Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ АНТИЭСТРОГЕННОЙ ТЕРАПИИ ТАМОКСИФЕНОМ У БОЛЬНЫХ С ЛЮМИНАЛЬНЫМ ТИПОМ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, и касается способа прогнозирования эффективности антиэстрогенной терапии при раке молочной железы.

Опухоли молочной железы, экспрессирующие рецепторы эстрогенов альфа (ERα) и/или прогестерона (PR), относятся к люминальным и составляют 70-80% всех случаев [Perou C.M. Molecular portraits of human breast tumours / C.M. Perou, T. Sorlie, M.B. Eisen, et al. // Nature. - 2000. - Vol.406 (6797). - P.747-752]. Основным компонентом адъювантного лечения люминального рака молочной железы является антиэстрогенная терапия, базисным препаратом для проведения которой остается тамоксифен [Duffy S. Retrospective Analysis of Time to Recurrence in the ATAC Trial According to Hormone Receptor Status: An Hypothesis-Generating Study / S. Duffy, T.L. Jackson, M. Lansdown, et al. // Human Reproduction. - 2006. - Vol.21, №.2. - P.545-553; Eric P. Winer Endocrine Therapy For Breast Cancer: Looking Into The Future // 34th Annual San Antonio Breast Cancer Symposium, December 7, 2011].

Наиболее ранние способы прогнозирования эффективности терапии тамоксифеном сводились к определению самого факта наличия экспрессии рецепторов эстрогенов альфа в ткани опухоли. Положительная реакция рассматривалась как благоприятный прогностический критерий эффективности лечения [Early Breast Cancer Trialists' Colaborative Group. Tamoxifen for early breast cancer: an overview of the randomized trials // Lancet. - 1998. - Vol.351. - P.1451-1467; Fisher B. Influence of tumor estrogen and progesterone receptor levels on the response to tamoxifen and chemotherapy in primary breast cancer / B. Fisher, C. Redmond, A. Brown, et al. // Journal of Clinical Oncology. - 1983. - Vol.1, №4. - P.227-241]. В настоящий момент в качестве прогностических факторов рассматриваются степень экспрессии по данным иммуногистохимического исследования (процент опухолевых клеток, имеющих рецепторы) и интенсивность их окрашивания. Установлено, что высокие значения данных показателей ассоциированы с лучшей эффективностью проводимого лечения [Burstein H.J. American society of clinical oncology clinical practice guideline: update on adjuvant endocrine therapy for women with hormone receptor-positive breast cancer / H.J. Burstein, A.A. Prestrud, J. Seidenfeld, et al. // Journal of Clinical Oncology. - 2010. - Vol.28 (23). - P.3784-3796].

В 2006 г. Вторушиным С.В. с соавт. показана прогностическая значимость особенностей распределения рецепторов эстрогенов в отношении опухолевой прогрессии. Было показано, что гетерогенное распределение рецепторов оказалось связанным с высокой вероятностью лимфогенного и гематогенного метастазирования. Однако в этом исследовании не изучалась роль особенностей распределения рецепторов в предсказании эффективности проводимой антиэстрогенной терапии тамоксифеном [Вторушин С.В. Сопряженность лимфогенного метастазирования и гистологического строения инфильтративного компонента протокового рака молочной железы / С.В. Вторушин, М.В. Завьялова, В.М. Перельмутер и др. // Сибирский онкологический журнал. - 2006. - №1 (17). - С.32-35].

Тем не менее, при использовании рассмотренных способов прогнозирования эффективности лечения, согласно ряду исследований, от 10 до 20% пациенток люминальным раком молочной железы на фоне адъювантной гормонотерапии тамоксифеном прогрессируют в первые 12 мес. лечения, а в последующие годы эта цифра увеличивается до 20-40% [Massarweh S. Tamoxifen resistance in breast tumors is driven by growth factor receptor signaling with repression of classic estrogen receptor genomic function / S. Massarweh, C.K. Osborne, C.J. Creighton, et al. // Cancer Research. - 2008. - Vol.68 (3). - P. 826-833; Ring A. Mechanisms of tamoxifen resistance / A. Ring, M. Dowsett // Endocrine-Related Cancer. - 2004. - Vol.11. - P.643-658]. Это обусловливает постоянный поиск возможных причин неэффективности терапии.

На сегодняшний день изучение причин неэффективности антиэстрогенной терапии тамоксифеном развивается по 2 основным направлениям. В качестве первого рассматривают реализацию различных путей активации рецепторов эстрогенов. Классический геномный путь активации реализуется посредством взаимодействия эстрадиола с активационным центром AF-2 рецептора. На эту же мишень воздействует и тамоксифен, являясь конкурентным антагонистом эстрадиола [Anghel A. Estrogen receptor alpha polymorphisms: correlation with clinicopathological parameters in breast cancer / A. Anghel, M. Raica, D. Narita, et al. // Neoplasma. - 2010. - Vol.57. - P.4]. В то же время показано, что реализация неклассического геномного пути активации рецепторов эстрогенов альфа (ERα) происходит под воздействием ряда ростовых факторов (IGF-1, EGFR, Her-2/neu), способных воздействовать на центр AF-1 ERα, который не блокируется тамоксифеном. Тем самым обусловливается неэффективность проводимой гормонотерапии [Mascrez В. Differential contributions of AF-1 and AF-2 activities to the developmental functions of RXRa / B. Mascrez, M. Mark, W. Krezel, et al. // Development. - 2001. - №128. - P.2049-2062].

В качестве второй возможной причины резистентности к терапии рассматривается наличие изменений ультраструктуры самих рецепторов эстрогенов в результате однонуклеотидных полиморфизмов. Установлены области транскрипции гена рецепторов эстрогенов, ответственные за строение активационных центров AF-1 и AF-2 [Anghel A. Estrogen receptor alpha polymorphisms: correlation with clinicopathological parameters in breast cancer / A. Anghel, M. Raica, D. Narita, et al. // Neoplasma. - 2010. - Vol.57. - P.4]. Так, наличие полиморфизмов в первом экзоне гена ERα rs2077647 (С/Т), который локализуется в А/В домене, ассоциировано со структурными изменениями функциональной области транскрипционной активации центра AF-1. Полиморфизм же rs2228480 (G/A) (594Thr) в 8 экзоне, располагающемся в E/F регионе, соответствует лиганд-зависимой функциональной области транскрипции центра AF-2. Структурные изменения активационных центров могут приводить к нарушению функции самих рецепторов. В частности, предполагается, что мутации в 8 экзоне гена ERα делают невозможным связывание тамоксифена с центром AF-2, тем самым обусловливая нецелесообразность проводимой терапии [Mascrez В. Differential contributions of AF-1 and AF-2 activities to the developmental functions of RXRa / B. Mascrez, M. Mark, W. Krezel, et al. // Development. - 2001. - №128. - P.2049-2062].

Однако эти исследования единичны и не имеют системного характера. Кроме того, исследований, направленных на изучение взаимосвязи ультраструктуры рецепторов с эффективностью антиэстрогенной терапии, не проводилось.

Наиболее близким и точным используемым в настоящий момент методом прогнозирования эффективности антиэстрогенной терапии тамоксифеном является способ, предложенный в 2001 г. Dowsett с соавт. В данном способе эффективность прогнозируется исходя из степени (процента опухолевых клеток, имеющих экспрессию рецепторов) и интенсивности экспрессии рецепторов эстрогена альфа, а также выраженности экспрессии рецепторов к Her-2/neu в ткани опухоли. При этом высокие показатели степени и интенсивности экспрессии ERα и низкий уровень экспрессии Her-2/neu рассматриваются как благоприятный прогностический фактор эффективности терапии тамоксифеном [Dowsett M. Her-2 amplification impedes the antiproliferative effects of hormone therapy in estrogen receptor-positive primary breast cancer / M. Dowsett, C. Harper-Wynne, I. Boeddinghaus, et al. // Cancer Research. - 2001. - №61. - P.8452-8458]. Однако, в рассматриваемом способе не учитываются критерии распределения рецепторов эстрогенов альфа и особенности их молекулярно-генетического строения, что снижало точность прогнозирования и информативность.

Новая техническая задача - повышение точности и информативности способа прогнозирования.

Для решения поставленной задачи в способе прогнозирования эффективности антиэстрогенной терапии тамоксифеном у пациенток с люминальным типом рака молочной железы проводят иммуногистохимическое исследование ткани опухоли, причем определяют характер распределения экспрессии рецепторов эстрогенов альфа в ткани опухоли методом иммуногистохимии и оценивают наличие полиморфизма rs2228480 G/A в 8 экзоне гена ERα методом ПЦР в реальном времени, также оценивают состояние регионарных лимфатических узлов и степень злокачественности опухоли.

Эффективность антиэстрогенной терапии тамоксифеном рассчитывают по формуле

Y=(2,1-3,2X₁+0,69Х₂-0,91Х₃-0,63Х₄),

где Y - значение уравнения регрессии;

(2,1) - значение коэффициента регрессии свободного члена;

X₁ - оценка состояния регионарных лимфатических узлов (N)(0 - нет пораженных л/у; 1 - от 1 до 3 пораженных л/у; 2 - от 4 до 10 л/у; 3 - свыше 10 метастатически измененных л/у, (-3,2) - значение коэффициента регрессии этого признака;

Х₂ - степень злокачественности опухоли (1 - низкая степень, 2 - умеренная степень, 3 - высокая степень злокачественности), (0,69) - значение коэффициента регрессии этого признака;

Х₃ - характер распределения клеток, экспрессирующих рецепторы к эстрогенам в опухоли (1 - гомогенный, 2 - гетерогенный), (-0,91) - значение коэффициента регрессии этого признака;

Х₄ - наличие мутации в 8 экзоне. гена рецепторов эстрогенов альфа (1 - отсутствие мутации (гомозигота, генотип GG), 2 - мутация по одному аллелю (гетерозигота, генотип GA), 3 - мутация обоих аллелей (генотип АА)), (-0,63) - значение коэффициента регрессии этого признака.

Вероятность прогрессирования заболевания определяется по формуле

P=e^Y/(1+e^Y),

где Р значение вероятности развития признака,

е - математическая константа, равная 2,72.

и при Р>0,5 определяют высокую эффективность, а при Р<0,5 прогнозируют низкую эффективность проводимой терапии с большой вероятностью прогрессирования.

Способ осуществляют следующим образом. Исследуют послеоперационные образцы опухолевой ткани. Диагноз рака молочной железы устанавливают согласно «Гистологической классификации опухолей молочной железы» (ВОЗ, 2002). Методом иммуногистохимии изучают экспрессию к рецепторам эстрогенов альфа. Оценку экспрессии к рецепторам эстрогенов альфа проводят стандартным количественным методом гисто-счета (Histo-Score). При этом определяют степень экспрессии (процент позитивных клеток) и ее интенсивность (показатель экспрессии в баллах). Наряду со стандартным определением экспрессии рецепторов половых гормонов, дополнительно, по известному способу [Способ прогнозирования течения заболевания раком молочной железы / Патент №2300111 Российская Федерация, МПК51 G1N 33/74, G1N 33/50 // Вторушин С.В., Перельмутер В.М., Крицкая Н.Г., Глущенко С.А., Савенкова О.В., Слонимская Е.М., Завьялова М.В. - №2005118627/15; заявл. 15.06.05; опубл. 27.05.07. - Бюл. №15], оценивают характер распределения рецепторов в опухолевых элементах рака молочной железы. Методом ПЦР в реальном времени определяют наличие полиморфизма rs2228480 G/A в 8 экзоне гена ERα. Эффективность антиэстрогенной терапии тамоксифеном рассчитывают по формуле:

Y=(2,1-3,2X₁+0,69Х₂-0,91Х₃-0,63Х₄),

где Y - значение уравнения регрессии;

(2,1) - значение коэффициента регрессии свободного члена;

X₁ - оценка состояния регионарных лимфатических узлов (N) (0 - нет пораженных л/у; 1 - от 1 до 3 пораженных л/у; 2 - от 4 до 10 л/у; 3 - свыше 10 метастатически измененных л/у, (-3,2) - значение коэффициента регрессии этого признака;

Х₂ - степень злокачественности опухоли (1 - низкая степень, 2 - умеренная степень, 3 - высокая степень злокачественности), (0,69) - значение коэффициента регрессии этого признака;

Х₃ - характер распределения клеток, экспрессирующих рецепторы к эстрогенам в опухоли (1 - гомогенный, 2 - гетерогенный), (-0,91) - значение коэффициента регрессии этого признака;

Х₄ - наличие мутации в 8 экзоне гена рецепторов эстрогенов альфа (1 - отсутствие мутации (гомозигота, генотип GG), 2 - мутация по одному аллелю (гетерозигота, генотип GA), 3 - мутация обоих аллелей (генотип АА)), (-0,63) - значение коэффициента регрессии этого признака.

Вероятность прогрессирования заболевания определяется по формуле

Р=e^Y/(1+e^Y),

где Р значение вероятности развития признака,

е - математическая константа, равная 2,72,

и при Р>0,5 определяют высокую эффективность, а при Р<0,5 прогнозируют низкую эффективность проводимой терапии с большой вероятностью прогрессирования.

Сущность предлагаемого способа иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Больная А., 49 лет, с сохраненной менструальной функцией, с уницентрическим инвазивным протоковым раком молочной железы стадии T₂N₁M₀ (1). Прооперирована в объеме радикальной мастэктомии. При гистологической оценке ткани первичной опухоли определялась 2 степень злокачественности (2). При иммуногистохимическом исследовании выявлена гетерогенная экспрессия рецепторов эстрогенов (2). С помощью ПЦР в реальном времени установлено строение 8 экзона - гетерозигота (GA) (2). Предполагаемую эффективность антиэстрогенной терапии тамоксифеном рассчитывали по формуле: Y=2,1-3,2X₁+0,69Х₂-0,91Х₃-0,63Х₄=2,1-3,2×1+0,69×2-0,91×2-0,63×2=-2,8. Значение вероятности эффективности гормонотерапии тамоксифеном определялось по формуле Р=e^Y/(1+e^Y)=2,72^-2,8/(1+2,72^-2,8)=0,05. Вероятность эффективности терапии составила 5%. При динамическом наблюдении за больной спустя 33 мес. после операции установлено прогрессирование в виде метастатического поражения костей и печени.

Пример 2. Больная О., 47 лет, с сохраненной менструальной функцией, с уницентрическим инвазивным протоковым раком молочной железы, стадии T₂N₀M₀ (0). Прооперирована в объеме радикальной мастэктомии. При гистологической оценке ткани первичной опухоли определялась 3 степень злокачественности (2). При иммуногистохимическом исследовании выявлена гетерогенная экспрессия рецепторов эстрогенов (2). С помощью ПЦР в реальном времени установлено строение 8 экзона - "дикий" генотип, гомозигота (GG) (1). Предполагаемая эффективность антиэстрогенной терапии тамоксифеном рассчитывалась по формуле Y=2,1-3,2X₁+0,69X₂-0,91Х₃-0,63Х₄=2,1-3,2×0+0,69×2-0,91×2-0,63×1=1,03. Значение вероятности эффективности гормонотерапии тамоксифеном определялась по формуле Р=e^Y/(1+e^Y)=2,72^1,03/(1+2,72^1,03)=0,74. Вероятность эффективности терапии составила 74%. При динамическом наблюдении за больной в течение 58 мес. прогрессирования не выявлено. Предлагаемый способ основан на анализе данных клинических наблюдений. В исследование были включены 67 пациенток с люминальным типом рака молочной железы со стадией Ti_1-2N_0-1M₀. Средний возраст пациенток составил 54,35±0,87 лет. 35 больных находились в состоянии менопаузы, у 32 менструальный цикл был сохранен. У всех больных опухоли были представлены инвазивной протоковой карциномой. Пациентки получили комбинированное лечение в виде оперативного вмешательства в объеме радикальной мастэктомии или радикальной резекции. По показаниям проводилась послеоперационная лучевая терапия и/или адъювантная химиотерапия (по схеме РАС). Обязательным компонентом адъювантной терапии явился прием тамоксифена в течение 5 лет в стандартной дозировке (20 мг / сутки). Сроки наблюдения составили от 24 до 102 мес.

Отдаленные результаты лечения оценивались по факту наличия прогрессии в виде появления отдаленных метастазов. В зависимости от этого были сформированы 2 группы пациентов: без признаков прогрессирования (37 пациенток) и с прогрессированием заболевания (25 пациенток). Группы были сопоставимы по основным клинико-морфологическим параметрам и объему проведенного лечения.

Исследовались образцы опухолевой ткани. Подготовка материала для патоморфологического исследования осуществлялась по стандартной методике. Диагноз рака молочной железы устанавливался согласно «Гистологической классификации опухолей молочной железы» (ВОЗ, 2002). Методом иммуногистохимии изучали экспрессию к рецепторам эстрогенов альфа, при исследовании применяли антитела фирмы «Dako» (клон 1D5, RTU, мышиные). Оценка экспрессии к рецепторам эстрогенов альфа проводилась количественным методом гистосчета (Histo-Score). При этом определялась степень экспрессии (процент позитивных клеток) и ее интенсивность (показатель экспрессии в баллах). Наряду со стандартным определением экспрессии рецепторов половых гормонов, дополнительно, по известному способу [Способ прогнозирования течения заболевания раком молочной железы / Патент №2300111 Российская Федерация, МПК51 G1N 33/74, G1N 33/50 // Вторушин С.В., Перельмутер В.М., Крицкая Н.Г., Глушенко С.А., Савенкова О.В., Слонимская Е.М., Завьялова М.В. - №2005118627/15; заявл. 15.06.05; опубл. 27.05.07. - Бюл. №15], оценивался характер распределения рецепторов в опухолевых элементах рака молочной железы. Если в опухоли отмечалось равномерное распределение рецепторов, независимо от интенсивности окрашивания, экспрессию оценивали как гомогенную. В тех случаях, когда наблюдались участки с позитивной и негативной экспрессией, а также с различной степенью выраженности - экспрессию рассматривали как гетерогенную.

С целью оценки ультраструктуры ERα проводилось выделение ДНК из опухолевых образцов путем депарафинизации срезов с помощью наборов QIaamp DNA FFPE tissue kit (Qiagen). Качественная и количественная оценка ДНК проведена на спектрофотометре NanoDrop-1000 («NanoDrop», США). Изучение полиморфных вариантов в 8 экзоне гена рецептора выполнено с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Последовательность праймеров и проб подбирали при помощи программы OligoAnalysisVector NTI с использованием генетического банка данных (www.ncbi.nlm.nih.gov). Реакционная смесь для ПЦР объемом 15 мкл включала 100 нг геномной ДНК; 0,5-1,5 мкл специфической пары праймеров и проб с концентрацией 1 о.е./мл; 200 мкМ каждого дезоксинуклеотидтрифосфата; 1,2-2,0 мкл буфера (60 мMTris-HCl (pH 8,5 при 25°С), 1,5 мМ MgCl2; 25 мМКСl; 10 мМ 2-меркаптоэтанол; 0.1% Тритон Х-100) и 0,5-1,0 ед. Taq ДНК-полимеразы («Медиген», Новосибирск). Программа амплификации включала предварительную денатурацию при 95°С в течение 2 минут, с последующими 40 циклами денатурации при 95°С (10 сек.), отжига при специфической температуре для каждой пары праймеров (30 сек.) на амплификаторе ICycler IQ5 («Bio-Rad», США).

Работа проведена с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан (Указ Президента РФ от 24.12.93 №2288), на основании разрешения локального комитета по биомедицинской этике ФГБУ «НИИ онкологии» СО РАМН. Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы "STATISTICA 7.0".

На первом этапе исследования были проанализированы стандартные показатели рецепторного статуса. Оценивалась связь степени и интенсивности экспрессии рецепторов эстрогенов альфа в ткани опухоли с исходом заболевания (табл.1 прилож.).

Установлено, что в группе пациентов без признаков прогрессирования заболевания степень и интенсивность экспрессии Erα была несколько выше. Однако, достоверно значимых различий выявить не удалось.

При изучении интенсивности экспрессии рецепторов в зависимости от характера их распределения оказалось, что при гомогенном их распределении средняя интенсивность экспрессии составила 208±12,68, тогда как при гетерогенном она была существенно ниже - 99,74±9,4. Различия носили статистически значимый характер (р=0,000000).

В связи с полученными результатами была оценена сопряженность характера распределения рецепторов эстрогенов альфа в ткани опухоли с отдаленными результатами лечения (табл.2). Отмечено, что в группе пациенток, у которых было диагностировано прогрессирование заболевания, гетерогенное распределение наблюдалось у 86,2% больных, в то время как при благоприятном исходе данный показатель составил 60,5%. Выявленные различия были статистически значима (р=0,042; χ²=4,15). Таким образом, можно полагать, что такой морфологический параметр, как характер распределения рецепторов эстрогенов альфа определенным образом сопряжен с эффективностью гормонотерапии тамоксифеном.

У 48 пациентов в образцах опухолевой ткани методом ПЦР в реальном времени оценивалось наличие мутации в 8 экзоне гена Erα. Она была выявлена в 20,6% случаев (20 аллелей оказались мутантными). При этом отмечена тенденция к увеличению частоты встречаемости мутации в группе пациенток с прогрессированием заболевания (р=0,12; χ²=2,43). Интересно отметить, что у пациенток, в опухолевых клетках которых определялась гомогенная окраска рецепторов, случаев мутации не отмечено, в то время как при гетерогенном их распределении мутации 8 экзона отмечены в 28% наблюдений (р=0,004; χ²=8,45).

На основании полученных результатов о значимой связи характера распределения рецепторов в ткани опухоли и наличия полиморфизма rs2228480 G/A в 8 экзоне гена Erα была составлена математическая модель для определения ожидаемой эффективности антиэстрогенной терапии тамоксифеном. В нее помимо изучаемых параметров вошли такие высоко значимые критерии, как состояние регионарных лимфатических узлов и степень злокачественности опухоли. Составлена формула: Y=(2,1-3,2X₁+0,69Х₂-0,91Х₃-0,63Х₄),

где Y - значение уравнения регрессии;

(2,1) - значение коэффициента регрессии свободного члена;

X₁ - оценка состояния регионарных лимфатических узлов (N)(0 - нет пораженных л/у; 1 - от 1 до 3 пораженных л/у; 2 - от 4 до 10 л/у; 3 - свыше 10 метастатически измененных л/у, (-3,2) - значение коэффициента регрессии этого признака;

Х₂ - степень злокачественности опухоли (1 - низкая степень, 2 - умеренная степень, 3 - высокая степень злокачественности), (0,69) - значение коэффициента регрессии этого признака;

Х₃ - характер распределения клеток, экспрессирующих рецепторы к эстрогенам в опухоли (1 - гомогенный, 2 - гетерогенный), (-0,91) - значение коэффициента регрессии этого признака;

Х₄ - наличие мутации в 8 экзоне гена рецепторов эстрогенов альфа (1 - отсутствие мутации (гомозигота, генотип GG), 2 - мутация по одному аллелю (гетерозигота, генотип GA), 3 - мутация обоих аллелей (генотип АА)), (-0,63) - значение коэффициента регрессии этого признака.

Значение вероятности прогрессирования заболевания определяется по формуле Р=e^Y/(1+e^Y), где Р (значение вероятности развития признака), е - математическая константа, равная 2,72.

И при Р>0,5 определяют высокую эффективность, а при Р<0,5 прогнозируют низкую эффективность проводимой терапии с большой вероятностью прогрессирования.

Чувствительность предложенной модели составила 89%, специфичность - 65%.

В результате проведенного исследования показано, что такие показатели, как гетерогенное распределение Era и наличие полиморфизма в 8 экзоне гена Erα в ткани опухоли, можно рассматривать как дополнительные предсказательные критерии эффективности антиэстрогенной терапии тамоксифеном у пациенток с люминальным типом рака молочной железы. Разработана математическая модель, позволяющая с высокой долей вероятности прогнозировать эффективность лечения и тем самым индивидуализировать подход к выбору вида эндокринотерапии у данной группы пациентов.

Таблица 1 Взаимосвязь интенсивности экспрессии ERα с исходом заболевания

Таблица 2 Взаимосвязь характера распределения ERα с частотой отдаленного метастазирования