СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ТРОМБООБРАЗОВАНИЯ У МЫШЕЙ ДЛЯ ОЦЕНКИ ДЕЙСТВИЯ ПРЕПАРАТОВ АНТИКОАГУЛЯНТА

Изобретение относится к области медицины, в частности к способу моделирования тромбообразования у подопытных животных (например, мышей), и предназначено для использования при изучении эффективности антитромботических аптамеров.

Общие сведения.

В ответ на повреждение сосудов тромбоциты быстро прилипают к ткани стенок сосуда и друг к другу с образованием тромба, который, в сочетании с системой свертывания, позволяет восстановить нормальный кровоток в нарушенном сосуде. Компоненты гемостаза не могут отличить травматических повреждений от поражений, которые происходят в патологических сосудах, например, при разрыве атеросклеротической бляшки. Таким образом, неконтролируемая активация тромбоцитов в пораженных сосудах может привести к артериальной окклюзии и инфаркту жизненно важных органов.

Аптамерные нуклеиновые кислоты (аптамеры) - перспективный класс узнающих элементов, способных избирательно связываться как с низкомолекулярными химическими соединениями, так и с веществами белковой природы. Аптамеры представляют собой рибо- или дезоксирибо-олигонуклеотиды, обладающие конкретной структурой, узнающей вещество-мишень. В случае мишеней-белков аптамеры выступают ингибиторами белок-белковых взаимодействий, предотвращая образование функциональноактивных белок-белковых комплексов.

Предшествующий уровень техники.

В настоящее время значительная часть разработанных аптамеров узнают белки, опосредствующие свертывание крови человека. Т.о. эти аптамеры представляют собой антитромботические препараты. Для исследования функциональной активности антитромботических аптамеров в животных моделях in vivo использовалось несколько подходов, которые можно разбить на два класса: 1) исследование каскада коагуляции в образцах плазмы крови, полученных из животного, инъецированного антитромботическим аптамером; 2) исследование влияния антитромботического аптамера на динамику образования тромба в сосуде животного in vivo.

Первый подход представлен в работе DeAnda et al. (Ann. Thorac. Surg., 1994, v. 58, pp. 344-350). Эксперименты были проведены на беспородных собаках (массой 25-35 кг), анестезированных тиопенталом натрия (25 мг/кг). Собаки были интубированы и подсоединены к системе механической вентиляции легких, далее животных перевели на систему искусственного кровообращения. После этого животным проводили внутривенную инфузию ДНК-аптамера к тромбину последовательности 5′-GGTTGGTGTGGTTGG-3′ со скоростью 0,3-1,5 мг/кг/мин. Инфузию прекращали через 37±3 мин. Через определенные промежутки времени у собак отбирали пробы крови, которые анализировались коагуляционными тестами: тестами протромбинового времени, активированного частичного тромбопластинового времени, активированного времени свертывания. Помимо этого, эффективность аптамера in vivo определяли качественно по отсутствию крупных сгустков крови в экстракорпоральном контуре кровообращения.

Другая модификация первого подхода представлена в статье Griffin et al. (Gene, 1993, v. 137, pp. 25-31). Макаки-крабоеды (4,2-5,5 кг) были анестезированы 10 мг/кг кетамин-хлоридом. В головную вену был помещен катетер для инфузии аптамера, а в подкожную вену был вставлен катетер для отбора проб крови. После завершения действия анестезии обезьянам вводили ДНК-аптамер к тромбину последовательности 5′-GGTTGGTGTGGTTGG-3′ со скоростью 0,3 мг/кг/мин на протяжении 60 мин. Через определенные промежутки времени у животных отбирали пробы крови, которые анализировались коагуляционным тестом протромбинового времени.

Еще один пример первого подхода продемонстрирован в работе Diener et al., 2007 (международная заявка WO 2007/025049 А2, 01.03.2007). Несколько ДНК-аптамеров к тромбину были введены болюсно в яремную вену крысам породы Sprague-Dawley через канюлю в дозах 1,5-6,4 µмоль/кг. Через определенные промежутки времени с помощью канюли из бедренной вены отбирали пробы крови, которые анализировались коагуляционным тестом активированного времени свертывания. В этой же работе проведены эксперименты на обезьянах. ДНК-аптамеры к тромбину были введены макакам-крабоедам болюсно через катетер в головную вену. С помощью этого же катетера проводился отбор проб крови обезьян через определенные промежутки времени. Пробы были проанализированы коагуляционным тестом активированного времени свертывания. Аналогично проведены и эксперименты болюс + инфузия ДНК-аптамеров к тромбину (скорость ввода аптамера 0,144-2,5 мг/кг/мин).

Итак, первый подход к изучению эффективности антитромботических аптамеров in vivo заключается в исследовании каскада коагуляции в образцах плазмы крови, полученных из животного, инъецированного антитромботическим аптамером. Достоинством этого подхода является простота манипуляций и количественный результат эксперимента, однако данный подход не позволяет оценить эффект антикоагулянта на тромбообразование непосредственно в кровеносном сосуде in vivo. Второй подход, напротив, направлен на решение именно этого вопроса, поскольку он заключается в исследовании влияния антитромботического аптамера на динамику образования тромба в сосуде животного in vivo. Для антитромботических аптамеров известно несколько примеров второго подхода, которые перечислены ниже.

В работах Rusconi et al. (Nat. Biotechnol., 2004, v. 22, n. 11, pp. 1423-1428) и Nimjee et al. (Mol. Then, 2012, v. 20, n. 2, pp. 391-397) описано исследование антитромботической эффективности РНК-аптамера к фактору фон Виллебранда на мышиной модели тромбоза. Мыши были интубированы, в левую яремную вену была вставлена канюля, а к правой общей сонной артерии прикреплен датчик потока. Каждое животное получило болюсную внутривенную дозу 0,5-3 мг/кг РНК-аптамера к фактору фон Виллебранда. Затем к сонной артерии в месте возле датчика потока прикладывали кусочек ватмана (1 мм²), смоченный в 10% растворе хлорида железа, который вызывает образование тромба. Через 5 минут бумагу убирали и регистрировали скорость потока крови в сонной артерии. Среднее время тромбирования сосуда составляло 10 минут в группе животных без введения аптамера и до 60 минут в группе с введением аптамера.

В работе Dieneret al. (J. Thromb. Haemost., 2009, v. 7, pp. 1155-1162) описана модель электрически индуцированного артериального тромбоза макак-крабоедов. Обезьяны были анестезированы, интубированы и переведены на ингаляцию изофурана для поддержания анестезии. В периферическую вену был помещен катетер для ввода антитромботического РНК-аптамера к фактору фон Виллебранда (болюс 0,1-0,6 мг/кг и инфузия 1,0-3,7 мкг/кг/мин), кроме того, бедренная артерия была катетеризирована для наблюдения за кровяным давлением и отбора проб крови. Доплеровский датчик потока был помещен возле сонной артерии возле места вставки внутриартериального электрода и стеноза. Стеноз уменьшал поток крови на 50-60%. Через 15 минут после начала инфузии аптамера производилось повреждение сонной артерии постоянным электрическим током 100 мкА с помощью внутривенного электрода, прикладываемого на 0,5-3 часа до полной окклюзии. Время полной окклюзии измерялось как показатель антитромботической эффективности аптамера.

Для изучения эффективности антикоагулянтов используются и другие модели тромбозов in vivo. Для изучения процесса образования тромба, а также для испытания антитромботического действия лекарственных антикоагулянтов образование тромба индуцируется в ходе эксперимента. Было разработано много различных моделей тромбоза, каждая из которых имеет свои достоинства и недостатки. Модели различаются как по способу индуцирования тромба, так и по способам регистрации последствий его образования, например его размеров или динамики изменения скорости кровотока в исследуемом сосуде. Способы индуцирования состоят, как правило, в повреждающем воздействии на стенку сосуда. Среди них механическое разрушение стенки сосуда, фотоокисление эндотелия с помощью красителя бенгальского розового или эритрозина, перевязка сосуда, окисление и удаление эндотелия со стенки участка сосуда с помощью хлорида железа, повреждение стенки сосуда с помощью лазера. Каждый из этих способов, вероятно, имитирует различные типы патофизиологии тромбоза, который может возникать спонтанно в организме человека.

Наиболее популярные модели тромбоза, используемые для исследования действия антикоагулянтов.

1. Измерение времени кровотечения. Простейшими моделями тромбоза, пригодными для испытаний антикоагулянтов, являются модели с разрезанием сосудов и измерением времени кровотечения до его полной остановки. Эта модель разработана в 1953 году (Hugues, Arch. Int. Physiol., 1953, v. 61, pp. 565-711). В этом исследовании производили рассечение брызжеечных артериол и венул с последующим измерением времени кровотечения. Еще более простым тестом является определение времени кровотечения из кончика обрезанного хвоста крысы или мыши (Dejana et al., Thromb. Haemost., 1982, v. 48, n. 1, pp. 108-11).

2. Использование хлорида железа является часто используемым методом индукции тромбоза. Метод состоит в наложении на сосуд полоски фильтровальной бумаги, смоченной 5-10% раствором FeCl3. Длительность наложения варьирует в зависимости от методов контроля последствий и от вида и размеров сосуда. Этот метод индукции тромбоза в сонной артерии крыс был впервые применен Kurz et al. (Thromb. Res., 1990, v. 60, pp. 269-280). Авторы измеряли время окклюзии - интервал времени от момента наложения FeCl₃ до полной остановки кровотока в сонной артерии - посредством мониторинга температуры на сонной артерии дистальнее места наложения FeCl₃. Концентрацию FeCl₃ варьировали от 5% (время окклюзии 60 минут) до 65% (время окклюзии менее 10 минут). Динамика развития тромбоза может быть прослежена также с помощью ультразвуковой детекции кровотока: Wang et al., Thromb. Res. 2005, v. 115, pp. 95-100; Cooley et al., Thromb. Res., 2007, v. 119, n. 6, pp. 747-751; Hennan et al., J. Thromb. Haemost., 2008, v. 6, n. 9, pp. 1558-1564; Heran et al., Eur. J. Pharmacol., 2000, v. 389, pp. 201-207). В других работах с использованием FeCl₃ измеряли объем тромба с помощью серийных срезов сонной артерии, зафиксированной спустя 24 часа после индукции тромба (Farrehi et al., Circulation, 1998, v. 97, pp. 1002-1008), однако этот метод регистрации не годится для исследования действия антикоагулянтов.

3. Метод артериовенозного шунта. Метод, предложенный Петерсом с соавторами (Peters et al., Thromb. Haemost., 1991, v. 65, pp. 268-274) для исследования на крысах, неоднократно применялся с небольшими вариациями для определения активности антикоагулянтов (Mizurini et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2013, v. 436, n. 2, pp. 235-239; Sato et al., Br. J. Pharmacol., 1998, v. 123, n. 1, pp. 92-96; Xiong et al., J. Pharm. Pharmacol., 2009, v. 61, n. 1, pp. 89-94). В яремную вену и сонную артерию вставляют по 8 сантиметровой полиэтиленовой канюле. Канюли соединены между собой изогнутой пластиковой трубкой длиной 6 см и диаметром 3 мм. В трубку вставлена нейлоновая нить диаметром 0,25 мм и длиной 5 см, предварительно поцарапанная скальпелем для большей тромбогенности. Экстракорпоральная циркуляция продолжается 15 минут. Далее шунт удаляют, нейлоновую нить вместе с прилипшим тромбом взвешивают (Berry et al., Br. J. Pharmacol., 1994, v. 113, n. 4, pp. 1209-1214). Следует отметить, что для успешного применения этой модели перед началом эксперимента часто необходимо заполнять канюли и шунт физраствором или даже гепарином, что может влиять на результат (Mizurini et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2013, v. 436, n. 2, pp. 235-239).

4. Индукция венозного тромбоза посредством стазиса.

Для венозного тромбоза применяют также метод Весслера, адаптированный для применения на крысах (Freund et al., Thrombos. Haemostas., 1990, v. 63, pp. 187-192). В этой модели тромб индуцируют с помощью внутривенной инъекции тромбопластина (20 микрограмм на кг) с последующим 15 минутным стазисом 1 см отрезка нижней полой вены 10 с после инъекции тромбопластина. Стазис осуществляли с помощью лигатуры и микрозажима с образованием венозного мешка. Сразу после окончания стазиса вену вырезают, тромб выделяют и взвешивают. Исследуемое вещество вводят или болюсно за 5 минут до инъекции тромбопластина, или посредством непрерывной инфузии начиная за 30 минут до инъекции тромбопластина в течение всего эксперимента (45 минут) (Berry et al., Br. J. Pharmacol., 1994, v. 113, n. 4, pp. 1209-1214; Perzborn et al., J. Thromb. Haemost., 2005, v. 3, n. 3, pp. 514-521). В некоторых случаях эксперименты со стенозисом нижней полой вены проводили без предварительного введения тромбопластина (Kaptanoglu et al., Eur. J. Pharmacol., 2008, v. 578, pp. 238-241).

5. Артериальный тромбоз с помощью механического повреждения. Тромбоз в дорзальной аорте крыс получают с помощью механического сдавления (ущемления - pinching) аорты посредством модифицированного зажима Spencer-Wells в течение 1 минуты. За 24 часа до начала эксперимента крысам вводили Индиум 111 меченые тромбоциты, а за 10 минут до начала эксперимента йод 125 меченый фибриноген. Через 45 минут артерию вынимали, промывали в 5% цитрате натрия и регистрировали интенсивность излучения в гамма-диапазоне. Исследуемое вещество вводили за 1 минуту до зажима артерии внутривенно болюсно или за час до зажима подкожно (Brundish et al., J. Med. Chem., 1999, v. 42, n. 22, pp. 4584-4603).

6. Комбинация воздействия света и введения флуоресцентного красителя. Rosenblum и El-Sabban в 1977 году (Circ. Res., 1977, v. 40, рр. 320-328) показали, что облучение ультрафиолетовым светом сосудов тонкой оболочки головного мозга приводит к образованию тромбоза микрососудов, но только после системного введения флуоресцеина. Образование тромба тормозилось введением аспирина, но не изменялось под воздействием гепарина. Позднее было показано, что к тому же результату приводит облучение зеленым светом после предварительного введения Бенгальского розового или эритрозина. Механизм фототоксичности опосредуется выделением реактивного кислорода - синглетного кислорода - генерируемого при возбуждении флюорохрома (Valenzeno, Photochem. Photobiol., 1987, v. 46, pp. 147-160). Индуцируемые таким образом тромбы состоят преимущественно из тромбоцитов и содержат лишь очень небольшое количество фибрина (Rosenblum and Sabban, Circ. Res., 1977, v. 40, рр. 320-328). Существующие межвидовые различия и различия между сосудистыми системами следует учитывать при планировании экспериментов с использованием этой модели тромбоза.

7. Электрическая индукция тромбоза также часто используется для изучения действия актикоагулянтов. Этот метод был разработан в 1973 году для индукции тромба в сонной артерии (Hladovec, Thromb. Diath. Haemorrh., 1973, v. 29, p. 407-410). Постоянный ток подводили к поверхности сонной артерии с помощью стального электрода. Образование тромба определяли по резкому падению температуры, которую измеряли с помощью термистора. Таким образом определяли время окклюзии. Согласно модификации Гуарини к сонной артерии подводится ток с помощью двух электродов, закрепленных на специальном держателе, закрепленном под сосудом (Guarini, J. Pharmacol. Toxicol. Methods, 1996, v. 35, pp. 101-105). Ток силой 2 миллиампера пропускали в течение 5 минут. Падение тока вследствие поляризации электродов компенсировали с помощью потенциометра вручную. Во время пропускания тока на артерию накладывали гемостатический зажим. Интенсивность кровотока оценивали с помощью ультразвукового измерителя кровотока, определяющего скорость кровотока по эффекту Допплера. Мониторинг кровотока продолжали 45-120 минут после индукции тромбоза. Впоследствии этот метод применяли неоднократно для испытания действия антикоагулянтов in vivo (Berry et al., Br. J. Pharmacol., 1994, v. 113, n. 4, pp. 1209-1214; Berry etal., Br. J. Pharmacol., 1998, v. 125, n. 1, pp. 29-34).

Электрическую индукцию тромбоза применяют и в модели венозного тромбоза. Так, тромбоз нижней полой вены получают с помощью пропускания тока силой 250 микроампер в течение 15 минут после хирургической операции по вскрытию брюшной полости. Далее животное зашивали и через 2 суток взвешивали тромб, образовавшийся в нижней полой вене (Diaz et al., J. Vis. Exp., 2011, v. 53, p.e 2737). Однако такая длительная экспозиция не годится для испытания антитромботических медикаментов.

Наиболее близким аналогом заявленного изобретения является способ моделирования тромбоза, который включает воздействие электрическим током на кровеносный сосуд. На стенку кровеносного сосуда уха кролика в течение 2-5 с воздействуют переменным электрическим током плотностью мощности 8,5×10^-5 - 5,2×10^-4 Вт/мкм² поверхности электрода, проводником которого является микроигла, введенная в просвет сосуда (SU 1345239, 15.10.1987).

Недостатком данного способа является использование в качестве модели достаточно крупного животного, а значит, необходимы значительные количества антикоагулянтов для изучения их антитромботического эффекта и воспроизводимый объективный метод оценки размера тромба. Кроме того, для изучения антитромботического эффекта новых препаратов важнее исследовать гемостаз не периферийных сосудов, а сонной артерии.

Задача, на решение которой направлено предложенное изобретение, заключается в создании способа моделирования тромбообразования, который исключал бы указанные выше недостатки.

Технический результат, достигаемый при реализации данного изобретения, заключается в приемлемой скорости образования тромба у модельных животных, за счет чего повышается эффективность определения тромбообразования у модельных животных с электрически индуцированным тромбозом.

Заявленный технический результат достигается за счет использования в качестве модельных животных лабораторных мышей, а также за счет индукции тромбоза в сонной артерии животного посредством воздействия постоянным током с напряжением 3 вольта и использования видеосъемки сосуда для определения размера тромба.

Способ моделирования тромбообразования у подопытных животных характеризуется тем, что открывают сонную артерию для индукции тромбоза и яремную вену для введения исследуемого образца антикоагулянта или контрольного раствора у наркотизированных животных, под сонную артерию подкладывают изолирующий ее от окружающих тканей материал, затем вводят препарат антикоагулянта или контрольного раствора в яремную вену, после чего приводят сонную артерию в соприкосновение с тонкой стальной иглой, соединенной с источником постоянного тока и выполняющей функцию первого электрода, при этом второй электрод вводят подкожно в область бедра животного и пропускают через него ток силой 200-250 микроампер в течение одной минуты, затем осуществляют под микроскопом видеосъемку, в результате которой отснятый видеоматериал анализируют посредством компьютерной программы для определения размера образовавшегося тромба.

В качестве изолирующего материала может быть использована полоска полиэтилена.

В частности, сонную артерию приводят в соприкосновение с тонкой стальной иглой через 1 минуту после введения антикоагулянта или контрольного раствора, при этом сонную артерию приводят в соприкосновение с тонкой стальной иглой под контролем стереомикроскопа. В качестве тонкой стальной иглы может быть использована инъекционная игла туберкулинового шприца.

Кроме этого, источник постоянного тока имеет напряжение 3 вольта, что обеспечивает образование тромба с приемлемой скоростью - несколько минут; в качестве антикоагулянта используют аптамер или бивалирудин, а в качестве контрольного раствора - физиологический раствор, который не обладает антитромботическим действием; видеосъемку производят с помощью цифровой камеры в течение 25 минут, а отснятый видеоматериал анализируют после захвата кадров с 1-минутным интервалом.

Далее отснятый материал анализируют с помощью компьютерной программы, в качестве которой применяют программу "Image Tool", при анализе индуцированный тромб выделяется белым оттенком на фоне окружающей крови и таким образом регистрируют изменение величины индуцированного тромба во времени.

В нашей работе использовали дешевую модификацию метода электрической индукции артериального тромбоза у лабораторных мышей. Для индукции тромбоза у наркотизированных мышей открывали сонную артерию и яремную вену. Под сонную артерию подкладывали полоску полиэтилена, изолирующую ее от окружающих тканей. Через 1 минуту после введения аптамера, бивалирудина (препарат для сравнения) или физиологического раствора (контрольный препарат) под контролем стереомикроскопа тонкую стальную иглу (инъекционная игла туберкулинового шприца) приводили в соприкосновение с сонной артерией. Эта игла соединялась с источником постоянного тока напряжением 3 вольта. Второй электрод вводили подкожно в область бедра. Через электрод пропускали ток силой 200-250 микроампер в течение 1 минуты, после чего мышь переносили на столик микроскопа Olympus и производили видеосъемку с помощью цифровой камеры Nikon D5100. Съемку проводили в течение 25 минут. С тем же увеличением была отснята масштабная линейка. Отснятый цифровой видеоматериал анализировали после захвата кадров с 1-минутным интервалом с помощью программы "Image Tool". Индуцированный тромб хорошо выделялся белым оттенком на фоне красного цвета окружающей крови. Таким образом, удавалось регистрировать изменения величины индуцированного тромба во времени.