СПОСОБ ОЧИСТКИ G-БОГАТЫХ ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДОВ

Изобретение относится к области биохимии и молекулярной биологии, а именно - к способу очистки синтетических олигодезоксирибонуклеотидов.

Синтез олигодезоксирибонуклеотидов и олигорибонуклеотидов является объектом, как интенсивных исследований, так и коммерческого использования (далее употребляется термин «олигонуклеотиды» в случае, когда природа сахара не имеет значения). Разработаны различные методы автоматического синтеза, имеется широкий ассортимент оборудования для автоматического синтеза, включая установки для крупномасштабного синтеза. Поскольку основной рынок синтетических олигонуклеотидов сосредоточен в сфере диагностики, а именно, применения полимеразной цепной реакции, большинство методов разработано для получения небольших количеств олигодезоксирибонуклеотидов. B этом случае количество и качество полученных олигодезоксирибонуклеотидов удовлетворяют большинству исследовательских и коммерческих целей. Напротив, к олигодезоксирибонуклеотидам, предназначенным для терапевтических целей (терапевтическим олигонуклеотидам), предъявляются более жесткие требования - в частности, касающиеся отсутствия как низкомолекулярных примесей, так и "орфографических ошибок" в последовательности нуклеотидов вследствие ошибок синтеза. Крупномасштабный синтез олигонуклеотидов приобрел большое значение в связи с высоким терапевтическим потенциалом аптамеров и малых интерферирующих РНК (миРНК, siRNA) [1].

Главной сложностью в продвижении практического применения терапевтических олигонуклеотидов является достижение высокой степени очистки продуктов автоматического синтеза. Для очистки олигонуклеотидов в небольшом масштабе (мг) удобным методом является обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (офВЭЖХ); она обладает оптимальным соотношением временных затрат и эффективности.

Ранее компанией Glen Research (США) была разработана стандартная методика твердофазной экстракции, которая применяется для очистки синтетических олигодезоксирибонуклеотидов, защищенных диметокситритильной группой [2].

Также известен источник 2007132440/04 (30.01.2006), в котором описан способ очистки синтетических олигодезоксирибонуклеотидов длиной от 2 до 30 нуклеотидов, имеющих диметокситритильную защиту. Очистка включает в себя следующие стадии:

1) получение раствора защищенного олигодезоксирибонуклеотида в растворителе A (имеющем точку кипения ниже, чем точка кипения растворителя B);

2) нагревание раствора до 30°C, но ниже точки кипения растворителя A;

3) добавление растворителя B до видимого осаждения вещества. Растворитель B представляет собой спирт, содержащий от 1 до 6 атомов C; или диол, содержащий от 2 до 6 атомов C;

4) далее растворитель B нагревается до температуры 30°C, но ниже точки кипения растворителя B;

5) к нагретому растворителю B добавляется раствор защищенного олигодезоксирибонуклеотида в растворителе A до видимого осаждения вещества в растворе, затем раствор охлаждается при перемешивании до образования осадка, и удаляется супернатант.

Основной задачей настоящего изобретения является устранение недостатков способов очистки известных из уровня техники и разработка эффективного способа очистки олигодезоксирибонуклеотидов, пригодного для крупномасштабного синтеза.

Техническим результатом является получение продукта с высоким выходом и высокой степенью очистки от производных кремниевой кислоты.

В настоящее время появилась насущная потребность в эффективных способах очистки олигодезоксирибонуклеотидов с высоким содержанием остатков G. Они обладают сложной и стабильной третичной структурой, часто в виде т.н. G-квартетов и G-квадруплексов, что и обуславливает к ним интерес со стороны, как исследователей, так и фармакологов. B то же время, наличие большого количества остатков G настолько специфически меняет физико-химические свойства олигонуклеотидов, что делает невозможным простое применение ранее разработанных стандартных способов очистки.

Поставленная техническая задача и получаемый технический результат достигаются новым предлагаемым способом очистки G-богатых олигодезоксирибонуклеотидов размером 20-50 оснований от примесей производных кремниевой кислоты, включающим следующие последовательные операции:

- используют синтезированные на носителе CPG (controlled pore glass, СКРП - стекло с контролируемым размером пор) олигодезоксирибонуклеотиды, где концевая диметокситритильная защита не удалена

- готовят раствор олигодезоксирибонуклеотида, для чего к 300 мкл олигодезоксирибонуклеотида концентрацией 0,5 мкм/мл прибавляют 25 мл воды и 0,5 мл 2,0 М раствора ион-парного реагента триэтиламмония ацетата (далее TEAA)

- растворы наносят на картриджи Glen Research Poly-Pak Cartridge, 60-1100-10, содержащие полимерный носитель, имеющий сродство к диметокситритилу, к картриджам присоединяют шприцы без плунжеров Millipore, Plastic syringe 50 мл, XX1105005, картриджи со шприцами присоединяются к вакуумному манифолду CHROMBOND 730151, и при помощи водоструйного насоса создается вакуум порядка 50 кПа

- картридж промывают 2 мл водного раствора аммиака и TEAA следующего состава: к разбавленному в 20 раз 25% раствору аммиака добавляют 1/40 объема 2,0 М раствора TEAA

- картридж промывают 2 мл воды

- картридж промывают 2 мл 2% водного раствора трифторуксусной кислоты

- картридж промывают 4 мл деионизованной воды

- выделяют очищенный олигодезоксирибонуклеотид из картриджа, для чего картридж промывают 2 мл смеси 95% этилового спирта с 25% водным аммиаком

- выделяют очищенный олигодезоксирибонуклеотид из раствора, для чего пробирки с раствором очищенного олигодезоксирибонуклеотида помещают в концентратор, производят испарение раствора в течение 10 часов при температуре 60°C

Итак, сущность изобретения состоит в применении смесей определенного состава определенных растворителей, а именно:

1) в добавлении ион-парного реагента триэтиламмония ацетата к раствору аммиака, используемому для отмывания производных кремниевой кислоты

2) в использовании водного раствора аммиака и этилового спирта для снятия очищенного олигодезоксирибонуклеотида с сорбента Poly Pak. Оба раствора имеют хорошую летучесть, что определяет легкость их последующего удаления упариванием в вакууме.

Выход продукта - чистого олигонуклеотида, составляет от 30 до 70% с содержанием силикатов менее 10^-6% по массе.

Подробное описание сущности изобретения и обоснование его преимуществ.

Для синтеза олигодезоксирибонуклеотидов, в основном, применяются два типа носителей: полистирольный носитель и стеклянный носитель с контролируемым размером пор (СКРП; controlled pore glass, CPG). B случае использования СКРП по завершению синтеза снятие олигодезоксирибонуклеотида с носителя осуществляется в щелочной среде (чаще всего водным раствором аммиака или смеси аммиака с метиламином), поэтому стекло выщелачивается и продукт, олигодезоксирибонуклеотид, загрязняется производными кремниевой кислоты [3]. Присутствие производных кремниевой кислоты делает невозможным клиническое применение олигодезоксирибонуклеотида без специальной очистки и разработки методов контроля качества.

Вопрос об очистке олигодезоксирибонуклеотидов от производных кремниевой кислоты малоизучен [4].

Стандартный метод очистки на полимерном сорбенте Poly Pak, предлагаемый Glen Research [2], заключается в связывании диметокситритил-олигодезоксирибонуклеотида с сорбентом Poly Pak за счет гидрофобных взаимодействий, а в присутствии ион-парного реагента - ацетата триэтиламмония, и самого олигонуклеотида. Такая стабильная сорбция позволяет проводить многократную промывку аммиаком без существенной десорбции олигонуклеотида.

Однако описанный стандартный способ не подходит для очистки G-богатых олигодезоксирибонуклеотидов, поскольку такие олигонуклеотиды смываются с носителя при промывании разбавленным аммиаком, что связано с плохой сорбцией, являющейся особенностью G-богатых олигонуклеотидов.

Заявленное изобретение касается следующего метода очистки для G-богатых олигонуклеотидов. Очистка олигодезоксирибонуклеотида производится с помощью картриджей фирмы Glen Research (Poly-Pak Cartridge 60-1100-10) объемом 0,5 мл с присоединенными шприцами фирмы Millipore на 50 мл (XX1105005) без плунжеров, которые монтируются на вакуумном манифолде на 24 колонки CHROMABOND 730151 фирмы Macherey-Nagel (Германия). При помощи водоструйного насоса создается вакуум 50-60 кПа. Растворы в соответствии с приведенной далее схемой наносятся на картриджи.

Используется деионизованная вода, полученная очисткой на Milli-Q Advantage А10 Ultrapure Water Purification System (США).

Первая стадия очистки - нанесение на картридж. По завершении твердофазного автоматического синтеза с использованием СКРП (синтезатор Mermade 48) и после снятия с носителя 300 мкл аммиачного раствора олигодезоксирибонуклеотида (концентрация - 0,5 мкм/мл; 0,5 мМ) разбавляют 25 мл воды и добавляют 0,5 мл 2,0 М раствора триэтиламмония ацетата (TEAA), раствор наносится на картридж объемом 0,5 мл. При этом олигонуклеотид сорбируется на носитель картриджа.

Вторая стадия очистки - промывка раствором аммиака и TEAA. Картридж промывается 2 мл водного раствора аммиака и TEAA следующего состава: к разбавленному в 20 раз 25% раствору аммиака добавляют 1/40 объема 2,0 М раствора TEAA. При этом удаляются производные кремниевой кислоты и прочие растворимые примеси.

Третья стадия очистки - промывка водой (2 мл). Удаляется избыток аммиака и TEAA.

Четвертая стадия очистки - удаление 5'-концевой защитной группы, промывка 2 мл 2% водного раствора трифторуксусной кислоты (ТФУ). Картридж промывается 2 мл 2% раствора ТФУ, при этом удаляется диметокситритильная группа.

Пятая стадия очистки - промывка 4 мл деионизованной воды. Картридж промывается 4 мл деионизованной воды; при этом удаляется избыток ТФУ, что обнаруживается при помощи универсальной индикаторной бумаги.

Шестая стадия очистки - элюция с носителя. Картридж промывается 2 мл смеси 95% спирта с 25% аммиаком (3:7 по объему). Олигодезоксирибонуклеотид, отмытый от примесей, переходит в раствор.

Регенерация картриджей для последующей очистки. Для подготовки к следующей очистке картридж последовательно промывается 2 мл ацетонитрила и 2 мл деионизованной воды для удаления возможных сорбированных примесей.

Полученный раствор переносят в пробирку на 2 мл. Пробирку с раствором очищенного олигодезоксирибонуклеотида помещаются в концентратор Eppendorf (Eppendorf Concentrator plus). Раствор упаривают в течение 10 часов при 60°C.

После упаривания очищенный олигодезоксирибонуклеотид растворяют в воде. Выход олигодезоксирибонуклеотида, определяемый по УФ-спектру по разности величин поглощения на длинах волн 260 и 320 нанометров, составляет от 30 до 70%. Коэффициент экстинкции рассчитывают по формуле:

□=N₁*15200+N₂*12010+N₃*7050+N₄*8400,

где N₁ - число аденинов, N₂ - число цитозинов, N₃ - число гуанинов, N₄ - число тиминов в последовательности.

В растворах полученного олигодезоксирибонуклеотида с концентрацией 100 нмоль/мл (100 Мкм) кремний не обнаруживается, т.е. концентрация кремния в растворе олигонуклеотида - ниже 10^-6% по массе.

Способ очистки иллюстрируется следующими примерами, не ограничивающими заявленное изобретение.

Пример 1. Очистка олигодезоксирибонуклеотида dGGTTGGTGTGGTTGGTGGTTGGTGTGGTTGG.

Указанный олигодезоксирибонуклеотид был синтезирован на ДНК-РНК синтезаторе ММ48 (BioAutomation, США) [5] с использованием стандартного протокола на 1 мкмоль продукта. Протокол, входящий в программное обеспечение прибора, разработан для синтеза на колонках со стеклянным носителем СКРП.

К 300 мкл раствора олигодезоксирибонуклеотида dGGTTGGTGTGGTTGGTGGTTGGTGTGGTTGG (концентрация - 0,5 мкм/мл; 0,5 мМ) прибавляют 25 мл воды и 0,5 мл 2,0 М раствора триэтиламмоний ацетата. Раствор наносится на картридж; картридж промывается 2 мл водного раствора аммиака и TEAA следующего состава: к разбавленному в 20 раз 25% раствору аммиака добавляют 1/40 объема 2,0 М раствора TEAA. При этом удаляются растворенные производные кремниевой кислоты. Далее картридж промывают 2 мл воды, что удаляет избыток аммиака и TEAA. Картридж промывается 2 мл 2% раствора ТФУ, при этом удаляется диметокситритильная защита. Затем картридж промывается 4 мл деионизованной воды, при этом удаляется избыток ТФУ. Для элюции очищенного олигодезоксирибонуклеотида картридж промывается 2 мл смеси 95% этилового спирта с водным аммиаком 25% (3:7 по объему).

Полученный раствор переносят в пробирку на 2 мл. Пробирку с раствором очищенного олигодезоксирибонуклеотида помещаются в концентратор Eppendorf (Eppendorf Concentrator plus). Раствор упаривают в течение 10 часов при 60°C.

После упаривания очищенный олигодезоксирибонуклеотид растворяют в воде. Выход олигодезоксирибонуклеотида определяют по УФ-спектру по разности величин поглощения на длинах волн 260 и 320 нанометров.

В растворах полученного олигодезоксирибонуклеотида с концентрацией 100 нмоль/мл кремний не обнаруживается.

Пример 2. Очистка олигодезоксирибонуклеотида dGTTGGTGTGGTTGGTGT.

Указанный олигодезоксирибонуклеотид был синтезирован на ДНК-РНК синтезаторе ММ48 [5] с использованием стандартного протокола на 1 мкмоль продукта. Протокол, входящий в программное обеспечение прибора, разработан для синтеза на колонках с носителем СКРП.

К 300 мкл раствора олигодезоксирибонуклеотида GTTGGTGTGGTTGGTGT (концентрация - 0,5 мкм/мл) прибавляют 25 мл воды и 0,5 мл 2,0 М раствора ион-парного реагента-триэтиламмония ацетата. Подготовленный таким образом раствор олигодезоксирибонуклеотида наносится на картридж. Диметокситритильная группа, имеющая сродство к сорбенту Poly Pak, обеспечивает сорбцию олигодезоксирибонуклеотида на сорбенте. Картридж промывается 2 мл водного раствора аммиака и TEAA следующего состава: к разбавленному в 20 раз 25% раствору аммиака добавляют 1/40 объема 2,0 М раствора TEAA. При этом удаляется растворенная кремниевая кислота. Осуществляют промывку 2 мл воды (удаляется избыток аммиака и TEAA). Картридж промывается 2 мл 2% раствора ТФУ, при этом удаляется диметокситритильная защита. Картридж промывают 4 мл деионизованной воды, при этом удаляется избыток ТФУ. Выделяют очищенный олигодезоксирибонуклеотид. Картридж промывают 2 мл смеси этилового спирта 95% с водным аммиаком 25% (3:7 по объему). Полученный раствор переносят в пробирку на 2 мл. Пробирку с раствором очищенного олигодезоксирибонуклеотида помещают в концентратор Eppendorf (Eppendorf Concentrator plus). Раствор упаривают в течение 10 часов при 60°C.

После упаривания очищенный олигодезоксирибонуклеотид растворяют в воде. Выход олигодезоксирибонуклеотида определяют по УФ-спектру по разности величин поглощения на длинах волн 260 и 320 нанометров.

В растворах полученного олигодезоксирибонуклеотида с концентрацией 100 нмоль/мл кремний не обнаруживается.

Пример 3. Очистка олигодезоксирибонуклеотида dGGTTGGTGTGGTTGGTGGTTGGTGTGGTTGGGTTGGTGTGGTTGGTG.

Указанный олигодезоксирибонуклеотид был синтезирован на ДНК-РНК синтезаторе ММ48 [5] с использованием стандартного протокола на 1 мкмоль продукта. Протокол, входящий в программное обеспечение прибора, разработан для синтеза на колонках с носителем СКРП.

К 300 мкл раствора олигодезоксирибонуклеотида GGTTGGTGTGGTTGGTGGTTGGTGTGGTTGGGTTGGTGTGGTTGGTG (концентрация - 0,5 мкм/мл) прибавляют 25 мл воды и 0,5 мл 2,0 М раствора ион-парного реагента-триэтиламмоний ацетата. Подготовленный таким образом раствор олигодезоксирибонуклеотида наносят на картридж. Диметокситритильная группа, имеющая сродство к сорбенту Poly Pak обеспечивает олигодезоксирибонуклеотида на сорбенте. Картридж промывают 2 мл водного раствора аммиака и TEAA следующего состава: к разбавленному в 20 раз 25% раствору аммиака добавляют 1/40 объема 2,0 М раствора TEAA. При этом удаляется растворенная кремниевая кислота. Осуществляют промывку 2 мл воды (удаляется избыток аммиака и TEAA). Картридж промывается 2 мл 2% раствора ТФУ, при этом диметокситритил. Картридж промывается 4 мл деионизированной воды, при этом удаляется избыток ТФУ. Патрон промывают 2 мл смеси этилового спирта 95% с водным аммиаком 25% (3:7 по объему). Полученный раствор переносят в пробирку на 2 мл. Пробирку с раствором очищенного олигодезоксирибонуклеотида помещаются в концентратор Eppendorf (Eppendorf Concentrator plus). Раствор упаривают в течение 10 часов при 60°C.

После упаривания очищенный олигодезоксирибонуклеотид растворяют в воде. Выход олигодезоксирибонуклеотида определяют по УФ-спектру по разности величин поглощения на длинах волн 260 и 320 нанометров.

В растворах полученного олигодезоксирибонуклеотида с концентрацией 100 нмоль/мл кремний не обнаруживается.

В таблице 1 приведены результаты опытов по очистке олигодезоксирибонуклеотидов.

Таким образом, описанный способ применим для очистки G-богатых олигодезоксирибонуклеотидов. Использование TEAA позволяет надежно сорбировать G-богатый олигодезоксирибонуклеотид на колонках Poly Pak, что позволяет их эффективно промывать для удаления примесей производных кремниевой кислоты. Метод применим для очистки терапевтических олигодезоксирибонуклеотидов.

Литература

1. Wuming Gong, Yongliang Ren, Qiqi Xu, Yejun Wang, Dong Lin, Haiyan Zhou and Tongbin Li. (2006) BMC Bioinformatics, 7, 516

2. McCarthy, S., Gilar, M., Gebler J. (2009) Analytical Biochemistry, 390, 181-188

3. Makino, K., Ozaki, H., Matsumoto, Т., Imaishi, H., Takeuchi, T. (1987) Journal of Chromatography, 400, 211-277

4. Gilar M., Bouvier, E. (2000) Journal of Chromatography A, 890, 167-177

5. http://www.glenresearch.com//Technical/PolvPakBooklet.pdf

6. http://www.glenresearch.com/GlenReports/GR19-2.pdf

7. Syrzhikov, S., Timofeev, E., Chernov В., Golova, J., Mirzabekov, A. (2000) Nucl. Acids Res., 28, e29

8. http://www.bioautomation.com/Synthesizers-MerMade%2048.html