Результат интеллектуальной деятельности: Lactobacillus johnsonii La1 NСС533 (CNCM 1-1225) И ИММУННЫЕ НАРУШЕНИЯ

Настоящее изобретение в целом имеет отношение к предотвращению и/или лечению воспалительных и инфекционных болезней, в частности путем повышения эндогенных противомикробных защитных сил организма. Одним вариантом настоящего изобретения является применение нереплицирующихся L. johnsonii Lal NCC533 (№ CNCM 1-1225) при лечении или предотвращении нарушений, связанных с иммунной системой, включая инфекции.

Окружающая среда загрязнена большим количеством потенциально патогенных микроорганизмов. Кератиноциты кожи, эпителиальные клетки, выстилающие желудочно-кишечный тракт, дыхательные пути, мочеполовой тракт обеспечивают физический барьер, который защищает от вторжения микробов в организм.

Кроме того, эпителий способствует защите хозяина посредством выработки и секретирования антимикробных веществ, ограничивающих доступ бактерий и других микроорганизмов. Эти антимикробные молекулы представляют собой ключевые компоненты основной линии защиты врожденного иммунитета.

Одним из наиболее важных классов антимикробных пептидов у людей являются дефензины. Дефензины вырабатываются эпителиальными клетками легких, кожи, ротовой полости, мочеполового тракта, дыхательных путей и желудочно-кишечного тракта. В числе прочих существует семейство β-дефензинов, включающее дефензин 1 (hBD1) и 2 (hBD2).

hBD1 экспрессируется на поверхностях различных слизистых оболочек, например слизистой оболочки полости рта, слюнных желез, желудка, тонкого кишечника, толстого кишечника, печени и поджелудочной железы. hBD2 также присутствует в эпителиальных клетках на многочисленных поверхностях слизистых оболочек, включая слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта. Более того, эти два дефензина присутствуют в слюне и в жидкости на поверхности дыхательных путей (Cunliffe, R.N. and Mahida, Y.R. 2004, J Leukoc.Biol. 75:49-58).

hBD1 экспрессируется конститутивно, при этом не было показано, что он конститутивно активируется бактериями или воспалением (Ou, G., et al., 2009, Scand.J Immunol 69:150-161).

Хорошо известно, что пробиотики способны усилить различные линии кишечной защиты: иммунное исключение (устранение), иммунный клиренс и иммунную регуляцию. Известно также, что пробиотики стимулируют неспецифическую устойчивость хозяина к микробным патогенам и тем самым содействуют их уничтожению.

Однако, несмотря на это, сообщалось, что экспрессия конститутивного hBD1 не поддается действию пробиотических бактерий (O'Neil, D.A. et al., J Immunol 163:6718-6724) и очень слабо активируется симбиотическими (Escherichia coli) и патогенными (Salmonella typhimurium) штаммами (Ou, G., et al., 2009, Scand.J Immunol 69:150-161).

В настоящее время применение пробиотиков направлено на уменьшение риска заболеваний, связанных с нарушением барьерной функции кишечника (Е. Isolauri, et al, 2002, Gut 2002; 50:iii 54-iii 59). Считается, что пробиотики являются эффективными вследствие выживаемости в кишечнике, стабильности к кислотам и желчи и временной колонизации (заселения) поверхностей слизистой в кишечном тракте.

Соответственно, подавляющая часть опубликованной литературы посвящается живым пробиотикам. Однако в некоторых исследованиях изучалась польза для здоровья, получаемая от нереплицирующихся бактерий, и большая часть из них показала, что инактивация пробиотиков, например путем термичекой обработки, приводит к утрате предполагаемой пользы для здоровья (Rachmilewitz, D., et al., 2004, Gastroenterology 126:520-528; Castagliuolo, et al., 2005, FEMS Immunol. Med. Microbiol. 43:197-204; Gill, H. S. and K. J. Rutherford, 2001, Br.J. Nutr. 86:285-289; Kaila, M., et al., 1995, Arch. Dis.Child 72:51-53).

В настоящее время использование живых бактерий в пищевых продуктах имеет некоторые недостатки. Живые бактерии обычно не являются устойчивыми к стрессу, и поэтому их трудно использовать в промышленном масштабе, сохраняя при этом их жизнеспособность. Кроме того, для некоторых категорий продуктов добавление живых микроорганизмов к составу не является оптимальным в связи с проблемами безопасности. Следовательно, существует необходимость в биоактивных неживых микроорганизмах.

Предоставление нереплицирующихся пробиотических микроорганизмов давало бы возможность разбавления (восстановления) при повышенной температуре, например, порошкообразной питательной композиции, что является предпочтительным, в то же время обеспечивая сохранение свойств, полезных для здоровья пациента-потребителя. Исходя из этого, было бы желательно использовать нереплицирующиеся бактерии вместо их живых аналогов, однако исследования, касающиеся этого аспекта, не являются обнадеживающими.

В литературе сообщалось о применении живых пробиотиков, как стратегии для лечения или предотвращения воспалительных заболеваний кишечника, а недавно был Dotan et al. опубликовали обзор (Dotan, I. and D. Rachmilewitz. 2005; Curr. Opin. Gastroenterol. 21:42 6-25 430). Например, было показано, что высококонцентрированная смесь из восьми живых пробиотических бактерий (VSL#3) является эффективной для предотвращения (Gionchetti, P., et al, 2003, Gastroenterology 124:1202-1209) и лечения рецидивирующего или рефракторного паучита у людей (Gionchetti, P., et al., 2000, Gastroenterology 119:305-309; Mimura, Т., et al., 2004, Gut 53:108-114). Что интересно, Rachmilewitz et al. (Rachmilewitz, D., et al., 2004, Gastroenterology 12 6:520-528) сообщили, что при использовании мышиной модели колита, индуцированного DSS, обработка жизнеспособными и γ-облученными VSL#3, но не убитыми нагреванием VSL#3, защищала от колита. Подобным образом, убитые нагреванием L. crispatus не защищали от индуцированного DSS колита, в то время как их жизнеспособные аналоги явно уменьшили потерю веса и активность МРО в кишечнике (Castagliuolo, et al., 2005, FEMS Immunol.Med.Microbiol. 43:197-204). Эти исследования наводят на мысль о том, что пробиотики являются более эффективными в живом виде в случае воспаления кишечника, чем их нереплицирующиеся аналоги.

Было показано, что инактивированные L. reuteri (убитые нагреванием и γ-облученные) не способны уменьшать TNFα-индуцированную выработку IL-8 клетками Т84, в то время как их живые аналоги продемонстрировали значительный положительный эффект (Ма, D., et аl., 2004, Infect.Immun. 72:5308-5314).

Следовательно, в данной области техники существует необходимость в природных композициях, с которыми легко работать в промышленных условиях, которые являются безопасными и удобными для применения и которые дадут возможность предотвращения и/или лечения воспалительных и инфекционных нарушений, в частности путем повышения эндогенных противомикробных защитных сил организма.

В идеальном случае природная композиция должна быть приготовлена из пробиотических культур, в частности из пробиотических микроорганизмов, которые в настоящее время являются общепринятыми и признанными потребителями, как приносящие пользу здоровью. Преимущественно, композиция должна содержать нереплицирующиеся бактерии и должна быть более эффективной, чем композиция, содержащая их живые аналоги.

Настоящие изобретатели обратили внимание на существование такой потребности.

Поэтому цель настоящего изобретения заключалась в улучшении уровня техники и предоставлении природной композиции, которая сделала бы возможным предотвращение и/или лечение воспалительных или инфекционных болезней, в частности путем повышения эндогенных противомикробных защитных сил организма, и которая соответствовала бы вышеперечисленным требованиям.

Изобретатели неожиданно обнаружили, что задача настоящего изобретения может быть решена с помощью объектов, раскрытых в независимых пунктах формулы изобретения. Зависимые пункты формулы изобретения дополнительно определяют предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения.

Объекты настоящего изобретения укрепляют эндогенные противомикробные защитные силы млекопитающих путем введения продукта, содержащего микроорганизмы, такие как нереплицирующиеся микроорганизмы, например термически обработанные микроорганизмы.

Изобретатели сообщают, что L. johnsonii (Lal, NCC 533, № CNCM 1-1225), в частности нереплицирующиеся L. johnsonii (Lal, NCC 533, № CNCM 1-1225), например термически обработанные L. johnsonii (Lal, NCC 533, № CNCM 1-1225), оказывают превосходящее влияние на индукцию экспрессии антимикробных пептидов по сравнению с микроорганизмами, которые были ранее установлены и описаны в литературе.

Например, было обнаружено, что:

- L. johnsonii (Lal, NCC 533, № CNCM 1-1225) сильно стимулирует конститутивную экспрессию hBD1, и что

- термически обработанные L. johnsonii (Lal, NCC 533, № CNCM 1-1225) активируют hBD1 более сильно, чем их живые аналоги.

HBD1 проявляет антибактериальную активность в отношении широкого спектра бактерий, включая Е. coli и Pseudomonas aeruginosa, H. pylori (Nuding.S., et al., 2009, Microbes.Infect. 11: 384-393), а также против дрожжевых грибков, таких как Candida albicans (O'Neil, D.A. 2003, Mol. Immunol 40:445-450), и вирусов (вируса иммунодефицита человека) (Kota, S. еt al., 2008, J. Biol. Chem 283:22417-22429). Таким образом, эти антимикробные пептиды могут усиливать мукозальный барьер и в результате ограничивать бактериальную адгезию и инвазию.

Все больше и больше фактов показывают, что уровни дефензинов снижаются при определенных патофизиологических условиях и что это является фактором риска для развития инфекционных и воспалительных заболеваний и их осложнений, таких как (Doss, M. et al., 2010, J Leukoc.Biol. 87: 79-92); Rivas-Santiago, B. et al., 2009, Infect. Immun. 77:4690-4695):

- в дыхательных путях:

кистозного фиброза, реактивных заболеваний дыхательных путей, легочных инфекций от табакокурения, астмы, пневмонии, ринита, отита, синусита, туберкулеза;

- в желудочно-кишечном тракте:

болезни Крона (толстой кишки и подвздошной кишки), язвенного колита, гастрита и язвы желудка, вызванных инфекцией Helicobacter pylori, инфекционной диареи, некротизирующего энтероколита, диареи, связанной с антибиотиками, глютеновой болезни, недоразвития кишечника;

- в мочеполовых путях:

бактериального вагиноза, инфекции вирусом иммунодефицита человека (HIV), вирусом простого герпеса, инфекции мочевых путей;

- на коже:

атопического дерматита, хронической язвы, карциномы, атопической экземы, ожогового поражения;

- в ротовой полости:

заболеваний у пациентов с HIV, тонзиллита, гингивита, кариеса зубов;

- кератита глаз.

Представленные в данном описании результаты показывают, что L. Johnsonii Lal (NCC533, № CNCM 1-1225) обладают более сильной способностью к увеличению эндогенной антибактериальной защиты, чем обнаруженные ранее пробиотические бактерии, и таким образом могут быть более эффективными для предотвращения и лечения избыточного бактериального роста в тонкой кишке (SIBO), воспалительных и инфекционных заболеваний.

В дополнение к этому данные изобретателей показывают (в противоположность тому, что можно было предполагать, исходя из уровня техники), что термическая обработка не уменьшает, а дополнительно увеличивает сильный антибактериальный эффект L. johnsonii Lal (NCC533, № CNCM 1-1225).

Одним вариантом осуществления изобретения является композиция, содержащая L. johnsonii Lal (NCC533, № CNCM 1-1225), для применения при лечении или предотвращении нарушений, связанных с иммунной системой, включая инфекции.

Согласно настоящему изобретению нарушения, связанные с иммунной системой, можно лечить или предотвратить посредством увеличения эндогенной экспрессии hBD1.

Настоящее изобретение также имеет отношение к композиции, содержащей L. johnsonii Lal (NCC533, № CNCM 1-1225), для лечения или предотвращения нарушений, связанных с пониженной экспрессией hBD1, например, микробных инфекций.

Настоящее изобретение также имеет отношение к применению L. Johnsonii Lal (NCC533, № CNCM 1-1225) для приготовления композиции для лечения или предотвращения нарушений, связанных с иммунной системой.

Могут использоваться, по меньшей мере, частично, нереплицирующиеся L. johnsonii Lal (NCC533, № CNCM 1-1225). Нереплицирующиеся, в частности термически обработанные, L. johnsonii Lal (NCC533, № CNCM 1-1225) обладают преимуществами, будучи даже более эффективными, чем их живые аналоги.

Применение нереплицирующихся микроорганизмов, таких как термически обработанные L. johnsonii Lal (NCC533, № CNCM 1-1225), вместо их живых аналогов имеет дополнительные преимущества:

- уменьшение потенциального риска сепсиса, ассоциированного с живыми пробиотиками, в чувствительных популяциях,

- предоставление безопасной альтернативы больным с ослабленным иммунитетом и

- уменьшение проблем при обработке может дать в результате стабильные при хранении жидкие продукты с длительным сроком годности.

Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения, по меньшей мере, 90%, например, по меньшей мере, 95%, предпочтительно, по меньшей мере, 98%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 99%, идеально, по меньшей мере, 99,9% или все L. johnsonii Lal (NCC533, № CNCM 1-1225) являются нереплицирующимися.

Настоящее изобретение также имеет отношение к композиции, содержащей L. johnsonii Lal (NCC533, № CNCM 1-1225), в которой, по меньшей мере, 95%, предпочтительно, по меньшей мере, 98%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, 99%, в идеальном случае, по меньшей мере, 99,9% или 100% L.johnsonii Lal (NCC533, № CNCM 1-1225) являются нереплицирующимися.

Таким образом, настоящее изобретение также имеет отношение к биоактивным, нереплицирующимся, например, термически обработанным, L.johnsonii Lal (NCC533, № CNCM 1-1225).

"Нереплицирующиеся" L. johnsonii Lal (NCC533, № CNCM 1-1225) включают L. johnsonii Lal, которые были термически обработаны. Также сюда включаются L.johnsonii Lal (NCC533, № CNCM 1-1225), являющиеся инактивированными, мертвыми, нежизнеспособными и/или присутствующие в виде фрагментов, таких как ДНК, метаболиты, цитоплазматические соединения и/или материалы клеточной стенки.

"Нереплицирующиеся" означает, что с помощью классических методов посева нельзя обнаружить жизнеспособные клетки и/или колониеобразующие единицы. Такие классические методы посева обобщены в книге по микробиологии James Monroe Jay, Martin J. Loessner, David A. Golden. 2005. Modern food microbiology. 7th edition, Springer Science, New York, N.Y. 790 p. В большинстве случаев отсутствие жизнеспособных клеток можно обнаружить, как указано ниже, по отсутствию жизнеспособных колоний на агаровых чашках или по мутности жидкой ростовой среды, которая не увеличивается после посева разных концентраций бактериальных препаратов («нереплицирующихся образцов») и инкубации при подходящих условиях (в аэробной и/или анаэробной атмосфере, по меньшей мере, в течение 24 час).

L. johnsonii Lal (NCC533, № CNCM 1-1225) можно перевести в состояние, при котором они не будут реплицироваться (т.е сделать их нереплицирующимися), с помощью термической инактивации. Инактивация нагреванием может происходить, по меньшей мере, примерно при 70°С.

Для инактивации пробиотиков может использоваться любая термическая обработка, лишь бы она проводилась достаточно долго для достижения инактивации. Например, такую термическую обработку можно проводить, по меньшей мере, в течение 10 секунд.

Как правило, при более высокой температуре требуется более короткое время нагревания, в то время как при более низких температурах требуется более длительное нагревание.

Например, L. johnsonii Lal (NCC5 33, № CNCM 1-1225) можно перевести в состояние, при котором они не будут реплицироваться, при температуре от 110 до 140°С в течение 1-30 секунд, например 10-20 секунд.

Эти установленные временные рамки относятся к времени, в течение которого L. johnsonii Lal подвергаются воздействию заданной температуры. Отметим, что время термической обработки может различаться в зависимости от природы и количества предоставленной композиции L. johnsonii Lal и в зависимости от конфигурации используемого для нагревания устройства. Термическая обработка может проводиться при нормальном атмосферном давлении, однако ее также можно проводить при высоком давлении. Обычные пределы давления составляют от 1 до 50 бар, предпочтительно от 1-10 бар, еще более предпочтительно от 2 до 5 бар. Оптимальное давление зависит от природы, содержащей микроорганизмы композиции, и от используемой температуры.

Если композиции, в которых предоставляются Lal (NCC533, № CNCM 1-1225), подвергаются какой-либо термической обработке, например, до упаковки и распространения, предпочтительно использовать эту стадию термической обработки для инактивирования Lal NCC533.

Как правило, композиции, содержащие Lal (NCC 533, №CNCM 1-1225), могут быть подвергнуты кратковременной обработке при высокой температуре (HTST), мгновенной пастеризации или ультравысокотемпературной обработке (UHT).

UHT обработка - это ультравысокотемпературный процесс или ультравысокотемпературная обработка (и то и другое обозначается сокращенно UHT), предполагающая, по меньшей мере, частичную стерилизацию композиции нагреванием в течение короткого времени около 1-10 секунд, при температуре, превышающей 135°С (275°F), такая температура требуется для того, чтобы убить бактериальные споры в молоке. Например, обработка молока с использованием температур, превышающих 135°С, позволяет снизить бактериальную нагрузку в пределах необходимого времени выдержки (до 2-5 сек), что дает возможность непрерывного течения процесса.

Существует два основных типа систем UHT - прямые и непрямые системы. В прямой системе продукты обрабатываются закачиванием пара или нагнетанием пара, тогда как в непрямой системе, продукты подвергаются термической обработке с помощью пластинчатого теплообменника, трубчатого теплообменника или скребкового теплообменника. В процессе получения продукта на какой-либо стадии или на нескольких стадиях могут применяться комбинации систем UHT.

HTST обработка определяется как указано далее (высокая температура/ короткое время): это метод пастеризации, разработанный для достижения 5-кратного логарифмического уменьшения количества микроорганизмов, убивающий 99,9999% от числа жизнеспособных микроорганизмов в молоке. Он считается достаточным для уничтожения почти всех дрожжей, плесеней и обычных бактерий, вызывающих порчу, а также для гарантированного достаточного разрушения обычных патогенных, устойчивых к нагреванию организмов. При процессе HTST молоко нагревается до 71,7°С (161°F) в течение 15-20 секунд.

Мгновенная пастеризация представляет собой способ тепловой пастеризации быстропортящихся напитков, таких как фруктовые и овощные соки, пиво и молочные продукты. Пастеризацию осуществляют до заполнения в контейнеры для того, чтобы уничтожить вызывающие порчу микроорганизмы, сделать продукты безопасными и увеличить их срок годности. В то время, когда жидкость перемещается в контролируемом непрерывном потоке, она подвергается воздействию температур от 71,5°С (160°F) до 74°С (165°F) примерно в течение от 15 до 30 секунд.

Для цели настоящего изобретения термин "кратковременная высокотемпературная обработка" включает кратковременную обработку при высокой температуре (HTST), UHT обработку и мгновенную пастеризацию.

Композиции настоящего изобретения могут содержать Lal в количестве, достаточном, по меньшей мере, для частичного лечения инфекций и нарушений, связанных с иммунной системой, и/или их осложнений. Количество, достаточное для достижения этой цели, определяется как "терапевтически эффективная доза". Количества, эффективные для достижения этой цели, будут зависеть от ряда факторов, известных специалистам в данной области техники, например тяжести заболевания, веса и общего состояния здоровья потребителя, и от эффекта пищевой матрицы (food matrix).

При профилактическом применении композиции согласно изобретению вводятся потребителю, подверженному или иным образом связанному с риском развития заболеваний, сопряженных с иммунной системой, в количестве, достаточном, по меньшей мере, для частичного уменьшения риска развития подобных расстройств. Такое количество определяется как "профилактически эффективная доза". И в этом случае точные количества зависят от ряда факторов, индивидуальных для пациента, таких как состояние здоровья и вес пациента, и от действия пищевой матрицы (food matrix).

Специалисты в данной области техники смогут соответствующим образом отрегулировать терапевтически эффективную дозу и/или профилактически эффективную дозу.

В большинстве случаев композиция настоящего изобретения содержит Lal (NCC533, № CNCM 1-1225) в терапевтически эффективной дозе и/или в профилактически эффективной дозе.

Как правило, терапевтически эффективная доза и/или профилактически эффективная доза находится в пределах примерно от 0,005 мг до 1000 мг Lal в ежедневной дозе.

В количественном выражении Lal (NCC533, № CNCM 1-1225) могут быть представлены в композиции в количестве, соответствующем от 10⁴ до 10¹² КОЕ/г сухой композиции. Очевидно, что нереплицирующиеся микроорганизмы не образуют колонии, поэтому этот термин следует понимать как количество нереплицирующихся микроорганизмов, которое получается из 10⁴-10¹² КОЕ/г воспроизводящихся бактерий. Сюда включаются микроорганизмы, которые являются инактивированными, нежизнеспособными или мертвыми или присутствуют в виде фрагментов, таких как ДНК или клеточная стенка или цитоплазматические соединения. Другими словами, количество микроорганизмов, которое содержится в композиции, выражается в терминах колониеобразующей способности (КОЕ) такого количества микроорганизмов, как если бы все микроорганизмы были живыми, независимо от того, являются ли они фактически нереплицирующимися, например, инактивированными или мертвыми, фрагментированными, или смесью любых или всех из этих состояний.

Например, композиция в соответствии с настоящим изобретением может содержать количество L. johnsonii Lal (NCC533, № CNCM 1-1225), соответствующее примерно от 10⁴ до 10¹² КОЕ в ежедневной дозе.

Композиция настоящего изобретения может содержать примерно 0,005 мг - 1000 мг L. johnsonii Lal (NCC533, № CNCM 1-1225) в ежедневной дозе.

Композиция настоящего изобретения может быть композицией любого типа. Композиция может предназначаться для перорального, энтерального, парентерального (подкожного или внутримышечного), местного или окулярного введения, или введения с помощью ингаляции, внутрь прямой кишки и внутривагинального введения.

В связи с этим композиция настоящего изобретения может быть выбрана из группы, состоящей из пищевых композиций, пищевых продуктов, включая корм для животных, напитков, составов для сбалансированного питания, питательных добавок, нутрицевтиков, пищевых добавок, фармацевтических композиций, косметических композиций, медикаментов и композиций для местного применения.

Могут быть добавлены пребиотики. Пребиотики могут поддерживать рост пробиотиков до того, как их переведут в состояние «нереплицирующихся». Пребиотики также могут действовать синергично с жизнеспособными пробиотическими бактериями, которые присутствуют в композиции и/или которые могут быть добавлены.

Нарушение, связанное с иммунной системой, может быть выбрано из группы, состоящей из инфекций, в частности бактериальной, вирусной, грибковой и/или паразитарной инфекции; воспалений; дефицита фагоцитов; дефектов эпителиального барьера, незрелости иммунной системы, SIBO и их комбинаций.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция, содержащая L. johnsonii Lal (NCC533, № CNCM I-122), может использоваться для лечения или предотвращения микробных инфекций, таких как вирусные, грибковые и/или паразитарные инфекции.

Нарушение, связанное с иммунной системой, также может быть выбрано из группы нарушений, связанных с пониженным уровнем дефензинов, в частности hBD1. Такие нарушения могут быть выбраны из группы, состоящей из кистозного фиброза, реактивных заболеваний дыхательных путей, легочных инфекций от табакокурения, астмы, пневмонии, ринита, отита, синусита, туберкулеза, болезни Крона (толстой кишки и подвздошной кишки), язвенного колита, глютеновой болезни, недоразвития кишечника, гастрита и язвы желудка, вызванных инфекцией Helicobacter pylori, инфекционной диареи, некротизирующего энтероколита, диареи, связанной с антибиотиками, бактериального вагиноза, инфекции вирусом иммунодефицита человека (HIV), вирусом простого герпеса, инфекции мочевых путей, атопического дерматита, хронической язвы, карциномы, атопической экземы, ожогового поражения, тонзиллита, гингивита, кариеса зубов, кератита глаз и их комбинаций.

Композиция настоящего изобретения может быть использована для повышения эндогенных противомикробных защитных сил организма.

Этого можно достигнуть, например, путем стимулирования эндогенной экспрессии hBD1.

Настоящие изобретатели обнаружили, что L. johnsonii Lal (NCC533, № CNCM 1-1225) сильно стимулируют конститутивную экспрессию hBD1, а также, что нереплицирующиеся, например, термически обработанные L. johnsonii Lal (NCC533, № CNCM 1-1225), стимулируют экспрессию hBD1 даже больше, чем их живые аналоги.

Следовательно, предмет настоящего изобретения также включает способ увеличения эффективности L. johnsonii Lal (NCC533, № CNCM 1-1225) при лечении или предотвращении нарушений, связанных с иммунной системой, включающий стадию переведения L. johnsonii Lal (NCC533, № CNCM 1-1225) в состояние, при котором они становятся нереплицирующимися, например с помощью термической обработки.

Нарушение, связанное с иммунной системой, может быть, например, одним из нарушений, перечисленных выше.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения способ включает стадию термической обработки, по меньшей мере, при температуре около 70°С в течение, по меньшей мере, примерно 10 секунд.

Специалистам в данной области техники понятно, что они могут свободно комбинировать все признаки настоящего изобретения, описанные в документе, не выходя за рамки описанного изобретения. В частности, признаки, описанные в отношении композиций настоящего изобретения, могут применяться в отношении случаев использования и/или способа настоящего изобретения и наоборот.

Дополнительные преимущества и признаки настоящего изобретения станут понятными из следующих примеров и фигур.

Фигура 1 показывает, что термически обработанные при 120°С в течение 15 сек Lal (NCC533, № CNCM 1-1225) сильно воздействуют на мРНК hBD1 в эпителиальных клетках кишечника in vitro по сравнению с другими штаммами, подвергнутыми термической обработке. Клетки Т84 инкубировали в течение 4 час с термически обработанными штаммами. Генную экспрессию hBD1 анализировали с помощью ПЦР в режиме реального времени. Столбики представляют средние значения ± стандартная ошибка среднего, нормализованные относительно исходной экспрессии клеток, не подвергнутых стимулированию.

Фигура 2 показывает, что высокая температура и короткое время обработки Lal (NCC533, № CNCM 1-1225) были лучшими условиями для стимулирования экспрессии мРНК hBD1. Клетки Т84 стимулировали в течение 4 часов живыми и термически обработанными Lal (NCC533, № CNCM 1-1225) при 120°С в течение 15 сек или при 85°С в течение 20 мин. Экспрессию генов hBD1 анализировали с помощью ПЦР в режиме реального времени. Столбики представляют средние значения ± стандартная ошибка среднего, нормализованные относительно исходной экспрессии клеток, не подвергнутых стимулированию.

Примеры

Протокол эксперимента:

Использовали клетки Т84 от пассажа 30-40 и культивировали в основной среде модифицированной Дульбекко/F-12 (Sigma D 6421), содержащей 5% фетальной телячьей сыворотки (PCS) (Amined BioConcept) и 2 мМ глютамина. Клетки высевали в концентрации 2×10⁶ клеток/лунку в 6-луночные культуральные планшеты и выращивали в виде монослоя при 37°С в атмосфере 5% СO₂ - 95% воздух. Клетки выращивали 1 неделю после слияния и инкубировали с сывороткой и средой, не содержащей антибиотик, по меньшей мере, в течение 12 часов. Эта стадия была необходима, чтобы исключить экспрессию дефензина, индуцированную сывороткой, и предотвратить какое-либо влияние антибиотиков на пробиотики и на клеточный иммунный ответ. Клетки дополнительно инкубировали с пробиотиками или термически обработанными штаммами в течение 4 часов. В конце времени инкубации клетки промыли PBS и собрали с помощью реактива для выделения TriPure согласно протоколу поставщика. Экспрессию генов человека hBD1 и hBD2 в обработанных таким образом клетках оценивали с помощью количественной ПЦР.

В этом эксперименте использовали бактериальные штаммы В. longum (NCC 2705, № CNCM 1-2618), В. lactis (NCC 2818, № CNCM 1-3446), L. johnsonii (Lal, NCC533, № CNCM 1-1225), L. paracasei (ST11, NCC 24 61, № CNCM 1-2116). Исследования проводились на живых или термически обработанных штаммах - в течение 15 секунд при 120°С или в течение 20 минут при 85°С.

Результаты

Термически обработанные при 120°С в течение 15 сек Lal (NCC533, № CNCM 1-1225) вызывают сильную экспрессию мРНК hBD1 после 4 часов инкубации (Фигура 1) в противоположность другим проверенным термически обработанным штаммам. Эти результаты являются уникальными, поскольку в настоящее время в научном сообществе считается, что конститутивно экспрессирующийся HBD1 фактически не подвержен модулированию микробами, продуктами жизнедеятельности микроорганизмов или воспалением.

И живые и термически обработанные Lal (NCC533, № CNCM I-1225) сильно воздействуют на экспрессию мРНК hBD1, но самое высокое стимулирование hBD1 было вызвано термически обработанными Lal (высокая температура и короткое время обработки) (Фигура 2).