Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СООТВЕТСТВИЯ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ ПИКОВ ОДНОМУ И ТОМУ ЖЕ КОМПОНЕНТУ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Изобретение относится к газохроматографическим методам анализа и может быть использовано для идентификации летучих компонентов различных лекарственных растений и фитопрепаратов в медицине, фармакологии, здравоохранении, пищевой, парфюмерной и других отраслях промышленности.

Известны способы и устройства для определения соответствия хроматографических пиков одному и тому же веществу на колонках с последовательно изменяющейся полярностью и многоступенчатый метод с переключением колонок (см. Вигдергауз М.С., Семенченко Л.В., Езрец В.А, Богословский Ю.Н. Качественный газохроматографический анализ. М.: Наука, 1978. С. 162-185).

Недостатками известных способов и устройств для определения соответствия хроматографических пиков одному и тому же веществу на основе независимых хроматограмм смеси, отвечающих нескольким колонкам, являются большая трудоемкость и сложность проведения эксперимента, а также отсутствие серийной хроматографической аппаратуры для получения многоэлементных спектров сорбатов.

Известны также способы определения соответствия пиков на хроматограммах с использованием дополнительной информации из одного цикла анализа от двух хроматографических детекторов: пламенно-ионизационного (ПИД) и детектора по теплопроводности (ДТП) (см. Арутюнов Ю.И., Кудряшов С.Ю., Онучак Л.А., Платонов И.А. Газохроматографический анализ смесей, содержащих неизвестные компоненты. Самара: Вестник СамГУ. Естественнонаучная серия. Изд-во «Самарский университет», 2005. №5 (39). С. 137-162).

Способ заключается в получении результатов анализа исследуемой пробы на каждой колонке с двумя детекторами на выходе в виде:

1. Расчетных концентраций

2. Относительного коэффициента чувствительности двух детекторов

где , , , - соответственно площади хроматографических пиков i-го вещества и стандарта на хроматограммах ДТП и ПИД;

N - число пиков на хроматограммах ДТП и ПИД.

В случае когда в качестве стандарта используется бензол, множитель принимается равным единице.

Равенство , и , измеренных на двух колонках, свидетельствует о соответствии пиков на хроматограммах этих колонок одному и тому же веществу.

Однако в известном способе используется детектор ДТП, который из-за большой инерционности не может работать с высокоэффективными капиллярными колонками, широко применяемыми для анализа многокомпонентных сложных смесей.

Наиболее близким к заявленному изобретению по совокупности существенных признаков является хромато-распределительный метод с использованием коэффициентов распределения компонентов пробы в системе ограниченно смешиваемых растворителей «гексан-ацетонитрил», определяемых на капиллярной колонке с пламенно-ионизационным детектором при линейном программировании температуры колонки (см. Арутюнов Ю.И., Онучак Л.А., Платонов, Никитченко Н.В. Применение хромато-распределительного метода для определения молекулярной массы и температуры кипения неизвестных компонентов смеси. // Сорбционные и хроматографические процессы, 2011. Т. 11, №4. С. 502-510).

Коэффициенты распределения K_Ci летучих компонентов пробы определяются из хроматограмм гексанового и ацетонитрильного экстрактов на каждой колонке по уравнению

где - константа распределения анализируемых веществ на неполярной (1) и полярной (2) фазах;

и - концентрации i-го летучего компонента в гексановом и ацетонитрильном слое соответственно;

N - число пиков на хроматограммах.

Равенство K_Ci наряду с равенством по уравнению (1), полученные на двух колонках с неполярной и полярной фазами, свидетельствует, что хроматографические пики принадлежат одному и тому же веществу.

Недостатками известного способа являются уменьшение общего количества определяемых компонентов пробы за счет наложения больших пиков гексана и ацетонитрила на хроматографические пики исследуемых летучих компонентов и повышенная погрешность при определении K_Ci по уравнению (3) для малых количеств i-го компонента в пробе.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является аппаратно-программный комплекс на базе хроматографа «Хроматэк-Кристалл 5000», содержащий источник газа-носителя, дозатор равновесного пара, устройство для твердофазной экстракции и термодесорбции, два аналитических блока с неполярной и полярной капиллярными колонками с делителями расхода на входе и пламенно-ионизационными детекторами на выходе, генератор водорода и компрессор (см. Сертификат об утверждении средств измерений RU. С. 39. 004A №6481).

Недостатками известного устройства на базе хроматографа «Хроматэк-Кристалл 5000» являются:

1. Невозможность проведения анализа равновесной паровой фазы исходной пробы одновременно на двух параллельно включенных капиллярных колонках с неполярной и полярной неподвижными фазами.

2. Отсутствие возможности анализа паровой фазы исходной пробы с измененными концентрациями составляющих летучих компонентов.

Задачей изобретения является увеличение количества определяемых летучих компонентов пробы и повышение сходимости определения концентраций летучих компонентов пробы.

Эта задача решается за счет того, что в способе определения соответствия хроматографических пиков одному и тому же летучему компоненту пробы, при котором исследуемую пробу анализируют не менее трех раз одновременно на хроматографических колонках с полярной и неполярной неподвижными фазами: первый анализ - исходная проба, второй и третий анализы - исходная проба с измененными концентрациями, изменение концентрации составляющих летучих компонентов исходной пробы проводят с использованием твердофазной экстракции путем анализа как газовой фазы при низкой температуре, так и конденсированной фазы при более высокой температуре.

Эта задача решается также за счет того, что в устройстве для определения соответствия хроматографических пиков одному и тому же летучему компоненту пробы, содержащем источник газа-носителя, дозатор равновесного пара, устройство для твердофазной экстракции и термодесорбции, два аналитических блока с неполярной и полярной капиллярными колонками с пламенно-ионизационными детекторами на выходе, делитель потока, генератор водорода и компрессор, устройство для твердофазной экстракции и термодесорбции выполняют в виде сменного термостатируемого патрона с зернистым сорбентом, который включают через дополнительные переключатели потока вместо дозирующей петли дозатора равновесного пара.

Соответствие пиков на хроматограммах неполярной и полярной колонок одному и тому же летучему компоненту пробы определяется в предлагаемом способе по равенству концентрации ; и ; по уравнению (1), детектор ПИД. Верхний индекс (1) для неполярной колонки, верхний индекс (2) для полярной колонки. Нижний индекс (1) соответствует результатам первого анализа исходной пробы, нижний индекс (2) соответствует анализу газовой фазы после твердофазной экстракции исходной пробы, индекс (3) соответствует анализу конденсированной фазы в результате термодесорбции компонентов исходной пробы.

Вероятность определения соответствия пиков на двух хроматограммах одному летучему компоненту оценивается по равенству С_расч,i и времени удерживания этого компонента t_Ri во всех трех анализах. Вероятность уменьшается, если имеет место равенство С_расч,i и t_Ri только для двух или одного анализов.

При решении поставленной задачи создается технический результат, заключающийся в том, что на хроматограммах полярной и неполярной колонок отсутствуют большие пики растворителей. Это связано с тем, что вместо двух ограниченно смешивающихся жидких растворителей гексан и ацетонитрил в предлагаемом способе изменение концентраций летучих компонентов исходной пробы проводят с использованием твердофазной экстракции путем анализа как газовой фазы при низкой температуре, так и конденсированной фазы при более высокой температуре. В результате чего значительно увеличивается количество определяемых летучих компонентов пробы и сходимость определения концентрации летучих компонентов пробы.

Это позволяет сделать вывод, что заявляемые изобретения связаны между собой единым изобретательским смыслом.

Изобретение поясняется чертежом. На фигуре 1 схематически изображено устройство для определения соответствия хроматографических пиков одному и тому же летучему компоненту пробы, которое содержит источник газа-носителя 1, дозатор равновесного пара 2 с контейнером исходной пробы 3, шестипортовым газовым краном 4, дозирующей петлей 5 с переключателем потока 6 и устройством для твердофазной экстракции и термодесорбции 7 с переключателем 8, делитель потока 9, специальный микротройник 10, капиллярную колонку 11 с неполярной неподвижной фазой, капиллярную колонку 12 с полярной неподвижной фазой, пламенно-ионизационные детекторы 13.

Устройство работает следующим образом: исходную пробу помещают в контейнер 3, выдерживают при определенной температуре, равновесную паровую фазу дозируют с помощью дозирующей петли 5 переключателя 6 шестипортовым краном 4 одновременно в обе хроматографические колонки для проведения первого анализа летучих компонентов исходной пробы.

Для проведения второго анализа изменение концентрации летучих компонентов пробы проводят с помощью твердофазной экстракции и анализа газовой фазы при температуре 40°C в устройстве 7 для твердофазной экстракции и термодесорбции с переключателем 8 и шестипортовым краном 4.

Для проведения третьего независимого анализа проводят твердофазную экстракцию в устройстве для твердофазной экстракции и термодесорбции 7 путем пропускания определенного объема летучих компонентов с помощью переключателя 8 и шестипортового крана 4 определенного объема, после чего кран 8 закрывают и нагревают устройство 7 до T=100°C, после чего включают кран 8 и шестипортовый кран-дозатор дозирует десорбированную конденсированную фазу летучих компонентов в хроматографические колонки для третьего анализа.

Сравнение известного и предлагаемого способов определения соответствия хроматографических пиков одному и тому же компоненту проводили на двух примерах.

Пример 1. В качестве объекта исследования использовали модельную смесь из семи летучих компонентов, принадлежащих к различным классам органических соединений. Для этого в контейнер исходной пробы дозатора равновесного пара заливали по 0,5 см³ ацетона, изопропанола, этилацетата, изобутанола, бензола, циклогексана и гептана. Контейнер с пробой выдерживали 30 минут при температуре 40°C.

Порядок проведения эксперимента

1. Предлагаемый способ

Эксперимент проводили с помощью устройства для определения соответствия хроматографических пиков одному и тому же летучему компоненту пробы, представленного на фигуре 1. Устройство содержит дозатор равновесного пара 2 с контейнером исходной пробы 3 объемом 15 см³, дозирующую петлю 5 объемом 0,5 см³, устройство для твердофазной экстракции и термодесорбции 7, выполненное в виде трубки (7,2 см × 3,0 мм), заполненной зернистым сорбентом (трис-бета-цианоэтокси пропан 15% масс. на динохроме H, фракция 0,315-0,5 мм), делитель потока 9, специальный микротройник 10, капиллярную колонку 11 типа VF-1 фирмы Varian, США (30 м × 0,32 мм × 0,5 мкм) с полидиметилсилоксановой неподвижной фазой, капиллярную колонку 12 типа INNOWAX фирмы Agilent Technologies, США (30 м × 0,32 мм × 0,5 мкм) с полиэтиленгликолевой неподвижной фазой и два пламенно-ионизационных детектора 13.

Режим работы газохроматографического устройства:

газ-носитель - электролитический водород;

расход газа-носителя на выходе колонок 11 и 12 - 1,0 см³/мин;

температура начала анализа - 40°C;

линейное программирование со скоростью 4°C/мин;

конечная температура - 180°C;

время анализа - 40 минут;

температура детекторов - 200°C.

Для проведения первого анализа равновесную паровую фазу (РПФ) из контейнера 3 пропускали с помощью шестипортового крана 4 через дозирующую петлю 5 и открытый переключатель 6. После чего шестипортовый кран переключали во второе положение «анализ», при котором газ-носитель вытеснял пробу из петли 5 в хроматографические колонки для разделения. В делителе потока 9, поток со скоростью 2 см³/мин равномерно распределялся в специальном микротройнике 10 на две колонки 11 и 12, а поток со скоростью 80 см³/мин сбрасывался в линию сброса.

Для проведения второго анализа РПФ из контейнера 3 пропускали с помощью шестипортового крана 4 через устройство для твердофазной экстракции и термодесорбции 7 и открытый переключатель 8 при низкой температуре 40°C. При этом переключатель 6 закрыт. Затем шестипортовый кран переключали в положение «анализ», и газовая фаза после твердофазной экстракции при низкой температуре вытеснялась газом-носителем одновременно на две капиллярные колонки для анализа.

Для проведения третьего анализа устройство для твердофазной экстракции и термодесорбции 7 выдерживали 15 минут при температуре 100°C при закрытом переключателе 8 и закрытом переключателе 6. Затем открывали переключатель 8 и устанавливали шестипортовый кран 4 в положение «анализ», и газ-носитель вытеснял компоненты пробы после термодесорбции в обе капиллярные колонки для анализа.

По результатам газохроматографического анализа определяли

- Индексы удерживания Ван-Ден-Доола и Кратса для исследуемых компонентов пробы на каждой капиллярной колонке

где t_Ri, t_Rz, t_z+1 - время удерживания i-го компонента равновесной паровой фазы и соседних гомологов н-алканов с числом углеродных атомов в молекулах z и z+1 соответственно. Верхний индекс (1) - колонка с неполярной неподвижной фазой; верхний индекс (2) - колонка с полярной неподвижной фазой.

Для определения t_z и t_z+1 дополнительно хроматографировали на обеих колонках равновесную паровую фазу смеси н-алканов от пентана до тетрадекана включительно. Для этого в отдельный контейнер объемом 15 см³ заливали но 0,2 см³ пентана и гексана, по 0,3 см³ гептана и октана, по 0,5 см³ нонана и декана, по 1,0 см³ ундекана и додекана, 1,5 см³ тридекана и 2,0 см³ тетрадекана. Контейнер выдерживали 30 минут при температуре 70°C. Затем устанавливали его вместо контейнера 3 в дозатор равновесного пара 2 и проводили анализ равновесной паровой фазы н-алканов по процедуре первого анализа.

- Расчетные концентрации летучих компонентов равновесной паровой фазы исследуемой пробы на каждой колонке

где A_i - площадь пика i-го компонента;

- сумма площадей пиков всех регистрируемых компонентов;

N - число пиков на хроматограмме.

Нижние индексы (1), (2), (3) отвечают результатам первого, второго и третьего анализов.

- Соответствие хроматографических пиков, полученных на колонках с полярной и неполярной неподвижными фазами, одному и тому же компоненту пробы определяли по равенству расчетных концентраций

;

.

2. Известный способ

Эксперимент проводили на газовом хроматографе «Хроматэк-Кристалл 5000», содержащем дозатор равновесного пара, два аналитических блока с неполярной и полярной капиллярными колонками и пламенно-ионизационными детекторами на выходе. На входе каждой колонки имеются испарители с делителями потока. Капиллярные колонки в известном способе аналогичны описанным в предлагаемом способе.

Режим работы хроматографа:

газ-носитель - электролитический водород;

расход газа-носителя на выходе колонок 11 и 12 - 1,0 см³/мин;

температура начала анализа - 40°C;

линейное программирование со скоростью 4°C/мин;

конечная температура - 180°C;

время анализа - 40 минут;

температура детекторов - 200°C.

Первый анализ РПФ исследуемой пробы проводили аналогично описанному ранее в предлагаемом способе. При этом дозирующая петля 5 объемом 0,5 см³ соединялась шестипортовом кране без переключателя 6.

Для проведения второго и третьего анализов РПФ из контейнера в количестве 20 см³ барботировали через систему из двух ограниченно смешиваемых растворителей: 0,5 см³ гексана и 0,5 см³ ацетонитрила в отдельной емкости. Полученную смесь встряхивали в течение нескольких минут при комнатной температуре. После расслоения из каждого слоя микрошприцом отбирали пробы для газохроматографического анализа. Объем вводимой пробы в испаритель каждой колонки не более 0,5 мкл. Температура испарителя 200°C.

По результатам анализа на двух колонках определяли:

- Индексы удерживания при линейном программировании температуры колонки по уравнению (4) по результатам первого анализа. Для определения индексов удерживания дополнительно хроматографировали смесь н-алканов от пентана до тетрадекана включительно, которую дозировали объемом не более 0,5 мкл в испарители каждой колонки микрошприцом.

- Расчетные концентрации летучих компонентов РПФ исследуемой пробы по уравнению (5) по результатам первого анализа.

- Константы распределения компонентов РПФ в системе ограниченно смешиваемых растворителей «гексан-ацетонитрил» на колонке с неполярной фазой - и полярной фазой - по уравнению (3).

Соответствие хроматографических пиков, полученных на колонках с неполярной и полярной неподвижными фазами, одному и тому же компоненту пробы определяли по равенству констант распределения и по равенству расчетных концентраций .

Пример 2. В качестве объекта исследования использовали воздушно-сухое сырье календулы лекарственной (Calendula officinalis) сорта Кальта, выращенное в Ботаническом саду Самарского госуниверситета (2013 г.). Измельченное сухое сырье календулы помещали в контейнер исходной пробы дозатора равновесного пара в количестве не более 12 см³. Контейнер с пробой выдерживали 40 минут при температуре 100°C.

Порядок проведения эксперимента предлагаемым и известным способом описан в примере 1.

Оценку сходимости определения расчетных концентраций проводили на примере анализа равновесной паровой фазы модельной смеси (см. Пример 1) из выборки n=5 измерений в виде относительного среднего квадратического отклонения S_z результата измерения по уравнению (5) для бензола, имеющего индексы удерживания 655 и 985, соответственно на неполярной и полярной колонках.

Результаты экспериментов сведены в таблицу «Сравнительные данные экспериментальной проверки известного и предлагаемого способов».

Сравнительные данные экспериментальной проверки известного и предлагаемого способов № п/п Наименование Известный способ Предлагаемый способ Разность индексов удерживания Неполярная фаза Полярная фаза Неполярная фаза Полярная фаза Вероятность по количеству анализов 1 Сходимость, SR, % 11,4 12,6 3,4 4,2 - - 2 Индексы удерживания и , соответствующие одному и тому же летучему компоненту.             2.1 Пример 1 Модельная смесь, содержащая ацетон, изопропанол, этилацетат, изобутанол, бензол, циклогексан и гептан - 869±5 505±5 869±5 3 364 565±3 1099±2 545±3 1099±2 3 534 - 930±3 612±3 930±3 3 318 630±3 - 630±3 1140±2 3 510 655±2 985±2 655±2 985±2 3 330 683±1 725±5 683±1 725±5 3 42 703±1 705±5 703±1 705±5 3 2 2.2 Пример 2 Лекарственное растение календула (calendula officinalis), общее количество пиков при анализе равновесной паровой фазы: неполярная фаза - 17 полярная фаза - 10 - 973±2 471±5 973±2 3 502 - 810±5 505±5 810±5 2 305 535±3 1037±2 535±3 1037±2 3 502 554±3 682±5 554±3 682±5 3 128 - 766±5 613±3 766±5 3 153 648±3 876±5 648±3 876±5 3 228 680±1 949±3 680±1 949±3 3 269 699±1 856±5 699±1 856±5 3 157 924±1 1491±2 924±1 1491±2 3 567 932±1 - 932±1 1204±2 2 272

Из приведенных в таблице данных видно, что:

1. В примере 1 при анализе модельной смеси соответствие хроматографических пиков, полученных на колонках с неполярной и полярной неподвижными фазами, для всех семи летучих компонентов определено предлагаемым способом с наибольшей вероятностью по результатам всех трех анализов.

2. Сравнение полученных разностей индексов удерживания на двух колонках с литературными данными (см.: http://www.nist.gov) позволило провести идентификацию всех компонентов предлагаемым способом. Известный способ позволил идентифицировать только четыре компонента из семи из-за наложения больших пиков растворителей гексана и ацетонитрила при анализе. (Индексы удерживания ацетонитрила ; .)

3. В примере 2 при анализе летучих компонентов равновесной паровой фазы календулы лекарственной определено соответствие хроматографических пиков одному и тому же компоненту пробы для 10 летучих компонентов предлагаемым способом и только для шести компонентов известным способом, из-за маскирования малых количеств исследуемых компонентов большим количеством гексана и ацетонитрила.

4. Восемь летучих компонентов календулы лекарственной определены с наибольшей вероятностью из трех анализов.

5. Два компонента с разностью индексов удерживания 305 и 272 определены с вероятностью из двух анализов. Это связано, по-видимому, с тем, что летучие компоненты календулы лекарственной представляют собой сложную многокомпонентную смесь из различных веществ, при хроматографическом анализе которых в одном хроматографическом пике могут присутствовать несколько неподеленных компонентов.

5. Предложенный способ обеспечивает значительно большую сходимость измерения концентрации анализируемых компонентов. Погрешность измерения S_R уменьшилась практически в три раза. Связано это с тем, что в известном способе пробу на анализ отбирают из гетерогенной системы ограниченно смешиваемых жидкостей (гексан-ацетонитрил) и на результаты измерения влияет значительно большее количество внешних факторов, чем в предлагаемом способе.

Использование предлагаемого способа определения соответствия хроматографических пиков одному и тому же компоненту и устройство для его осуществления позволяет:

1. Проводить с использованием справочных данных об индексах удерживания групповую и индивидуальную идентификацию некоторых летучих компонентов лекарственных растений, фитопрепаратов и биологически активных добавок, изготовленных на их основе, для стандартизации и оценки подлинности на предприятиях при их изготовлении и реализации;

2. Проводить экспресс-анализ качества лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов на имеющемся в лабораториях доступном оборудовании вместо дорогостоящего и сложного в эксплуатации хромато-масс-спектрометра.