Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ Microbacterium species ДЛЯ ОЧИСТКИ ПРЕСНОВОДНЫХ ВОДОЕМОВ И ИХ ДОННЫХ ОТЛОЖЕНИЙ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ

Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения нового штамма бактерий, эффективного для очистки пресной воды и донных отложений водоемов от загрязнений нефтью в течение 3-40 суток в диапазоне температур от +2°C до +25°C.

Известен штамм Pseudomonas putida 36 (Авт.св. SU 1076446 А1, 1984, Бюл. №81), пригодный для очистки от нефти и нефтепродуктов пресной и морской воды (до 7,5% солености) в широком диапазоне температур (10-26°C).

Недостатком штамма является снижение эффективности очистки вод от нефти при температуре ниже +10°C и снижение уровня растворенного кислорода.

Известен штамм Mycobacterium flavescens (Патент RU 2053296 С1, 1996, Бюл. №3), обладающий высокой способностью к утилизации нефти и нефтепродуктов.

Недостатком штамма является его высокая чувствительность к температуре среды и насыщенности среды кислородом.

Известен штамм Mycobacterium species ЦКМ В 65-Б (Патент RU 2129603 С1, 1999, Бюл. №22), используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов в широком диапазоне температур (10-26°C).

Недостатком штамма является снижение эффективности очистки вод от нефти при температуре ниже +10°C и снижение уровня растворенного кислорода, что не позволяет ожидать эффективной очистки донных отложений от нефти.

Задача изобретения - получение штамма бактерии, обеспечивающей разрушение растворенных в воде нефтепродуктов загрязненных водоемов и тяжелых парафинов в донных отложениях в диапазоне температур от +2°C до +25°C при низком содержании кислорода.

Штамм Microbacterium species BKM Ac-2614D выделен в 2007 году из накопительной культуры из проб загрязненного нефтью донного грунта пресноводного озера с глубины 7 м в зоне хронического нефтяного загрязнения. Авторский номер штамма КР-216O_1. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов, номер VKM Ac-2614D.

В классификации микроорганизмов по группам патогенности Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 от 1 мая 2008 г. «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» данный вид (род) не значится.

Штамм растет на агаризованной среде, содержащей жидкие алканы в качестве единственного источника углерода, и характеризуется следующими морфологическими, культуральными и физиологическими признаками: грамположительные мелкие палочки неправильной формы, одиночные или в парах V-образной конфигурации, слабоподвижные, в старой культуре возможно морфология клеток в виде кокков. Колонии на питательном агаре округлой иногда неправильной формы, непросвечивающие, блестящие, молочного или слегка желтоватого цвета. Консистенция слизистая. Выделяемый в среду пигмент отсутствует, способен закислять сахаросодержащую среду. Аэроб, факультативный анаэроб.

Режим хранения штамма - длительное хранение в лиофилизированной форме в плотно запаянных стеклянных ампулах. Кратковременное хранение (для подготовки биомассы с целевым использованием) - периодические пересевы - 1 раз в 2 месяца с хранением выросшей чистой культуры на скошенном агаре среды следующего состава: на 1000 мл воды: пептон 15 г, алканы 10 г, NaNO₃ - 2,0 г; KH₂PO₄ - 1,0 г; KCl - 0,5 г; MgSO₄x5H₂O - 0,5 г; агар микробиологический - 20,0; в закрытых ватно-марлевыми пробками пробирках в холодильнике при температуре не выше +6°С и не ниже +1°C.

Условия культивирования. Для культивирования штамма используется среда следующего состава: на 1000 мл воды - пептон 15 г, NaNO₃ - 2,0 г; КН₂РО₄ - 1,0 г; KCl - 0,5 г; MgSO₄x5H₂O - 0,5 г; алканы - 10 г, pH 6,5-7,5. Наработку биомассы проводят на шейкере при 220 об/мин при 15-25°C в течение 3-5 суток.

Способность штамма к биодеструкции нефти и нефтепродуктов изучали в лабораторных опытах с пресной водой и пробами загрязненных нефтью донных отложений, результаты приведены в примерах ниже.

Пример 1. Разрушение углеводородов в воде в присутствии штамма Microbacterium species BKM Ac-2614D.

Для изучения углеводородокисляющих свойств штамма был проведен опыт в присутствии сырой нефти. На 1 л воды добавляли NaNO₃ - 2,0 г; KН₂РО₄ - 1,0 г; KCl - 0,5 г; MgSO₄x5H₂O - 0,5 г, раствор разливали в 250 мл колбы по 100 мл, стерилизовали их в течение часа в автоклаве, охлаждали до комнатной температуры, затем до температуры экспозиции в холодильнике, после чего проводили заражение содержимого колбы предварительно приготовленной суспензией живой культуры Microbacterium species BKM Ac-2614D с титром живых клеток 10 млрд клеток/1 мл в количестве 1 мл на колбу. Контрольную колбу микроорганизмами не заражали. Во все колбы добавляли по 3 г сырой нефти. Условия опыта - варианты без принудительной аэрации, в условиях интенсивной аэрации, температура 0+2°C, +10°C и +25°C (таблица 1). Длительность опыта 3 суток для условий принудительной аэрации, 10 суток без принудительной аэрации.

По истечении опыта нефть извлекали из колб экстракцией хлороформом и анализировали концентрацию растворенных в водной среде углеводородов. Результаты анализа концентрации углеводородов приведены в таблице 2. Как видно из данных анализа, в присутствии штамма Microbacterium species BKM Ac-2614D происходит снижение концентрации растворенных в воде углеводородов, усиливающееся при повышении температуры от +2°C до +25°C в условиях принудительной аэрации от 94 до 99% и без принудительной аэрации от 74 до 93%. При этом время на очистку воды без аэрирования среды также увеличивается. Однако из полученного результата можно заключить, что штамм эффективен для деструкции растворенных в воде углеводородов как с аэрированием, так и без него, что дает основание рекомендовать его для работ, связанных с необходимостью очистки водоемов от остаточных нефтепродуктов после уборки поверхностной нефти. Такие характеристики свойственны для водоемов открытого и закрытого типов после аварийных разливов нефти.

Пример 2. Разрушение углеводородов в донных отложениях.

Для опыта брали пробы донных отложений с уровнем углеводородного загрязнения 2360 мг/кг. Такая концентрация нефтепродуктов в пробах донных отложений свойственна для хронически загрязненных водоемов закрытого типа и представляет собой угрозу донной флоре и фауне. Температура среды на дне водоемов с глубиной снижается, на глубине более 10 м как правило стабильно составляет +4°C - +10°C, уровень растворенного кислорода низок. Очистка донных отложений в озерных системах с глубиной более 10 м проблематична, механически методы не дают должного результата. Применение методов микробиологической чистки здесь может быть перспективным. Был проведен опыт при температуре +5°C. Брали пробы загрязненных нефтепродуктами донных отложений и воду из того же водоема с уровнем растворенных углеводородов 3,45 мг/дм ³, помещали в стеклянные сосуды с хорошо притертой крышкой, выдерживали в холодильнике в течение 10 суток и заражали колбы суспензией штамма Microbacterium species BKM Ac-2614D с титром клеток 10¹⁰ в количестве 10 мл на 10 л среды. Опытные сосуды выдерживали в течение 15 и 40 дней в холодильной камере без аэрации и затем проводили анализ проб донных отложений и воды на содержание нефтепродуктов. Результаты приведены в таблице 3.

Как видно из представленных в таблице результатов - в сравнении с контролем, где есть собственная микробная активность, это следует из того, что в пробах донных отложений произошло частичное снижение концентрации нефти в течение опыта, а в воде наблюдаем увеличение уровня растворенных углеводородов, при внесении в опытные варианты суспензии клеток испытуемого штамма происходит постепенное снижение концентрации нефти в пробах донного грунта, сопровождающееся временным увеличением уровня растворенных углеводородов и его последующим снижением. С учетом холодного температурного режима и отсутствия аэрации в опыте достигнутый результат говорит о перспективности применения штамма для очистки донных отложений и воды загрязненного водоема от нефтепродуктов как в нормальных условиях, так и в условиях холодного климата.