Результат интеллектуальной деятельности: СРЕДСТВО ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВ, ЗАГРЯЗНЕННЫХ ГЕКСАХЛОРБЕНЗОЛОМ, ЛИНДАНОМ, ДИХЛОРДИФЕНИЛТРИХЛОРЭТАНОМ, ДИХЛОРДИФЕНИЛДИХЛОРЭТАНОМ, ТРИАЛЛАТОМ И ЭФИРАМИ ФТАЛИЕВОЙ КИСЛОТЫ (ДИБУТИЛФТАЛАТОМ, ДИОКТИЛФТАЛАТОМ)

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой новое использование бактериального штамма, способного разлагать устойчивые токсичные хлорорганические соединения - гексахлорбензол, линдан, дихлордифенилтрихлорэтан, дихлордифенилдихлорэтан, триаллат и эфиры фталиевой кислоты (дибутилфталат, диоктилфталат).

Известны устойчивые токсичные хлорорганические соединения, например, такие как гексахлорбензол, гексахлорциклогексан (линдан), дихлордифенилтрихлорэтан (ДДТ), дихлордифенилдихлорэтан (ДДД), S-(2,3,3-трихлораллил)-N,N-диизопропилтиокарбамат (гербицид триаллат), эфиры фталиевой кислоты (дибутилфталат, диоктилфталат). При производстве данных веществ на территориях были загрязнены почвы, нуждающиеся в очистке.

Известен способ детоксикации хлорорганических соединений путем их дегалогенирования с помощью обработки химической композицией (см., например, описание изобретения к патенту РФ 2437714, МПК B01J 23/75, B01J 31/22, A62D 3/30, A62D 3/00, С07В 49/00, дата публикации 10.09.2011). Данный способ нецелесообразно использовать для очистки почвы из-за трудоемкости, необходимости больших экономических затрат и сильного негативного воздействия на почву, из-за использования реактивов композиции.

Недостатком данного способа является также неполное разрушение токсиканта.

Известны штаммы микроорганизмов Pseudomonas putida 9 и Stenotrophomonas maltophilia IMB В-7288, способные к деградации линдана (см., например, Ямборго Н.А., Пиндрус А.А. Токсическое и мутагенное действие гексахлорциклогексана и продуктов их микробной деструкции на микробный ценоз почвы // Мiкробiологiчний журнал, 2011, т. 73, №6, с. 50-57). Для очистки среды от дихлордифенилтрихлорэтана вместе с полихлорфенолами, бензопиреном, диоксином предлагается в качестве деструктора микромицет Phanerochate chrysosporium (см., например, описание изобретения к патенту US 4891320, МПК A62D 3/00; A62D 3/02; В09С 1/10; (IPC1-7): C02F 3/02; C02F 3/34; C12N 1/38; C12R 1/645, дата публикации 02.01.1990). Известен штамм Rhodococcus sp., кометаболизирующий триаллат при росте на среде с дрожжевым экстрактом, питательным бульоном, глицерином или глюкозой (см., например, Behki R.M. Di-allate degradation by an EPTC-degrading Rhodococcus, and in EPTC-treated soil // Soil Biology and Biochemistry. 1991. V. 23. №8. P. 789-793). Известен штамм-деструктор Rhodococcus erythropolis 40Ф, разрушающий эфиры фталиевой кислоты (см., например, Алещенкова З.М., Самсонова А.С., Байкова С.В., Кукулянская Т.А. Деградация пластификаторов Rhodococcus erythropolis 40Ф // Мiкробiологiчний журнал. 1996. Т. 58. №4. С. 34-38).

Недостатком использования данных микроорганизмов является отсутствие деструкции у каждого штамма смеси: гексахлорбензол, гексахлорциклогексан, дихлордифенилтрихлорэтан (ДДТ), дихлордифенилдихлорэтан (ДДД), триаллат, эфиры фталиевой кислоты (дибутилфталат, диоктилфталат).

Технический результат выражается в повышении эффективности очистки почв, загрязненных гексахлорбензолом, линданом, дихлордифенилтрихлорэтаном, дихлордифенилдихлорэтаном, триаллатом и эфирами фталиевой кислоты (дибутилфталатом, диоктилфталатом).

Предлагается использовать штамм Rhodococcus wratislaviensis ВКМ Ас-2623D в качестве средства для очистки почв, загрязненных гексахлорбензолом, линданом, дихлордифенилтрихлорэтаном, дихлордифенилдихлорэтаном, триаллатом и эфирами фталиевой кислоты (дибутилфталатом, диоктилфталатом).

Предлагаемый штамм выделен из техногенно-минеральных образований производства калийно-магниевых солей ОАО «Уралкалий» (г. Березники, Пермский край) методом накопительного культивирования на среду Раймонда состава (г/л): NH₄NO₃ - 2.0, MgSO₄×7H₂O - 0.2, K₂HPO₄ - 2,0, Na₂HPO₄ - 3.0, CaCl₂×6H₂O - 0.01, Na₂CO₃ - 0.1, с добавлением орто-фталиевой кислоты - 1 г/л [6]. Полученный штамм бактерий депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН под номером ВКМ Ас-2623D.

Характеристика предлагаемого штамма

Аэроб. Хемоорганотроф. В состав клеточной стенки входят миколовые кислоты. Клетки грамположительные, неподвижные, не образуют спор, каталазоположительные. При развитии бактериальная культура характеризуется жизненным циклом кокк-палочка-кокк. Штамм растет при температуре 10-45°С с оптимумом роста 28°С.

На богатой агаризованной среде Раймонда, содержащей (г/л): триптон - 5, дрожжевой экстракт - 2.5, NaCl - 10, агар - 1 [6], образует непрозрачные округлые, матовые, светло-розовые колонии. Штамм способен к росту в диапазоне концентрации NaCl от 0 до 10%. При росте на минеральной среде Раймонда не нуждается в дополнительных факторах роста. Использует в качестве источника углерода нафталин, бифенил, бензол, толуол, фенол, орто-фталиевую кислоту, бензойную кислоту (см. Егорова Д.О., Корсакова Е.С., Демаков В.А., Плотникова Е.Г. Деструкция ароматических углеводородов штаммом Rhodococcus wratislaviensis КТ112-7, выделенным из отходов соледобывающего предприятия // Прикладная биохимия и микробиология. 2013. Т. 49. №3. С. 267-278).

По нуклеотидным последовательностям гена 16S рРНК наиболее близок к штамму Rhodococcus wratislaviensis NCIMB 13082^T. На основании морфо-физиологических и молекулярно-генетических признаков штамм идентифицирован как Rhodococcus wratislaviensis.

Преимуществом данного изобретения является очистка почв, загрязненных гексахлорбензолом, линданом, дихлордифенилтрихлорэтаном, дихлордифенилдихлорэтаном, триаллатом и эфирами фталиевой кислоты (дибутилфталатом, диоктилфталатом) и отсутствие сильного негативного воздействия на окружающую среду.

Бактериальный штамм Rhodococcus wratislaviensis ВКМ Ac-2623D депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН 07.05.2013 и предложен для очистки почвы от гексахлорбензола, линдана, дихлордифенилтрихлорэтана (ДДТ), дихлордифенилдихлорэтана (ДДД), триаллата и эфиров фталиевой кислоты (дибутилфталата, диоктилфталата) впервые, в связи с чем можно сделать вывод о соответствии предлагаемого решения критериям изобретения «новизна» и «изобретательский уровень».

Пример 1.

В почву, содержащую гексахлорбензол, линдан, дихлордифенилтрихлорэтан (ДДТ), дихлордифенилдихлорэтан (ДДД) и триаллат и эфиры фталиевой кислоты (дибутилфталат, диоктилфталат), отобранную с промышленной площадки бывшего Открытого Акционерного Общества «Средне-Волжский завод химикатов» (г. Чапаевск, Самарская обл., РФ), вносили бактерии Rhodococcus wratislaviensis ВКМ Ac-2623D из расчета 10⁶ и 10⁷ клеток на грамм почвы. Бактерии выращивали на среде Раймонда состава (г/л): NH₄NO₃ - 2,0, MgSO₄×7H₂O - 0.2, K₂HPO₄ - 2.0, Na₂HPO₄ - 3.0, CaCl₂×6H₂O - 0.01, Na₂CO₃ - 0.1, бифенил - 1.0. Через 3 месяца оценивали содержание загрязнителей в почве с использованием хромато-масс-спектрометра Agilent 6890N (Agilent Technology, США).

В варианте с обработкой загрязненной почвы бактериями в концентрации 10⁶ кл/г содержание гексахлорбензола снизилось в сравнении с почвой без внесения бактерий в 1.6 раза, линдана - в 2.0 раза, дихлордифенилтрихлорэтана (ДДТ) и дихлордифенилдихлорэтана (ДДД) - в 1.9 раза, триаллата в 1.5 раза, эфиров фталиевой кислоты - в 2.0 раза (таблица). В варианте с внесением 10⁷ кл/г почвы убыль по сравнению с не обработанной почвой данных загрязнителей (гексахлорбензола, линдана, дихлордифенилтрихлорэтана (ДДТ) и дихлордифенилдихлорэтана (ДДД), триаллата, эфиров фталиевой кислоты (дибутилфталата, диоктилфталата)) составила 1.4, 3.3, 1.5, 3.0 и 2.2 раза соответственно.

Таким образом, на основе данных модельного эксперимента выявлено положительное воздействие обработки бактериями штамма Rhodococcus wratislaviensis ВКМ Ac-2623D в дозах 10⁶-10⁷ кл/г на очистку почв, загрязненных гексахлорбензолом, линданом, дихлордифенилтрихлорэтаном, дихлордифенилдихлорэтаном, триаллатом и эфирами фталиевой кислоты (дибутилфталатом, диоктилфталатом).