста
№2 Гаузе ++ Беловато-розоватый (Д-3, Г-3) Беловато-кремоватый (Д-3, Б-6) Нет
Треснера (с пептоном и лимонно-кислым железом) Меланоидные пигменты не образует
*/ (+++) хороший; (++) - умеренный; (+) - слабый.

Таблица 2
Противостафилококковая активность in vitro антибиотика ИНА 5812
Штамм Staphylococcus, № Минимальная подавляющая концентрация (МПК), мкг/мл
St. aureus 25923 АТСС 0,5
St. epidermis 12228 АТСС 0,5

Таблица 3
Эффективность антибиотика ИНА 5812 при лечении стафилококкового сепсиса белых мышей
Штамм стафилококка, использованный для заражения Доза препарата (мг/кг), предохраняющая от гибели
50% зараженных животных (ЕД50)* 100% зараженных животных
Клинический изолят, №10 0,37±0,05 2,5±0,07
*/ ЕД50 (50% летальная доза) по методу накопления частот Беренса.

Таблица 4
Острая токсичность антибиотика ИНА 5812 при внутривенном введении в опытах in vivo
Показатель токсичности Доза, мг/кг массы животных
LD50 (по методу Лидтчфилда и Уилкоксона) 53,6 (реф. знач. 41,9-65,3)
МПД (максимально переносимая доза) 28,5±0,5

Источник поступления информации: Роспатент

Показаны записи 1-9 из 9.
20.07.2014
№216.012.e101

Фармацевтическая композиция на основе 6-[(4-метил-i-1-пиперазинил)метил]-индоло[1',7':1,2,3]пирроло[3',4':6,7]азепино[4,5-b]индол-1,3(2н,10 н)-диона в качестве противоопухолевого средства

Изобретение относится к фармацевтической промышленности. Предложена фармацевтическая композиция, содержащая как минимум один активный компонент - фармацевтически приемлемую соль 6-[(4-метил-1-1-пиперазинил)метил]-индоло[1',7':1,2,3]пирроло[3',4':6,7]азепино [4,5-b]индол-1,3(2H,10H)-диона...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002523387
Дата охранного документа: 20.07.2014
27.04.2015
№216.013.4606

Фармацевтическая композиция на основе производного трииндолилметана в качестве противоопухолевого средства

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и включает в себя фармацевтическую композицию, представляющую собой раствор производного трииндолилметана - фармацевтически приемлемой соли трис(1-пентил-1Н-индол-3-ил)метилия, в частности хлорид трис(1-пентил-1Н-индол-3-ил)метилия, в...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002549430
Дата охранного документа: 27.04.2015
10.07.2015
№216.013.5b66

Противоопухолевый антрафурандион и фармацевтические композиции на его основе

Изобретение относится к сфере лекарственных препаратов, в частности к новому производному антрафурандиона формулы I или его фармацевтически приемлемым солям, обладающим высоким противоопухолевым эффектом и активностью в отношении опухолевых заболеваний с резистентностью к другим лекарственным...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002554939
Дата охранного документа: 10.07.2015
10.12.2015
№216.013.9795

Химерные антибиотики на основе гликопептидов и 11,12-циклического карбоната азитромицина и способ их получения

Изобретение относится к новым соединениям, применимым в качестве антибактериального средства в фармацевтической промышленности, формулы где R= а n=1-10. Предложены новые эффективные антибиотики и способ их получения путем проведения реакции ацилирования 11,12-циклического карбоната...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002570425
Дата охранного документа: 10.12.2015
27.03.2016
№216.014.c88d

Химерные антибиотики на основе азитромицина и гликопептидных антибиотиков, обладающие антибактериальной активностью, и способ их получения

Изобретение относится к новым производным азитромицина и способу их получения, которые могут найти применение в фармацевтической промышленности и медицине. Предложены соединения, соответствующие формуле 2 где n=1-10, a R - остаток ванкомицина, эремомицина или агликона тейкопланина. Способ...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002578604
Дата охранного документа: 27.03.2016
25.08.2017
№217.015.b4ca

Штамм гриба из класса sordariomycetes - продуцент антибиотика эремоксиларина а.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм аскомицетного гриба из класса Sordariomycetes ИНА 01108 обладает способностью продуцировать антибиотик эремоксиларин А. Штамм аскомицетного гриба из класса Sordariomycetes депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Федерального...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002614126
Дата охранного документа: 22.03.2017
29.12.2017
№217.015.f7e7

Пероральные противоопухолевые средства и способ лечения онкологических заболеваний

Группа изобретений относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой пероральное средство для лечения онкологических заболеваний, включающее: терапевтически эффективное количество метансульфоната...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002639479
Дата охранного документа: 21.12.2017
20.01.2018
№218.016.0fbc

Штамм amycolatopsis orientalis - продуцент антибиотика диметилванкомицина и способ получения антибиотика

Заявлена группа изобретений, которая может быть использована при производстве антибактериального антибиотика диметилванкомицина сульфата, эффективного при лечении инфекций, вызываемых грамположительными возбудителями, в том числе метициллинустойчивыми и анаэробами. Предлагается штамм...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002633511
Дата охранного документа: 12.10.2017
13.02.2018
№218.016.2325

Новое полусинтетическое производное эремомицина и его применение

Изобретение относится к новому полусинтетическому производному гликопептидного антибиотика эремомицина, представляющему собой тетраметиленимид эремомицина формулы 2 и его фармацевтически приемлемым солям. Также предложен способ получения тетраметиленимида эремомицина формулы 2, его...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002641912
Дата охранного документа: 23.01.2018
Показаны записи 1-10 из 33.
20.07.2014
№216.012.e101

Фармацевтическая композиция на основе 6-[(4-метил-i-1-пиперазинил)метил]-индоло[1',7':1,2,3]пирроло[3',4':6,7]азепино[4,5-b]индол-1,3(2н,10 н)-диона в качестве противоопухолевого средства

Изобретение относится к фармацевтической промышленности. Предложена фармацевтическая композиция, содержащая как минимум один активный компонент - фармацевтически приемлемую соль 6-[(4-метил-1-1-пиперазинил)метил]-индоло[1',7':1,2,3]пирроло[3',4':6,7]азепино [4,5-b]индол-1,3(2H,10H)-диона...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002523387
Дата охранного документа: 20.07.2014
27.04.2015
№216.013.4606

Фармацевтическая композиция на основе производного трииндолилметана в качестве противоопухолевого средства

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и включает в себя фармацевтическую композицию, представляющую собой раствор производного трииндолилметана - фармацевтически приемлемой соли трис(1-пентил-1Н-индол-3-ил)метилия, в частности хлорид трис(1-пентил-1Н-индол-3-ил)метилия, в...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002549430
Дата охранного документа: 27.04.2015
10.07.2015
№216.013.5b66

Противоопухолевый антрафурандион и фармацевтические композиции на его основе

Изобретение относится к сфере лекарственных препаратов, в частности к новому производному антрафурандиона формулы I или его фармацевтически приемлемым солям, обладающим высоким противоопухолевым эффектом и активностью в отношении опухолевых заболеваний с резистентностью к другим лекарственным...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002554939
Дата охранного документа: 10.07.2015
10.12.2015
№216.013.9795

Химерные антибиотики на основе гликопептидов и 11,12-циклического карбоната азитромицина и способ их получения

Изобретение относится к новым соединениям, применимым в качестве антибактериального средства в фармацевтической промышленности, формулы где R= а n=1-10. Предложены новые эффективные антибиотики и способ их получения путем проведения реакции ацилирования 11,12-циклического карбоната...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002570425
Дата охранного документа: 10.12.2015
27.03.2016
№216.014.c88d

Химерные антибиотики на основе азитромицина и гликопептидных антибиотиков, обладающие антибактериальной активностью, и способ их получения

Изобретение относится к новым производным азитромицина и способу их получения, которые могут найти применение в фармацевтической промышленности и медицине. Предложены соединения, соответствующие формуле 2 где n=1-10, a R - остаток ванкомицина, эремомицина или агликона тейкопланина. Способ...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002578604
Дата охранного документа: 27.03.2016
25.08.2017
№217.015.b4ca

Штамм гриба из класса sordariomycetes - продуцент антибиотика эремоксиларина а.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм аскомицетного гриба из класса Sordariomycetes ИНА 01108 обладает способностью продуцировать антибиотик эремоксиларин А. Штамм аскомицетного гриба из класса Sordariomycetes депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Федерального...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002614126
Дата охранного документа: 22.03.2017
29.12.2017
№217.015.f7e7

Пероральные противоопухолевые средства и способ лечения онкологических заболеваний

Группа изобретений относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой пероральное средство для лечения онкологических заболеваний, включающее: терапевтически эффективное количество метансульфоната...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002639479
Дата охранного документа: 21.12.2017
20.01.2018
№218.016.0fbc

Штамм amycolatopsis orientalis - продуцент антибиотика диметилванкомицина и способ получения антибиотика

Заявлена группа изобретений, которая может быть использована при производстве антибактериального антибиотика диметилванкомицина сульфата, эффективного при лечении инфекций, вызываемых грамположительными возбудителями, в том числе метициллинустойчивыми и анаэробами. Предлагается штамм...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002633511
Дата охранного документа: 12.10.2017
13.02.2018
№218.016.2325

Новое полусинтетическое производное эремомицина и его применение

Изобретение относится к новому полусинтетическому производному гликопептидного антибиотика эремомицина, представляющему собой тетраметиленимид эремомицина формулы 2 и его фармацевтически приемлемым солям. Также предложен способ получения тетраметиленимида эремомицина формулы 2, его...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002641912
Дата охранного документа: 23.01.2018
24.07.2018
№218.016.742d

Фармацевтическая композиция на основе соли производного оливомицина, обладающая противоопухолевой активностью

Настоящее изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и представляет собой фармацевтическую композицию с противоопухолевой активностью на основе соли N,N-диметиламиноэтиламид 1'-дез-(2,3-дигидрокси-н-бутироил)-1'-карбоксиоливомицина А, выбранной из группы метансульфоната,...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002662087
Дата охранного документа: 23.07.2018
+ добавить свой РИД