Вид РИД
Изобретение
Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для эффективного лечения и профилактики инфекционных заболеваний, вызванных вирусом гриппа с типом поверхностного антигена H1N1, у домашних животных и птиц.
Из уровня техники также известно лекарственное средство для лечения инфекционных заболеваний домашних животных и способ лечения (RU 2326694 C1, A61K 39/395, 2008). Однако данное решение при сложности приготовления лекарственного средства малоэффективно при лечении инфекционных заболеваний у животных, вызванных вирусом гриппа с типом поверхностного антигена H1N1, а его пригодность для лечения человека не очевидна.
Изобретение направлено на создание универсального, эффективного и безопасного способа лечения инфекционных заболеваний, вызванных вирусом гриппа А с типом поверхностного антигена H1N1, и препарата с противовирусной и иммуномодулирующей активностью, обеспечивающего эффективное лечение и профилактику инфекционных заболеваний, вызванных вирусом гриппа А с типом поверхностного антигена H1N1, у домашних животных и птиц.
Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что в способе лечения и профилактики инфекционных заболеваний, вызванных вирусом гриппа с типом поверхностного антигена H1N1, у домашних животных и птиц согласно изобретению используют действующую субстанцию в виде гомеопатически активированной - потенцированной формы, полученной путем многократного последовательного разведения матричного раствора аффинно очищенных антител к гамма-интерферону человека и промежуточного внешнего воздействия.
Причем в способе лечения используют активированную - потенцированную форму действующей субстанции, которая получена из матричного раствора аффинно очищенных антител к гамма-интерферону человека с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл.
При этом действующая субстанция включает смесь различных гомеопатических разведений, предпочтительно, сотенных С 12, С 30, С 50 или С 12, С 30, С 200.
Кроме того, решение поставленной задачи обеспечивается также тем, что лекарственное средство для лечения и профилактики инфекционных заболеваний, вызванных вирусом гриппа с типом поверхностного антигена H1N1, согласно изобретению, включает действующую субстанцию в виде гомеопатически активированной - потенцированной формы аффинно очищенных антител к гамма-интерферону человека.
При этом гомеопатически активированная - потенцированная форма действующей субстанции лекарственного средства получена из матричного раствора аффинно очищенных антител к гамма-интерферону человека с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл.
Причем лекарственное средство может включать смесь различных гомеопатических разведений, предпочтительно, сотенных С 12, С 30, С 50 или С 12, С 30, С 200.
Терапевтическая эффективность заявленного решения в отношении вирусов гриппа с типом поверхностного антигена H1N1 для лечения животных и птиц обусловлена иммуномодулирующим и противовирусным действием гомеопатически активированной - потенцированной формы аффинно очищенных антител к гамма-интерферону человека. При этом лекарственное средство заявленного состава снижает концентрацию вируса в пораженных тканях, влияет на систему эндогенных интерферонов и сопряженных с ними цитокинов, индуцирует образование эндогенных «ранних» интерферонов (ИФН α/β) и гамма-интерферонов (ИФН γ). Кроме того, препарат стимулирует гуморальный и клеточный иммунный ответ, повышает продукцию антител (включая секреторный IgA), активирует функции Т-эффекторов, Т-хелперов (Tx), нормализует их соотношение, повышает функциональный резерв Tx и других клеток, участвующих в иммунном ответе, является индуктором смешанного Tx1- и Tx2-типа иммунного ответа: нормализует выработку цитокинов Tx1 (ИФН γ, ИЛ-2) и Tx2 (ИЛ-4, ИЛ-10), нормализует (модулирует) баланс Tx1/Tx2 активностей, повышает активность фагоцитов и естественных клеток-киллеров (ЕК клеток), что обуславливает противовирусную активность препарата в отношении вирусов гриппа с типом поверхностного антигена H1N1.
Причем в отличие от действия терапевтических доз известных препаратов, в том числе и на основе интерферона, применение сверхмалых доз разведений активированной - потенцированной формы антител к гамма-интерферону человека не вызывает побочных эффектов, к заявленному препарату не развивается резистентность, что обуславливает возможность его использования для длительной безопасной и эффективной противовирусной профилактики. Кроме того, заявленный препарат характеризуется отсутствием побочных эффектов при сохранении терапевтического действия, экологической чистотой и низкой себестоимостью и расширяет арсенал лекарственных средств, предназначенных для лечения гриппа с типом поверхностного антигена H1N1 у животных и птиц.
Лекарственный препарат может быть приготовлен на основе поликлональных или моноклональных антител к гамма-интерферону человека, полученных по известным методикам.
Методика получения поликлональных и моноклональных антител описана, например, в книге: Иммунологические методы / под ред. Г. Фримеля, М., Медицина, 1987, с.9-33, или, например, в статье Laffly Е., Sodoyer R. Hum. Antibodies. Monoclonal and recombinant antibodies, 30 years after. - 2005 - Vol.14. - N 1-2. P.33-55.
Методика получения рекомбинантных антител описана, например, в статье Laffly Е., Sodoyer R. Hum. Antibodies. Monoclonal and recombinant antibodies, 30 years after. - 2005 - Vol.14. - N 1-2. P.33-55.
Методика получения антител к гамма-интерферону человека описана, например, в статье Monoclonal antibodies to human-γ: production, affinity, purification and radioimmunoassay. - The EMBO Journal, Vol.2, No.9, pp.1527-1530, 1983.
Для получения поликлональных иммунных антител, а также в гибридомной технологии для получения рекомбинантных моноклональных и поликлональных антител в качестве иммуногена для иммунизации лабораторных животных может быть использован гамма-интерферон человека, в том числе рекомбинантный, или фрагмент или смесь различных фрагментов гамма-интерферона человека.
Полученные по известным методикам антитела к гамма-интерферону человека очищают, преимущественно, методом аффинной хроматографии.
При реализации заявленного решения, например, для исследовательских целей могут быть также использованы готовые антитела к гамма-интерферону человека, производимые различными фирмами, например:
- Anti-Interferon-gamma antibody produced in goat; species reactivity: human (см. Каталог «Продукты для исследований в области естественных наук» (SIGMA) на 2008-2009 гг., стр.2153);
- Rabbit polyclonal antibodies to Interferon gamma (Immunogen: Highly pure (>98%) recombinant human Interferon-gamma (см. http://www.abcam.com/Interferon-gamma-antibody-ab9657.html);
- Mouse monoclonal antibodies to Interferon gamma (Immunogen: Recombinant full length protein (Human)) (см. http://www.abcam.com/Interferon-gamma-antibody-ab9658.html);
- Chicken Anti-Human Interferon gamma Polyclonal Antibody, Unconjugated (см. http://www.biocompare.com/ProductDetails/1269192/Chicken-Anti-Human-Interferon-gamma-Polyclonal-Antibody,-Unconjugated.html);
- Rabbit Anti-Human Interferon gamma Monoclonal Antibody, Unconjugated, Clone EP1109Y (см. http://www.biocompare.com/ProductDetails/880680/Rabbit-Anti-Human-Interferon-gamma-Monoclonal-Antibody,-Unconjugated,-Clone-EP1109Y.html) и др.
Предпочтительным для приготовления заявленного лекарственного препарата является использование поликлональных антител к гамма-интерферону человека.
Полученные после очистки методом аффинной хроматографии антитела в фосфатно-солевом буферном растворе с концентрацией 0,5÷5,0 мг/мл (предпочтительно 1,0÷3,0 мг/мл) используют в качестве матричного раствора для приготовления действующей субстанции в виде гомеопатически активированной потенцированной формы, которую получают путем многократного последовательного разведения матричного раствора аффинно очищенных антител к гамма-интерферону человека и промежуточного внешнего воздействия, предпочтительно по гомеопатической технологии (см., например, Гомеопатические лекарственные средства. Руководство по описанию и изготовлению, В. Швабе, Москва, 1967, с.12-38).
При этом производят равномерное уменьшение концентрации путем последовательного разведения 1 объемной части матричного раствора аффинно очищенных антител к гамма-интерферону человека в 9 объемных частях (для десятичного разведения D) или в 99 объемных частях (для сотенного разведения С) или в 999 объемных частях (для тысячного разведения М) нейтрального растворителя с многократным вертикальным встряхиванием каждого полученного разведения и использованием преимущественно отдельных емкостей для каждого последующего разведения до получения требуемой сверхмалой дозы (потенции). Причем первое гомеопатическое разведение производят на нейтральном растворителе: предпочтительно на 10÷15% водном растворе этилового спирта или дистиллированной воде, следующие разведения на 20÷30% водном растворе этилового спирта и конечные (последние два-три) разведения производят на 35÷75% водном растворе этилового спирта или дистиллированной воде.
При использовании в качестве действующей биологически активной - потенцированной субстанции смеси различных, преимущественно, сотенных, разведений (потенций), каждый компонент состава (например, С 12, С 30, С 50 или С 200) приготовляют по отдельности по приведенной выше технологии до их предпоследнего разведения (соответственно, до получения С11, С29, С49, или С199) и затем вносят в соответствии с составом смеси в одну емкость по одной части и смешивают с требуемым количеством растворителя (соответственно, с 97 частями для сотенного разведения).
Внешнее воздействие в процессе уменьшения концентрации можно осуществлять как в виде многократного вертикального встряхивания, так и, например, ультразвуком, электромагнитным или иным подобным физическим действием.
Заявленный диапазон концентрации матричного раствора является оптимальным для получения лекарственного препарата с повышенной противовирусной активностью и обусловлен тем, что при концентрации матричного раствора менее 0,5 мг/мл антитела к гамма-интерферону человека при их дальнейшей обработке - потенцировании резко снижают свою специфическую активность (эффективность), стабильность и срок хранения, а использование антител с концентрацией выше 5,0 мг/мл технологически сложно и дорого.
Приготовленная таким образом действующая субстанция в виде гомеопатически активированной - потенцированной формы может быть использована в общепринятых лекарственных формах как в виде водоспиртовых растворов, так и для приготовления твердых лекарственных форм.
Пример 1
Исследование эффективности сверхмалых доз антител к гамма-интерферону человека в условиях гриппозной инфекции у мышей-самок линии Balb/c (n=80) проводилось на базе ГУ НИИ гриппа РАМН (г. Санкт-Петербург). Инфекционный процесс моделировали интраназальным введением вируса гриппа A/California/07/2009swl (H1N1) в дозе 10ЛД50 (летальное инфицирование). Сверхмалые дозы (смесь гомеопатических разведений С12, С30, С50) кроличьих поликлональных антител к гамма-интерферону человека, приготовленные из матричного раствора с концентрацией 0,5 мг/мл и конечным разведением на дистиллированной воде, вводили 20 мышам интрагастрально по 0,2 мл/мышь (суточная доза 0,4 мл/мышь) в течение 5 дней до инфицирования и в течение 21 дня после инфицирования в комбинации с добавлением препарата в поилки к животным. Препарат сравнения озельтамивир вводили 20 мышам интрагастрально за 25 и 1 час до инфицирования в дозе 10 мг/кг, затем в течение 3 суток после инфицирования - 2 раза в сутки по 10 мг/кг (в объеме 0,2 мл/мышь); начиная с 4 суток после инфицирования вместо озельтамивира животным вводили воду дистиллированную 2 раза в сутки по 0,2 мл/мышь. В контрольной группе 20 мышам интрагастрально вводили дистиллированную воду 2 раза в сутки по 0,2 мл/мышь. 20 мышей не инфицировали, для оценки состояния животных на протяжении всего эксперимента (интактный контроль). Оценивали выживаемость животных.
В результате эксперимента обнаружено, что сверхмалые дозы антител к гамма-интерферону человека в условиях летального инфицирования мышей вирусом гриппа A/H1N1 повышали выживаемость животных в 3,7 раза по сравнению с контрольной группой. На 10 сутки после инфицирования в контрольной группе выжило 17,5% мышей, в группе озельтамивира - 30% мышей, в группе сверхмалых доз антител к интерферону гамма человека - 65% мышей. В группе интактного контроля все мыши были живы до конца эксперимента.
Таким образом, заявленный препарат обладает высокой противовирусной эффективностью в лечении гриппа A/H1N1, вызванного штаммом A/California/07/2009swl, превосходящей эталонный препарат для лечения гриппа А - озельтамивир.
Пример 2
Исследование эффективности сверхмалых доз антител к гамма-интерферону человека в условиях гриппозной инфекции у мышей-самок линии Balb/c (n=96) проводилось на базе ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» (г. Кольцово). Инфекционный процесс моделировали интраназальным введением вируса гриппа A/California/07/2009 (H1N1)v в дозе 10ИД50 (нелетальное инфицирование). Сверхмалые дозы (смесь гомеопатических разведений С12, С30, С50) кроличьих поликлональных антител к гамма-интерферону человека, приготовленные из матричного раствора с концентрацией 5,0 мг/мл и конечным разведением на дистиллированной воде, вводили 32 мышам интрагастрально по 0,2 мл/мышь (суточная доза 0,4 мл/мышь) в течение 5 дней до инфицирования и в течение 8 дней после инфицирования. Препарат сравнения озельтамивир вводили 32 мышам интрагастрально за 1 час до инфицирования в дозе 20 мг/кг, затем в течение 5 суток после инфицирования - 2 раза в сутки по 10 мг/кг (в объеме 0,2 мл/мышь); начиная с 6 суток после инфицирования вместо озельтамивира животным вводили воду дистиллированную 2 раза в сутки по 0,2 мл/мышь. В контрольной группе 20 мышам интрагастрально вводили дистиллированную воду 2 раза в сутки по 0,2 мл/мышь. Оценивали титр вируса гриппа в легких мышей (на 2, 4, 6, 8-е сутки после инфицирования).
В результате эксперимента обнаружено, что применение сверхмалых доз антител к гамма-интерферону у мышей, инфицированных A/California/07/2009(H1N1)v, было сравнимо по эффективности с применением озельтамивира и способствовало достоверному, более чем в 10 раз по сравнению с контрольной группой, снижению продукции вируса гриппа в легких мышей на 4, 6 и 8 сутки после инфицирования (см. Таблицу 1).
|
Таким образом, заявленный препарат обладает высокой противовирусной эффективностью в лечении гриппа A/H1N1, вызванного штаммом A/California/07/2009(H1N1)v, не уступающей эталонному препарату для лечения гриппа А - озельтамивиру.
Пример 3
Исследование эффективности сверхмалых доз антител к гамма-интерферону человека в условиях гриппозной инфекции у мышей-самок линии Balb/c (n=80) проводилось в компании APcis (г. Мезон-Альфорт, Франция). Инфекционный процесс моделировали интраназальным введением вируса гриппа A/New Caledonia/20/99 (H1N1) в дозе 10ЛД50 (летальное инфицирование). Сверхмалые дозы (смесь гомеопатических разведений С12, С30, С50) кроличьих поликлональных антител к гамма-интерферону человека, приготовленные из матричного раствора с концентрацией 1,5 мг/мл и конечным разведением на дистиллированной воде, вводили 20 мышам интрагастрально по 0,2 мл/мышь (суточная доза 0,4 мл/мышь) в течение 5 дней до инфицирования и в течение 21 дня после инфицирования в комбинации с добавлением препарата в поилки к животным. Эффективность заявленного препарата сравнивали с озельтамивиром в дозе 4 мг/кг/сут. В контрольной группе 20 мышам интрагастрально вводили дистиллированную воду 2 раза в сутки по 0,2 мл/мышь. 20 мышей не инфицировали для оценки состояния животных на протяжении всего эксперимента (интактный контроль). Оценивали выживаемость животных.
В результате эксперимента обнаружено, что применение сверхмалых доз антител к гамма-интерферону человека в условиях летального инфицирования мышей вирусом гриппа A/H1N1 обеспечило более позднее начало заболевания: на 5 сутки после инфицирования количество погибших мышей было на 25% (р<0,05) меньше, чем в группе плацебо.
Таким образом, заявленный препарат обладает высокой противовирусной эффективностью в лечении гриппа A/H1N1, вызванного штаммом A/New Caledonia/20/99, не уступающей озельтамивиру (4 мг/кг/сут).
Пример 4
Исследование эффективности и безопасности сверхмалых доз антител к интерферону гамма человека в лечении гриппа (А, В, микст) и ОРВИ у детей проводилось на базе ГУ НИИ гриппа РАМН (г. Санкт-Петербург). В двойном слепом плацебоконтролируемом исследовании принимали участие 105 детей обоего пола в возрасте от 1 до 10 лет, поступавших на 1÷2 сутки от начала заболевания с температурой тела не ниже 37,5°C и не получавших иммуномодулирующую или противовирусную терапию до начала исследования.
Гриппозная моноинфекция была лабораторно подтверждена у 53,4% детей, из которых у 21,1% был определен вирус гриппа A/H1N1 (A/New Caledonia/20/99, A/Beijing/269/95). Дети получали сверхмалые дозы антител к интерферону гамма человека в виде твердой лекарственной формы - таблетки, насыщенной смесью гомеопатических разведений С12, С30, С50, приготовленной из матричного раствора с концентрацией 3,0 мг/мл, (по 3÷8 табл./сут.) для рассасывания во рту или плацебо (пустой таблетки, не содержащей гомеопатически активированной - потенцированной формы действующей субстанции) в сочетании с симптоматической терапией в течение 7÷14 дней. У детей оценивали длительность основных клинических симптомов, частоту и выраженность осложнений.
В результате эксперимента обнаружено, что сверхмалые дозы антител к гамма-интерферону человека значительно сокращали, по сравнению с плацебо, общую длительность заболевания (с 7,5±0,28 до 5,8±0,24 сут.) и длительность основных симптомов заболевания: лихорадки с 3,67±0,12 до 2,25±0,13 сут.; симптомов интоксикации в среднем более чем на 1 сутки; катаральных симптомов - на 1,5 суток. Нежелательных явлений, связанных с приемом препарата, не зарегистрировано. Также показано, что заявленный препарат сокращает длительность вирусовыделения - через 14-2 суток после начала лечения количество выявленных вирусных антигенов сократилось в 3 раза по сравнению с исходным данными, в группе плацебо - в 2,2 раза; на 4÷5 сутки терапии, в отличие от группы плацебо, в группе заявленного препарата антигены не обнаруживались.
Таким образом, заявленный препарат обладает высокой клинической эффективностью и безопасностью в терапии ОРВИ и гриппа, в том числе вызванного вирусом гриппа A/H1N1.