ПРОИЗВОДНЫЕ ПРОСТАГЛАНДИНА, ОБЛАДАЮЩИЕ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ И АНАЛЬГЕЗИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ

Изобретение относится к области биохимии и может найти применение в медицине при терапии воспалительных состояний, сопровождающихся болевым синдромом, путем введения производных простагландина, обладающих противовоспалительной и анальгезирующей активностью.

Воспаление - универсальная защитная реакция организма в ответ на действие различных повреждающих факторов экзогенного и эндогенного происхождения. К таким факторам относятся чужеродные микроорганизмы и вирусы, ионизирующее излучение, воздействие экстремальных температур, токсические химические агенты, реактивные формы кислорода и азота, а также продукты распада клеток организма.

Воспалительный процесс характеризуется четырьмя наиболее характерными признаками: гиперемией (покраснением кожи за счет расширения кровеносных сосудов и прилива крови); отеком из-за увеличения проницаемости стенок кровеносных сосудов; жаром (повышением температуры всего тела); болью, возникающей из-за раздражения нервных окончаний под действием воспалительных медиаторов разнообразной природы (Крылов Ю.Ф., Бобырев В.М. Фармакология. Учебное пособие. Москва, Всероссийский учебно-научно-методический центр по непрерывному медицинскому и фармацевтическому образованию (ВУНМЦ), 1999. - 115 с.)

При нормальном физиологическом развитии воспалительной реакции, например, в случае местного повреждения такни, после острой фазы воспаления наступает стадия разрешения, резолвинга (от англ. resolving - разрешение), во время которой из зоны воспаления удаляются провоспалительные медиаторы и остатки разрушенных клеток, а все физиологические параметры (pH, температура) приходят в норму.

Простагландины - циклические карбоновые гидроксилированные жирные кислоты - образуются из эйкозаполиеновых кислот, содержащих три и более метилнразделенные двойные связи. Они являются ключевыми медиаторами воспаления. Количество фермента циклооксигеназы, с помощью которого образуется общий предшественник всех простагландинов простагландин H, существенно возрастает при воспалении. При содействии других ферментов синтезируются основные провоспалительные простагландины типов E и D, а также тромбоксан A₂.

Профиль продукции простагландинов определяется дифференциальной экспрессией ферментов их синтеза внутри клеток, присутствующих в зоне воспаления. Так, тучные клетки, в основном, генерируют простагландин D₂, тогда как макрофаги синтезируют простагландин E₂ и тромбоксан A₂. Кроме того, профиль простагландинов зависит от степени активации клеток. Например, покоящиеся макрофаги синтезируют больше тромбоксана A₂ чем простагландина E₂, но после активации бактериальным полисахаридом это соотношение изменяется в пользу простагландина E₂. Несмотря на то, что провоспалительный медиаторный эффект простагландина E₂ надежно установлен и ингибиторы циклооксигеназы существенно снижают выраженность воспалительного ответа, снижая жар и отек и уменьшая болевой синдром, простагландин E₂ в стадии разрешения воспаления может играть положительную роль вещества, способствующего направлению процесса воспаления в противоположную сторону (Ricciotti Ε., G.A. FitzGerald. Prostaglandins and Inflammation. // Arterioscler Thromb Vase Biol. 2011; 31:986-1000).

При определенных условиях воспалительная реакция может принимать чрезмерный характер, что вынуждает применять лекарственные средства для уменьшения интенсивности воспаления и перевода его в стадию разрешения. Для борьбы с чрезмерной воспалительной реакцией используют, в основном, две группы лекарственных препаратов: стероидной и нестероидной химической природы.

Среди стероидных противовоспалительных средств наиболее часто используют глюкокортикоиды (преднизолон и родственные препараты), которые влияют на все фазы воспаления. Однако глюкокортикоиды изменяют патогенез воспалительного процесса при бактериальном заражении, не устраняя его причины, и после их отмены могут наблюдаться рецидивы заболевания. Противовоспалительный эффект глюкокортикоидов обусловлен прямым влиянием на очаг воспаления и полностью сохраняется при местной аппликации их лекарственных форм (мази, кремы, пасты и др.) на кожу и слизистые. Однако при длительном местном применении препаратов (особенно фторсодержащих) могут атрофироваться эпидермис, дерма и подкожные ткани, появляются точечные кровоизлияния, стрии. Иммунобиологическая реактивность таких тканей снижается, что может стать причиной возникновения пиодермий и кандидозов.

Вторую группу препаратов составляют разнообразные по химической структуры нестероидные противовоспалительные средства (НПВС), например, ацетилсалициловая кислота, натрия салицилат, анальгин, парацетамол, бутадион, индометацин, диклофенак натрия, ибупрофен, пироксикам. Отдельные препараты отличаются друг от друга по силе противовоспалительного, жаропонижающего и анальгезирующего действия. Основной механизм действия этого класса препаратов ингибирование циклооксигеназы и, как следствие, существенное снижение биосинтеза простагландина E₂. НПВС свойственны побочные эффекты: аллергия, повреждение слизистой оболочки ЖКТ (ульцерогенность), отеки и бронхоспазм. Большинство этих проявлений обусловлено антипростагландиновым действием препаратов (Крылов Ю.Ф., Бобырев В.М. Фармакология. Учебное пособие. Москва, Всероссийский учебно-научно-методический центр по непрерывному медицинскому и фармацевтическому образованию (ВУНМЦ), 1999. - 115 с.).

Приведенные данные указывают на определенные недостатки существующих противовоспалительных средств, что требует разработки новых более безопасных препаратов, сочетающих противовоспалительное и анальгезирующее действие. Данное изобретение решает задачу расширения номенклатуры веществ, обладающих противовоспалительной и анальгезирующей активностью. Поставленная задача решается за счет производных простагландина E₂, обладающих противовоспалительной и анальгезирующей активностью, общей формулы:

где X=NH, NH-CH₂-CH₂-CH₂-C(O)-NH или NH-CH₂-CH₂-O-C(O)-NH

Данные соединения представляют собой амид простагландина E2 и дофамина или амиды простагландина E2 и этаноламида (простамид E2) или гамма-аминомасляной кислоты, которые функционализированы соединением с остатком дофамина. Известны амиды простагландина F1, обладающие противовоспалительным действием (WO 2011/154754 A1. Use of prostaglandin F1a and its derivatives for reduction of inflammation. L. Puskas и др.). Однако в данном патенте использован простагландин F1, который отличается от простагландина E2, отсутствием кето-группы в циклопентановом кольце и двойной связи в положении 5, 6 боковой цепи.

Известен также амид простагландина E2 и дофамина, обладающий нейрозащитными свойствами (RU 2474426. Простамиды и их аналоги, обладающие нейрозащитным действием. В.В. Безуглов и др). Однако в этом патенте не раскрыты противовоспалительные и анальгезирующие свойства данного вещества, которые являются новыми и существенными для решения проблемы расширения номенклатуры нестероидных противовоспалительных средств. Два другие заявляемые производные простагландина E₂ и дофамина ранее не были известны.

Все указанные соединения получают стандартными способами химического синтеза, включающими активацию карбоксильной группы простагландина E₂ подходящими реагентами и конденсацию с амином или аминоспиртом. Конденсацию с дофамином в случае простамида E2 проводят через промежуточное образование активированного карбонильного производного. Биологическая активность заявляемых соединений подтверждена в опытах на культуре макрофагов, в которых вызывали воспалительную реакцию смесью липополисахарида и форболового эфира. Противовоспалительную и анальгезирующую активность определяли также в опытах на лабораторных мышах. В указанных экспериментах эти соединения показывали значимый противовоспалительный и анальгезируюший эффект. Причем в опытах на клетках RAW 264.7 значения IC50 противовоспалительного эффекта для всех заявляемых соединений находились в пределах 11-27 мкМ, тогда как стандартные НПВС (ибупрофен, индометацин и диклофенак натрия) не были активно вплоть до концентрации 100 мкМ.

Таким образом, заявляемые соединения решают задачу расширения номенклатуры веществ, обладающих противовоспалительным и анальгезирующим действием, которые могут быть использованы в медицине в качестве нестероидных противовоспалительных средств.

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1. Синтез амида простагландина E₂ и гамма-аминомасляной кислоты.

Навеску 487 мг (1.38 ммоль) простагландина E2 растворяли в 5000 мкл ацетонитрила и добавляли 210 мкл (1.52 ммоль) триэтиламина и оставляли на 20 мин при +4°C, после чего прибавляли 197 мкл (1.52 ммоль) изобутилхлорформиата и оставляли при +4°C на 20 мин. Через 35 мин к полученному раствору прибавляли раствор силильного производного гамма-аминомасляной кислоты в ацетонитриле, приготовленного из 200 мг гамма-аминомасляной кислоты и 1026 мкл (3.9 ммоль) бис-(триметилсилил)трифторацетамида в 500 мкл ацетонитрила. Реакцию выдерживали при комнатной температуре 60 мин.

К реакционной смеси прибавляли 5 мл этанола и оставляли на 30 мин., после чего реакционную смесь упаривали на роторном испарителе и высушивали на масляном насосе. Остаток разбавляли 30 мл этилацетата, переносили в делительную воронку и промывали 2×30 мл дистиллированной водой, 1×20 мл насыщенным раствором NaCl, Органический слой сушили над безводным Na₂SO₄, осадок отфильтровывали, органический слой упаривали. Остаток в виде желтого масла очищали колоночной хроматографией на силикагеле. Элюировали смесью хлороформ- ацетон. Фракции, содержащие продукт, объединяли. Получено 425 мг (70.3%) продукта в виде слегка желтого масла.

R_f=0.37 (хлороформ-метанол, 10:1), масс-спектр: 438.094 [М+Н]+, 460.021 [M+Na]+, ЯМР ¹H (CDCl₃; δ мд; 200 MHz); 0.899 (t; 3H; H20), 1.302-1.311 (m; 6H, H19, H18, H17), 1.448-1.52 (m, 2H, H16), 1.683 (m, 4H, H3, H3′), 2.060-2.334 (m, 11H, H2, H4, H7, H8, H10, H3′), 2.692-2.784 (m, 1H, H12),, 4.031-4.093 (m, 2H, H11, H15), 5.374 (m, 2H, H5, H6), 5.576-5.589 (s, 2H, H13, H14).

Пример 2. Синтез дофаминового производного амида простагландина E₂ и гамма-аминомасляной кислоты (PGE2-GABA-DA)

Навеску 82 мг (0.19 ммоль) амида простагландина E₂, полученного в примере 1, растворяли в 200 мкл ацетонитрила и прибавляли 29 мкл (0.2 ммоль) триэтиламина и выдерживали 20 мин при +4°C, после чего прибавляли 27 мкл (0.2 ммоль) изобутилхлорформиата и выдерживали 20 мин при +4°C. К полученному раствору при охлаждении (баня со льдом) и перемешивании прибавляли 53.5 мг (0.28 ммоль) гидрохлорида дофамина в 200 мкл DMF и 39 мкл (0.28 ммоль) триэтиламина и выдерживали 18 ч. При +4°C.

Реакционную смесь упаривали. Остаток суспендировали в 30 мл этилацетата и промывали 2×30 мл дистиллированной водой, 1×20 мл насыщенным раствором NaCl, Органический слой сушили над безводным Na₂SO₄, осадок отфильтровывали, органический слой упаривали. Остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле Элюировали смесью растворителей хлороформ - ацетон. Фракции, содержащие продукт, объединяли. Получено 55.5 мг (51.7%) продукта в виде белого кристаллического вещества.

R_f=0.2 (хлороформ-метанол, 10:1), масс-спектр: 571,3262 ([М-Н]^-), 553,3162 ([М-Н-H₂O]^-) ¹H-ЯМР, 200 MHz, CDCl₃): 0.88 (3H, т), 1.30 (6H, м), 1.61 (4H, м), 1.88 (2H, м), 2.91 (7H, м), 2.35 (2H, м), 3.23 (2H, кв), 3.43 (2H, м), 4.11 (2H, м), 5.36 (2H, м), 5.66 (2H, м), 6.54 (1H, м), 6.78 (2H, м), 6.97 (1H, т), 8.20 (1H, м).

Пример 3. Синтез дофаминамида простагландина E₂ (PGE2-DA).

К раствору 67 мг (0,19 ммоль) простагландина E2 и 29 мкл (0.209 ммоль) триэтиламина в 3 мл ацетонитрила, охлажденному до -15°C, при перемешивании прибавили 27 мкл изобутилхлорформиата (0,209 ммоль). Перемешивали 20 мин, прибавили раствор 43 мг дофамина гидрохлорида (0,23 ммоль) и 29 мкл (0.209 ммоль) триэтиламина в 600 мкл диметилформамида. Перемешивали 18 ч при 8°C. Реакцию обработали и целевое вещество выделяли как указано в примере 2. Получено: 62 мг (67%) дофаминамида простагландина E2 в виде белого порошка. ¹H-ЯМР (200 MHz, CDCl₃): 0.89 (3H, т), 1.24-1.77 (8H, м), 2.33 (2H, м), 2.64 (2H, м), 4.09-4.12 (2H, м), 5.38(2H, м), 5.65(2H, м), 6.52 (1H, м), 6.73 (2H, м), 7,21 (1H, т), 7,93 (1H, м). Масс-спектр: m/z 510.280 [M+Na]⁺, m/z 470.287 [М+Н-H₂O]⁺.

Пример 4. Синтез конъюгата этаноламида простагландина E₂ (простамида E₂) и дофамина (PGE2-EA-DA).

К охлажденному до 4°C раствору 100 мг (0.28 ммоль) простагландина E₂ и 43 мкл (0.3 ммоль) триэтиламина в 5 мл ацетонитрила прибавляли прибавляли 38 мкл (0.3 ммоль) изобутилхлорформиата и перемешивали при 4°C 30 мин.. К полученному смешанному ангидриду прибавляли 26 мкл (0.42 ммоль) моноэтаноламина и перемешивали 30 мин. Реакционную смесь разбавляли 10 мл этилацетата, промывали водой, насыщенным водным раствором NaCl, высушивали над безводным Na₂SO₄. Осушитель отфильтровывали, фильтрат упаривали в вакууме, остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле в градиентной системе хлороформ-метанол. Получено 88,6 мг (79%) продукта в виде желтого масла. Навеску 82 мг (0.24 ммоль) полученного простамида PGE2-EA растворяли в 2 мл ацетонитрила и прибавляли при перемешивании и охлаждении (ледяная баня) 73 мг (0.28 ммоль) дисукцинимидилкарбоната и 66 мкл (0.47 ммоль) Et₃3N и оставляли на 1.5 ч. Навеску 54 мг (0.28 ммоль) гидрохлорида дофамина растворяли в 500 мкл диметилформамида и прибавляли к полученному выше раствору смешанного карбоната при перемешивании и охлаждении (баня со льдом). Реакционную смесь оставляли на 18 часов. Обрабатывали как указано в примере 2. Получено 93 мг (67%) PGE2-EA-DA в виде бесцветного масла. R_f=0.27 (хлороформ-метанол, 10:1), масс-спектр: 575.071 [М+Н], 636.958 [М+Cu]. ¹H-ЯМР: ′(200 MHz, CDCl3): 0.89 (3H, т), 1.29 (6H, м), 1.39-1.45 (2H, м), 1.63-1.70 (2H, м), 2.02-2.37 (9H, м), 2.59-2.69 (6H, м), 3.06-3.17 (9H, кв), 3.31-3.49 (2H, д.кв.), 3.62-3.71 (1H, м), 3.89-4.05 (3H, м), 4.61 (2H, т), 5.26-5.69 (4H, м), 6.49-6. 86 (3H, м).

Пример 5.

Способность синтезированных соединений влиять на воспалительный ответ оценивали про продукции оксида азота (измеряемому в виде стабильного продукта окисления - нитрита по методу Гриса) в мышиных макрофагах RAW 264.7. Накануне эксперимента культуры клеток рассеивали в 96-луночные планшеты с плотностью 100 тыс.клеток в лунке. Индукцию воспалительного ответа проводили с помощью 1 мкг/мл липополисахарида в сочетании с 0.5 мкг/мл форбол 12-миристата 13-ацетата и в присутствие 2 мМ L-аргинина в среде культивирования (DMEM, 4 мМ L-глутамина, 4 г/л D-глюкозы, 10% бычьей эмбриональной сыворотки, 100 ед./мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0.25 мкг/мл амфотерицина В) с 2.5% сыворотки. Стоковые растворы веществ в DMSO растворяли в среде для индукции воспалительного ответа со стимуляторами (противовоспалительная активность) или без них (провоспалительная активность) в диапазоне концентраций 0.01-100 мкМ и заменяли среду культивирования в лунках на полученный раствор. Инкубация с веществом продолжалась 20 ч. После этого из каждой лунки отбирали аликвоту среды и определяли концентрацию NO по модифицированному методу Гриса. К 75 мкл анализируемой смеси в лунках 96-луночного планшета для ИФА добавляли 12.5 мкл водного раствора 0.04% сульфаниламида, выдерживали при комнатной температуре 10 мин с защитой от света, после чего добавляли 12.5 мкл 2% раствора нафтилэтилендиамина в 3M HCl, выдерживали еще 10 мин при комнатной температуре с защитой от света, после чего определяли оптическое поглощение при длине волны 540 нм.

Результаты представлены в таблице 1.

Все испытуемые вещества оказывали выраженное противовоспалительное действие, но не стимулировали воспалительный ответ. Значения IC50 составили От 11 до 27 мкМ. Следует отметить, что в этих экспериментах стандартные НПВС (ибупрофен, индометацин и диклофенак натрия) не проявляли противовоспалительного эффекта вплоть до концентрации 100 мкМ.

Пример 6.

Эксперименты по определению противовоспалительной и противоболевой чувствительности были проведены на мышах линии CD-1 (аутбредные альбиносы).. Воспаление индуцировали введением полного адъюванта Фрейнда в заднюю лапу животного. При этом развивается локальное воспаление, образуется отек и лапа увеличивается в размере. В случае противовоспалительной активности вещества, этот размер должен статистически отличаться от размеров контрольной лапы, в которую вводили растворитель вместо испытуемого соединения.

Стандартным тестом, в котором измеряется порог острой болевой чувствительности, является тест «горячая пластина». Болевая чувствительность определяется по задержке физиологической реакции животного: отдергивание больной лапки, сек; облизывание передних лап, сек; облизывание задних лап, сек; подпрыгивание, сек.

Всем животным до начала эксперимента измеряли толщину левой задней лапы при помощи штангенциркуля. Это значение было исходным. Затем всем животным вводили в подушечку левой задней лапы раствор полного адъюванта Фрейнда (ПАФ) в воде (20%) по 20-30 мкл. Спустя 20-24 часа было вновь проведено измерение толщины лапы, в которую кололи ПАФ, после чего был введен один из тестируемых препаратов или раствор спирта 14% в физрастворе. Затем спустя 20 минут после введения животные были протестированы в тесте «горячая пластина» на болевую чувствительность. Измерение толщины лапы, в которую кололи ПАФ проводили через 2, 4, 6, 24 и 48 часов после введения. Результаты представлены в таблицах 2 и 3.

Анализируя данные таблицы 2, можно заметить, что эффект препаратов становится заметным уже через 4 часа после введения. Однако эти изменения статистически не достоверны. Значимые результаты для всех производных простагландина E2 наблюдаются через 48 часов после их введения, а для соединений PGE2-EA-DA и PGE2-GABA-DA этот эффект наступает уже через сутки после введения. Таким образом, все исследуемые препараты, а именно: PGE2-DA, PGE2-C2-DA и PGE2-C4-DA в дозе 10 мг/кг внутрибрюшинно проявляют противовоспалительную активность

В таблице 3 представлены результаты теста на болевую чувствительность. В этом тесте статистически значимую способность снижать болевую чувствительность в дозе 10 мг/кг внутрибрюшинно проявил только дофаминамид простагландина E₂ (PGE2-DA). Причем можно отметить, что эффект был заметен вблизи области введения. Время отдергивания больной лапки увеличилось в 2,5 раза и задержка времени облизывания задних лап возросла с 28 до 46 сек. Системная анальгезия была значительно менее заметна. Два других вещества также увеличивали порог болевой чувствительности в зоне введения. Однако в данном эксперименте это увеличение было менее значимым по сравнению с эффектом PGE2-DA.

Таблицы к заявке «Производные простагландина, обладающие противовоспалительной и анальгезирующей активностью»