Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ Trichoderma citrinoviride Bissett - ПРОДУЦЕНТ АНТИБИОТИКОВ-ПЕПТАИБОЛОВ С АНТИГРИБНОЙ И АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и биотехнологии, микроскопическим грибам - продуцентам антибиотических соединений для получения лекарственных препаратов.

На фоне общего снижения иммунной защиты организма наблюдают рост заболеваемости микозами [Blyth С., Hale К., Palasanthiran P., O'Brien Т, Bennett M. Antifungal therapy in infants and children with proven, probable or suspected invasive fungal infections// Cochrane Database Syst Rev. 2010. - P. 213-220] и инфекциями, вызываемыми резистентными формами патогенных бактерий [Антоньев А.А. Экспертиза трудоспособности при заболеваниях кожи / А.А. Антоньев.- M. - 1982. - 224 с.]. Довольно часты случаи смешанных инфекционных поражений, что требует одновременного применения противогрибковых и антибактериальных препаратов [Ruiz-Camps, Cuenca-Estrella Antifungals for systemic use // Enferm Infecc Microbiol Clin. 2009. V. 27(6). - P. 353-362.; Chagla Z., Salvadori M., Sontrop J.M., John M., Hussain Z., Chagla Y., Warshawsky В., Achiam C., Thompson B. Genetically typed community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a Canadian hospital //Can J Infect Dis Med Microbiol. 2009. - 20(3):e113-114]. Особенно опасно развитие грибных и бактериальных инфекций у иммуноскопрометированных и онкологических больных [Рунке M. Грибковые инфекции у иммуноскомпрометированных пациентов (Эпидемиология, диагностика, терапия, профилактика) Проблемы медицинской микологии. - 2000. - №1. - С. 4-16; В.М. Гельфонд Инфекционные осложнения у онкологических больных / Практическая онкология, Т. 10, №3 - 2009, с. 141-146]. Поэтому актуален поиск микробных продуцентов, обладающих способностью к синтезу соединений широкого спектра действия - антигрибного и антибактериального, в том числе и против резистентных форм бактерий.

Известны штаммы микроскопических грибов Penicillium chrysogenum, Cephalosporium acrenomium (Acremonium chrysogenum), Aspergillus fumigatus, Penicillium griseofulvum, P. nigricans - продуценты антибиотиков в отношении патогенных бактерий или грибов и простейших [Егоров, Н.С. Основы учения об антибиотиках / Н.С. Егоров // M.: Изд-во МГУ. - 2004. - 512 с.; Промышленная микробиология: учеб. пособие для вузов по спец. «Микробиология» и «Биология» / З.А. Аркадьева, A.M. Безбородов, И.Н. Блохина и др.; под ред. Н.С. Егорова. M.: Высш. Шк., 1989. 688 с.].

Известны штаммы МГ-97 Т. asperellum, обладающие фунгицидной активностью в отношении фитопатогенов рода Fusarium, Alternaria [Патент RU № 2171580. Штамм гриба Trichoderma sp.МГ-97, используемый для защиты сеянцев хвойных от фузариозов. / Громовых Т.И., Шмарловская С.В., Тюльпанова В.А., Громовых B.C. Заявка № 99126556/13 от 17.12.199 г. Опубл. 10.08.2001 г. Бюлл. № 22. 2001 г.] и Т. lignorum T13-82, проявляющий активность в отношении фитопатогенных грибов и бактерий [Патент RU № 2121793. Степанова Е.В., Штерншис М.В., Репин В.Е. Штамм гриба Trichoderma lignorum, используемый против фитопатогенных грибов и бактерий. Опубл. 14.07.1998 г].

Известны штаммы видов Trichoderma asperellum и Т. koningii, синтезирующие пептаиболы, которые ингибируют патогенные дрожжевые грибы и обладают антипротозойной активностью [Reino J.L. Secondary metabolites from species of the biocontrol agent Trichoderma I J.L. Reino, R.F. Guerriero, R. Hema`ndez -Gala`, I.G. Collado // Phytochem Rev. - 2008. - Vol. 7. - P. 89-123].

Наиболее близким к предлагаемому изобретению, который следует принять за ближайший аналог, является штамм Trichoderma citrinoviride 2963, продуцирующий антибиотик из группы пептаиболов, который подавляет рост метициллинрезистентного золотистого стафилококка [Алимова Ф.К. Trichoderma Hypocrea (Fungi, Ascomycetes, Hypocreales): таксономия и распространение / Ф.К. Алимова // Казань: Казанский гос. универ. - 2005. - 264 с]. Однако этот штамм не обладает антимикотической активностью в отношении условно-патогенных и патогенных мицелиальных и дрожжевых грибов, а также против других, кроме метициллинрезистентного золотистого стафилококка, патогенных бактерий.

Задачей настоящего изобретения является поиск штамма микроскопического гриба Trichoderma citrinoviride, продуцирующего антибиотики с высокой активностью к бактериям, включая резистентные формы стафилококка, и к условно-патогенным и патогенным мицелиальным и дрожжевым грибам.

Техническим результатом изобретения является новый штамм TYVI 4/11 ВКПМ F-1228 Trichoderma citrinoviride, который продуцирует пептаиболы с высокой антибактериальной активностью, в том числе к резистентным стафилококкам, и фунгицидной активностью - к условно-патогенным и патогенным видам грибов. Штамм предназначен для создания антибиотиков широкого спектра действия - антибактериального и антигрибного.

Сущность изобретения состоит в том, что новый штамм Trichoderma citrinoviride ВКПМ F-1228 выращивают на жидкой питательной среде Сабуро при 22-25°С в течение 10-14 сут, от культуральной жидкости отделяют грибную биомассу фильтрованием, антибиотические соединения экстрагируют этилацетатом из отфильтрованной культуральной жидкости (при соотношении экстрагента к культуральной жидкости 3:1), полученные экстракты упаривают досуха под вакуумом при 42°С, сухой препарат хранят при 5°С. Для определения антибиотической активности применяют стандартный метод дисков, которые пропитывают экстрактом (препаратом), растворенным в 60% водном растворе этанола, и сушат их на воздухе в стерильных условиях. Об антибиотической активности препарата судят по величине диаметра зон подавления диском тест-штаммов патогенных и условно-патогенных бактерий и грибов [Егоров, Н.С. Основы учения об антибиотиках / Н.С. Егоров.// М.: Изд-во МГУ. - 2004. - 512 с.]. Получают более высокое или сопоставимое действие препарата Trichoderma citrinoviride ВКПМ F-1228 в сравнении со стандартными дисками с амфотерицином В («НИИ Пастера», 40 мкг/мл) и с ампициллином («НИИ Пастера», 10 мкг/мл). В препарате методами масс-спектрометрии устанавливают наличие пептаиболов [Т. Neuhof, R. Dieckmann, I. Druzhinina, С.P. Kubicek, Н. von Do¨hren Intact-cell MALDI -TOF mass spectrometry analysis of peptaibol formation by the genus Trichoderma. Hypocrea: can molecular phylogeny of species predict peptaibol structures? // Microbiology. - 2007. - Vol. 153. - P. 3417-3437; N. Stoppacher, S. Zeilinger, М. Omann, P. Lassahn, A. Roitinger, R. Krska, R. Schuhmacher Characterisation of the peptaibiome of the biocontrol fungus Trichoderma atroviride by liquid chromatography/tandem mass spectrometry // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2008; 22: 1889-1898].

Тест-культурами берут коллекционные штаммы патогенных мицелиальных и дрожжевых микроскопических грибов Aspergillus niger INA 00760, Candida albicans ATCC 2091, С.tropicales INA 00763, условно-патогенных микромицетов - A. oryzae 1К, A. niger 2К, A. fumigatus 4К, A. terreus 4К, A. fisheri 3К, A. flavus 7К, A.ustus 8К и тест-культур штаммов грамположительных бактерий - Bacillus subtilis ATCC 6633, В. mycoides 537, Micrococcus luteus NCTC 8340, метициллинрезистентного штамма Staphylococcus aureus FDA 209P, Bacillus coagulans 429, грамотрицательных бактерий - Escherichia coli ATCC 25922, Comamonas terrigena ATCC 8461.

Штамм Trichoderma citrinoviride TYVI 4/11 получен как моноспоровый клон путем селекции на антимикробную и противоопухолевую активность из штамма TV4-1, выделенного ранее из мульчи лесопитомника Каа-Хемского лесхоза республики Тыва РФ.

Штамм Trichoderma citrinoviride депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под номером ВКПМ F-1228.

Штамм TYVI 4/11 ВКПМ F-1228 идентифицирован как Trichoderma citrinoviride на основе секвенирования ITS1 и ITS2 участков генома и культурально-морфологических признаков.

Штамм Trichoderma citrinoviride Bissett ВКПМ F-1228 относится к митоспоровым грибам - анаморфам аскомицетного аффинитета: рода Hypocrea, семейства Нуросгеасеае, порядка Hypocreales, класса Sordariomycetes, отдела Ascomycota (www.indexfungorum.org).

Культурально-морфологические признаки

Макроморфологические признаки. На среде Чапека при 25°С рост быстрый, край колонии бахромчатый, мицелий бесцветный, стелющийся, паутинистый, ватообразный, цвет спороношения яркий - яблочно-зеленый или зеленовато-желтый, образует пигмент желтого цвета, экссудат, ограниченный в мелких капельках.

Микроморфология. Гифы бесцветные, гладкие, 2-8 µm в диаметре. Конидиеносцы неокрашенные, гладкие, 2,5-5 µm в диаметре. Главная ось длинная, ветвится нерегулярно, на конидидиеносце по одной-две веточки. Фиалиды расположены прямо на конидиеносце или на веточках по одной, реже мутовками по две-три. Спороношение в крупных подушечках, конидии мелкие, гладкие, 2.5-3.5 X 1.5-2.8 µm, образует хламидоспоры.

Для культивирования штамма, помимо дианостической среды Чапека, используют сусло-агар и среду Сабуро.

Молекулярно-генетические признаки

Штамм имеет следующую последовательность, зарегистрированную в NCBI под шифром KF928670:

Степень сходства нового штамма TYVI 4/11 ВКПМ F-1228 с коллекционными штаммами вида Trichoderma citrinoviride составляет 98,0%, что указывает наряду с культурально-морфологическими свойствами его принадлежность к Trichoderma citrinoviride.

Физиолого-биохимические признаки

Аэроб, оптимальные температура роста 25-26°С, рН 5,5-5,8. Штамм усваивает различные легкодоступные углеводы - маннозу, рафинозу, лактозу и другие, минеральные и органические (пептон) источники азота, устойчив к повышенным концентрациям кадмия, никеля и свинца в среде. Хорошо растет и спороносит на средах, содержащих сусло и/или глюкозу.

Штамм хранят на сусло-агаре в пробирках при температуре 5-6°С с периодическим пересевом (1 раз в 6-12 месяцев). Для длительного хранения используют методы лиофилизации и криоконсервации.

Штамм является непатогенным и нетоксичным микроорганизмом.

Изобретение подтверждают следующие примеры

Пример 1. Определение фунгицидной активности штамма TYVI 4/11 ВКПМ F-1228 Т. citrinoviride в отношении штаммов патогенных и условно-патогенных грибов

В качестве посевного материала используют 5-суточную культуру, полученную на сусло-агаре. Штамм выращивают в жидкой стандартной среде Сабуро (300 мл) в стационарных условиях в колбах на 500 мл в течение 14 суток при 25°С. Биомассу мицелия и спор отделяют фильтрованием культуральной жидкости через мембранные фильтры на воронке Зейца под вакуумом. Антибиотические вещества из отфильтрованной культуральную жидкости (кж) и грибной биомассы экстрагируют этилацетатом (при соотношении экстрагента и культуральной жидкости 3:1). Полученные экстракты упаривают в вакууме на роторном испарителе «Rotavapor-RBüchi» (Швейцария) досуха при 42°С, сухой остаток - препарат хранят при 4°С. Для определения антибиотической активности используют метод дисков [Егоров, 2004]. Диски пропитывают препаратом, растворенным в 60% водном растворе этанола и сушат их на воздухе в стерильных условиях.

Тест-объектами берут коллекционные штаммы патогенных мицелиальных и дрожжевых микроскопических грибов Aspergillus niger INA 00760, Candida albicans ATCC 2091, С.tropicales INA 00763 и условно-патогенных микромицетов - A. oryzae 1К, A. niger 2К, A. fumigatus 4К, A.terreus 4К, A. fisheri 3К, A. flavus 7К, A.ustus 8K. Контролем служат стандартные диски с амфотерицином В («НИИ Пастера», 40 мкг/мл). Величину диаметра зоны подавления роста тест-культур оценивают на 5-7 сутки. Чашки Петри с дрожжами инкубируют при 37°С на среде Сабуро, с патогенными и условно-патогенными грибами, микроскопическими грибами при 28°С на среде Чапека.

Этанольные и метанольные экстракты из мицелия Trichoderma citrinoviride TYVI 4/11 ВКПМ F-1228 получают экстракцией метанолом или этанолом в течение 24 часов (1 г мицелия на 100 мл экстракта) и устанавливают, что они не проявляют антимикотической активности или она следовая.

Экстракты культуральной жидкости штамма Trichoderma citrinoviride TYVI 4/11 ВКПМ F-1228 обладают широким спектром фунгицидной активности в отношении патогенных и условно-патогенных видов грибов. Величины зоны подавления роста тест-культур С. albicans ATCC 2091, Candida tropicales INA 00763 и A. niger INA 00760 - 25±2 мм, 28±2 мм и 31±2 мм, соответственно. Штамм ингибирует рост всех условно-патогенных тест-культур, но особенно эффективен против A. fumigatus 4K, A. tereus 4K, A. ustus 8K. Антибиотическая активность препарата из культуральной жидкости citrinoviride TYVI 4/11 ВКПМ F-1228 в подавляющем большинстве случаев превышает активность амфотерицина В (таблица 2).

Пример 2

Опыт проводят согласно примеру 1, но штамм Trichoderma citrinoviride TYVI 4/11 ВКПМ F-1228 культивируют 10 суток при 25°С.

Экстракты культуральной жидкости штамма Trichoderma citrinoviride TYVI 4/11 ВКПМ F-1228 обладают широким спектром фунгицидной активности в отношении патогенных и условно-патогенных видов грибов. Величины зоны подавления роста тест-культур патогенных грибов С.albicans ATCC 2091 и A. niger INA 00760 составляют 15±2 мм и 25±2 мм, соответственно. На 10-е сутки штамм не активен в отношении С. tropicales INA 00763.

Пример 3

Опыт проводят согласно примеру 1, но в качестве тест-культур используют штаммы грамположительных бактерий - Bacillus subtilis ATCC 6633, В. mycoides 537, Micrococcus luteus NCTC 8340, метициллинрезистентный штамм Staphylococcus aureus FDA 209P, Bacillus coagulans 429, грамотрицательных бактерий - Escherichia coli ATCC 25922, Comamonas terrigena ATCC 8461.

Тест-культуры В. subtilis ATCC 6633 и В. mycoides 537 выращивают на среде, приготовленной на бульоне Хоттингера в разведении 1:2 следующего состава (г/л): глюкоза - 10,0; NaCl - 2,0; агар - 20,0. Е. coli ATCC 25922, M. luteus NCTC 8340, S. aureus PDA 209P, С terrigena ATCC 8461- на мясо-пептонном агаре (МПА) («ЗАО НИЦФ», Россия). Используют для засева суточные культуры бактерий. Бактерии выращивают в пробирках со скошенным питательным агаром, затем клетки суспендируют в физиологическом растворе до мутности 0,5 по стандарту McFarland (1,5×10⁸ КОЕ/мл) и используют в течение 15 минут. Бациллы, стафилококки и микрококки культивируют при 37°С, Е. coli - при 42°С, В. coagulans - при 55°С. Инокуляцию культур на чашку осуществляют штрихами в 3-х направлениях под углом 60°, каждый раз поворачивая чашку вокруг своей оси. Антибактериальное действие экстрактов штамма оценивают принятым методом с помощью стерильных бумажных дисков, смоченных в экстрактах и высушенных в стерильных условиях. Контролем служат стандартные диски с ампициллином («НИИ Пастера», 10 мкг/мл). Величину диаметра зоны подавления роста тест-культур оценивают на 2-е сутки дисков [Егоров, 2006].

Этанольные и метанольные экстракты из мицелия Trichoderma citrinoviride TYVI 4/11 ВКПМ F-1228 не проявляют антибактериальной активности или она следовая.

Экстракт КЖ предлагаемого штамма подавляет рост метициллинрезистентного золотистого стафилококка S.aureus FDA 209P, который вызывает опасные «госпитальные» инфекции (табл. 3). Величина зоны подавления его роста составляет 35 мм от экстракта в сравнении с 15 мм от ампициллина. Штамм также обладает более высокой антибиотической активностью к В. subtilis ATCC 6633, В. mycoides 537 и С. rigena ATCC 8461 и близкой к ампициллину к другим тест-бактериям.

Пример 4

Опыт проводят согласно примеру 3, но культивирование предлагаемого штамма проводят 10 суток при 22°С.

Экстракт КЖ предлагаемого штамма подавляет рост метициллинрезистентного золотистого стафилококка S. aureus FDA 209P, который вызывает опасные «госпитальные» инфекции (табл.4). Величина зоны подавления его роста составляет 30 мм от экстракта в сравнении с 15 мм от ампициллина. Штамм также проявляет более высокую антибиотическую активность к В. coagulans 429, В. subtilis ATCC 6633, В. mycoides 537 и С, rigena ATCC 8461 и близкую к ампициллину к другим тест-бактериям.

Пример 5. Выделение и идентификация пептаиболов из этилацетатных экстрактов культуральной жидкости штамма Trichoderma citrinoviride TYVI 4/11 ВКПМ F-1228

Для выделения активных фракций пептаиболов из этилацетатных экстрактов применяют тонкослойную хроматографию. Образцы экстрактов (10-15 мкл) наносят на пластинки DCAlufoilien Kieselgel-60 ("Merck", Германия) размером 15×15 см с тонким слоем силикагеля и помещают системы хлороформ : метанол (40:10) и этилацетат : метанол (35:5). Биоавтографию антибиотических веществ осуществляют с тест-организмами В. subtilis ATCC 6633 и A. niger INA 00760. Активную фракцию снимают шпателем с пластинки с ТСХ, затем эллюируют в 60% этаноле, фильтруют через мембранные фильтры и упаривают досуха под вакуумом при 42°С, затем растворяют в 60% этаноле.

Молекулярные массы активных соединений определяют на масс-спектрометре Ultraflex II MALDI ToF/ToF "Bruker Daltonics" (Германия), оснащенном УФ лазером 355 нм (Nd) в режиме получения положительных ионов с использованием рефлектрона. На мишени смешивают по 1 мкл раствора образца и 0.3 мкл раствора 2.5-дигидроксибензойной кислоты с концентрацией 10 мг/мл в 20%-ном ацетонитриле с 0.5%-ной трифторуксусной кислотой и полученную смесь высушивают на воздухе.

ИК-спектры соединений активных фракций получают на приборе ИК-Фурье спектрометре Nicolet - iS10 (Thermo Fisher Scientific, США) с использованием детектора DTGS, светоделителя КВг, и приставки Smart Performer, оснащенной ZnSe кристаллом. Измерение проводят при разрешении 4 см^-1; зона спектра 3000-650 см^-1. ИК-спектры соединений обрабатывают по программе OMNIC-7.0, их расшифровку делают по Тарасевичу [Тарасевич Б.Н. ИК спектры основных классов органических соединений /Б.Н. Тарасевич // Справочные материалы. МГУ, 2012. - 55 с].

Присутствующие во фракции активные компоненты имеют следующие (Да) массы: 1701, 1712, 1714, 1724, 1726, 1728, 1730, 1736, 1742, 1743, 1749, 1752, 1754, 1756, 1766, 1768, 1770, 1784 (фиг. 1).

Для ИК-спектра активной фракции характерно присутствие следующих полос поглощения (ν_max, см^-1): сильно выраженная полоса поглощения в области 3360-3370 см^-1, что соответствует валентным колебаниям ОН группы, небольшие пики при 2854 см^-1 могут вызываться колебаниями алифатических групп СН₂; пик при 1739 см^-1 соответствует валентным колебаниям С=O в СООН у дикарбоновых кислот, полоса в области 1600-1560 см^-1 соответствует колебаниям СО₂ группы у аминокислот, поглощение с максимумом в области 1261 см^-1 может быть вызвано валентными колебаниями С-О первичных и вторичных спиртовых групп.

Сопоставление данных масс-спектра и ИК-спектра активной фракции этилацетатных экстрактов КЖ штамма Trichoderma citrinoviride TYVI 4/11 BKHMF-1228 с таковыми у известных соединений, а также наличие у них антибактериальной и фунгицидной активности свидетельствует, что антибиотические соединения в экстракте культуральной жидкости принадлежат к группе мембраноактивных пептидов - пептаиболов [Т. Neuhof, R. Dieckmann, I. Druzhinina, С.P. Kubicek, H. von Do¨hren Intact-cell MALDI - TOF mass spectrometry analysis of peptaibol formation by the genus Trichoderma. Hypocrea: can molecular phylogeny of species predict peptaibol structures? // Microbiology. - 2007. - Vol. 153. - P. 3417-3437].

Фиг. 1. Масс-спектрометрический анализ фракции Т. citrinoviride TYVI 4/11, обладающей фунгицидной активностью.

Фиг. 2. ИК-спектр активной фракции Т. citrinoviride TYVI 4/11, обладающей фунгицидной активностью.