Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ИНТОКСИКАЦИИ ФОРМАЛИНОМ В ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОМ ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной токсикологии, и может быть использовано для изучения способов формирования и прогрессирования хронических изменений в печени, возникающих в эксперименте, под действием химических повреждающих факторов.

Одним из таких факторов является формальдегид. Источниками хронического воздействия формальдегида на организм человека являются сточные воды, дождевая вода, воздух, где концентрация его паров находится на уровне 0,01 мг/м³ и выше. Использование формальдегида в производстве смол в качестве бактерицидного и бальзамического средства, фунгицида в качестве промежуточных продуктов при производстве химических веществ и как компонента конечного использования потребительских товаров придает этому веществу определенное токсикологическое значение. В связи с этим для изучения механизмов формирования хронического неинфекционного заболевания печени и возможности профилактики и лечения возникающих при этом патологических изменений, требуются адекватные экспериментальные модели, приближенные к реальным клиническим патологиям.

У крыс при действии химических веществ и разбалансированном питании наблюдаются различные метаболические, и в том числе дислипидемические нарушения, поэтому для моделирования патологии печени и развития различных типов дислипидемий эти животные наиболее пригодны. Наиболее часто при моделировании гепатита, цирроза печени, жирового гепатоза и др. заболеваний печени инициатором повреждений является токсический фактор [1-4].

Известны способы моделирования токсического гепатита и цирроза печени крыс в течение 5-7 месяцев, путем помещения животного в клетку с открытым резервуаром, наполненным 70%-ным раствором формалина (заявка на пат. RU 94026117. Способ создания модели гепатита и цирроза печени млекопитающих. Бояринов Г.А., Смирнов В.П., Кауров Я.В. и др., опубл. 27.08.1996). Хроническая токсическая гепатопатия моделируется у крыс ежедневным введением 50% раствора 2,4-дихлорфенола на оливковом масле внутрижелудочно, через зонд, в течение трех недель в дозе 5 мг на 100 г массы тела животного (пат. RU 2343556. Способ моделирования хронической токсической гепатопатии. Ибаттулина Р.Б., Мышкин В.А., Бакиров А.Б., опубл. 10.01.2009), а также путем ежедневного однократного введения через зонд в желудок раствора хлорида кобальта 2 мг/мл (в пересчете на металл) в дозе 0,1 мг на 100 г крысы в течение месяца (пат. RU 2440621. Способ моделирования хронической токсической гепатопатии. Брин В.Б., Митциев А.К., Митциев К.Г. и др., опубл. 20.01.2012).

Недостатками перечисленных выше способов моделирования токсической гепатопатии, жировой дистрофии и цирроза печени являются длительность создания экспериментальной патологической модели - 7 месяцев, высокая токсичность используемого летучего вещества - формальдегида и хлорида кобальта, введение веществ зондом, что при неумелом обращении часто приводит к перфорации желудка и гибели животных. Введение четыреххлористого углерода осуществляется в растворителе и подкожно, что не физиологично, так как многократное подкожное введение масляного раствора химического вещества вызывает некробиотические изменения на месте введения и очень медленно достигает органа-мишени. Основным временным показателем для создания экспериментальных моделей хронического поражения токсическими веществами является длительность от 20 дней до 4 месяцев, ингаляторно или per os, что ближе к реальным условиям и соблюдается при нашем варианте моделирования.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является способ инициации токсического поражения печени путем перорального введения 40% этилового спирта в дозе 14 мл/кг в течение 60 дней (Доркина, Е.Г. Гепатопротекторные свойства флавоноидов: автореферат диссертации на соискание уч. зв. док. биол. наук: 14.03.06 / Доркина Елена Григорьевна. - Волгоград, 2010. - 45 с.).

Недостатками данного способа являются введение 40% этанола зондом и длительность создания экспериментальной патологической модели - 60 дней.

Техническим результатом предлагаемого способа является решение задачи, заключающейся в создании модели хронического токсического поражения печени введением 10% раствора формалина (CH₂O), который вводится шприцем в течение 50 дней, который по сроку моделирования приближен к клиническому течению хронического процесса в печени по сравнению с картиной поражения в патогенезе в прототипе, где животным вводился зондом 40% этиловый спирт в течение 60 дней. Преимущества предлагаемой модели хронического поражения печени в том, что она легко воспроизводима, доступна, химическое вещество вводится перорально, моделирование осуществляется в более короткие сроки, с соответствующей картиной поражения в патогенезе, которая приближена к клиническому течению хронического процесса в печени за счет развития структурных и функциональных изменений в гепатоцитах под действием химического вещества.

Указанный технический результат достигается тем, что используют 10% раствор формалина (CH₂O), который вводят крысам-самцам через день, per os, шприцем, из расчета 0,2 мл на 100 г массы животного, в течение 50 дней, с последующим проведением лабораторных тестов и исследованием печени.

Для достижения адекватности предлагаемой модели изучено 30 крыс-самцов линии Вистар массой тела 180-250 г, разделенных на группы. Первую группу представляли 10 интактных животных. 20 крысам, представляющим вторую группу, в течение 50 дней, через день, per os, шприцем вводили 10% раствор формалина, из расчета 0,2 мл на 100 г массы тела животного. Для третьей группы, составляющей 10 животных, инициировалось токсическое поражение путем введения 40% этилового спирта в дозе 14 мл/кг, в течение 60 дней по способу прототипа.

На 60-й в прототипе и 50-й день моделирования способа животных декапитировали с последующим проведением лабораторных тестов и патоморфологическим исследованием печени. Изучали содержание в сыворотке крови аспартатаминотрансферазы (ACT) и аланинаминотрансферазы (АЛТ) в (Ед/л), холестерина (X) в (ммоль/л), холестерина липопротеидов низкой плотности (ХЛПНП) и холестерина липопротеидов высокой плотности (ХЛПВП) в (ммоль/л), триглицеридов (ТГ) в (ммоль/л), креатинина (КР) в (мкмоль/л) и щелочной фосфатазы (ЩФ) в (МЕ/л).

Способ осуществляется следующим образом.

Группе животных в течение 50 дней, через день, per os шприцем вводили 10% раствор формалина (CH₂O) из расчета 0,2 мл на 100 г массы животного. Воспроизведение модели констатировали по изменению патоморфологических и гистологических признаков, и биохимических показателей: содержание в сыворотке крови аспартатаминотрансферазы (ACT) и аланинаминотрансферазы (АЛТ) в (Ед/л), холестерина (X) в (ммоль/л), холестерина липопротедидов низкой плотности (ХЛПНП) и холестерина липопротеидов высокой плотности (ХЛПВП) в (ммоль/л), триглицеридов (ТГ) в (ммоль/л), креатинина (КР) в (мкмоль/л) и щелочной фосфатазы (ЩФ) в (МЕ/л).

Приготовление формалина (CH₂O) производится путем разведения формальдегида в воде до концентрации 10%.

Способ был апробирован в условиях отдела изучения механизмов действия физических факторов (ОИМДФФ) Пятигорского ГНИИ курортологии. Объектом исследований послужили 40 крыс-самцов линии Вистар, с массой тела 190-219 г, разделенные на 3 группы - интактные, с моделью прототипа и с моделью хронической интоксикации 10% раствором формалина. По истечении срока эксперимента сравнивали полученную картину как патоморфологических, так и саногенетических реакций в системах, контролирующих метаболические реакции.

Способ может быть проиллюстрирован следующими примерами.

Интактная крыса-самец линии Вистар №3, масса тела 200 г. Дополнительных воздействий не получала. Исследование животного осуществлено одновременно с животными опытной группы. Содержание в крови ACT - 96,8 Ед/л, АЛТ - 80,2 Ед/л, Х - 2,7 ммоль/л, ТГ - 0,9 ммоль/л, ХЛПНП - 2,2 ммоль/л, ХЛПВП - 1,1 ммоль/л, КР 83,2 мкмоль/л, ЩФ 482,0 МЕ/л.

Крыса-самец линии Вистар №14, масса тела 208 г. Ежедневно, 1 раз в сутки, перорально вводили 40% этиловый спирт в дозе 14 мл/кг, в течение 60 дней по способу прототипа. Содержание в крови ACT - 190,3 Ед/л, АЛТ - 80,1 Ед/л, Х - 0,7 ммоль/л, ТГ - 1,3 ммоль/л, ХЛПНП - 2,5 ммоль/л, ХЛПВП - 0,6 ммоль/л, КР 53,2 мкмоль/л, ЩФ 489,0 МЕ/л. Результат расценен как хроническое токсическое поражение.

Крыса-самец линии Вистар №23, масса тела 195 г. В течение 50 дней, через день, per os, шприцем вводили 10% раствор формалина, из расчета 0,2 мл на 100 г массы тела животного. Содержание в крови ACT - 180,2 Ед/л, АЛТ - 105,4 Ед/л, Х - 1,5 ммоль/л, ТГ - 1,8 ммоль/л, ХЛПНП - 2,8 ммоль/л, ХЛПВП - 0,7 ммоль/л, КР 60,0 мкмоль/л, ЩФ 600,0 МЕ/л. Результат расценен как хроническое токсическое поражение.

Из представленной таблицы следует, что увеличение содержания ACT; АЛТ; (Р<0,001) в сыворотке крови указывают на усиление степени поражения печени и свидетельствуют о повреждении гепатоцитов, значительное снижение показателя X (Р<0,001), а также повышение ХЛПНП, ТГ (Р<0,05) и снижение ХЛПНП (Р<0,01) указывают на снижение синтетической функции печени, нарушения липидного обмена, а незначительное повышение уровня щелочной фосфатазы (Р<0,001) и снижение уровня креатинина(Р<0,001), на развитие холестаза.

Для подтверждения достоверности полученных изменений биохимических показателей дополнительно проведены гистологические исследования, для чего изучены микропрепараты.

Группа 1: Микроскопическая картина печени интактных животных без патологии. Балочное строение печени не нарушено на долю соединительной ткани приходится 0,5%. В единичных гепатоцитах выявлено наличие жировой дистрофии.

Группа 2: При гистологическом исследовании препаратов печени 20 отравленных крыс отмечается незначительное нарушение структуры паренхимы печени при более выраженных дистрофических изменениях гепатоцитов.

При хронической формалиновой интоксикации наблюдаются следующие морфологические изменения структуры печени: гепатоциты набухшие, локализованы преимущественно в перипортальной зоне, цитоплазма их мутная, границы клеток не четкие, ядра также набухшие (гидропическая дистрофия). Гепатоциты содержат овальные ядра с хорошо просматриваемыми ядрышками. В части гепатоцитов более выраженные изменения за счет увеличения в объеме клеток, цитоплазма их прозрачная (балонная дистрофия). В межбаллочном пространстве и в области соединений ткани триад неравномерное скопление лимфоцитов. Определяется дискомплексация печеночных балок, незначительная пролиферация соединительной ткани в портальных трактах с проникновением фиброзных тяжей вглубь долек. Отдельные клетки очень крупные, представляют собой сплошную вакуоль. Центральные дольковые вены расширены, полнокровны.

Таким образом, получена модель хронической интоксикации печени, вызванной пероральным введением формалина, выражающаяся в усилении дегенеративных процессов в печени, подтверждаемых повышением трансаминаз в сыворотке крови, сопровождаемая развивающейся креатининемией, снижением синтетической функции печени и развитием холестаза. Предлагаемый способ моделирования является достаточно информативным, близок к реальной клинической картине и показывает эффективность его использования в эксперименте.