СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ, СОДЕРЖАЩЕЙ КСАНТАН

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к биотехнологическому получению экзополисахаридов, и может быть использовано при получении ксантана, а также получению биопрепаратов различного назначения.

Ксантан представляет собой микробиологический полимер, широко применяемый в пищевой, фармацевтической, косметической промышлености, а также при добыче нефти.

Известен (RU, патент 2323005, опубл. 2008) способ получения культуральной жидкости производства ксантанов, включающий культивирование штамма Xanthomonas campestris ВКМ В-611 на питательной среде, содержащей в качестве источника углеродного питания сахарозу, а также минеральные соли и факторы роста, в условиях аэрации и перемешивания, причем культивирование ведут в ферментерах, которые предварительно последовательно промывают 0,01-0,05%-ным водным раствором β-лактамного антибиотика или 0,01-0,05%-ным водным раствором антибиотика рода тетрациклинов или их смесью при той же концентрации в любом соотношении, водой и стерилизуют.

Недостатком известного способа следует признать неиспользование в качестве источника углеродного питания сахарозы, а также сложность промывки ферментеров.

Известен (US, патент 3485719, опубл. 23.12.1969) способ получения культуральной жидкости производства ксантанов с использованием бактерий Xanthomonas campestris. Известный способ предусматривает культивирование бактерий Xanthomonas campestris с введением в состав питательной среды, кроме источника углерода (сахароза), ионов железа и хелатообразующих соединений.

Недостатком указанного способа является значительное загрязнение полученной культуральной жидкости неутилизируемыми бактериями компонентами питательной среды.

Известен (FR, патент 2231748, опубл. 1975) способ получения культуральной жидкости производства ксантанов, включающий культивирование штамма Xanthomonas campestris ВКМ В-611 на питательной среде, содержащей в качестве источника углеродного питания метанол, а также минеральные соли.

Недостатком известного способа следует признать не только использование токсичного компонента (метанола), но и малое содержание экзосахаров в конечной культуральной среде.

Известен (RU, патент 2252033, опубл. 2005) способ получения культуральной жидкости ксантанов, включающий культивирование штаммов-продуцентов Xanthomonas campestris на питательной среде, содержащей источник углеродного питания (сахароза), минеральные соли и факторы роста, в условиях аэрации и перемешивания, причем культивирование ведут в ферментерах, в которых предварительно производили синтез β-лактамного антибиотика.

Наиболее близким аналогом разработанного способа можно признать (SU, патент 929015, опубл. 1982) способ производства культуральной жидкости ксантанов, включающий культивирование культуры штамма Pseudomonas polysaccharogenes М-30 на питательной среде, содержащей источники углерода и азота, а также минеральные соли, в условиях аэрации, в качестве источника углерода использован метанол.

Недостатком известного способа следует признать применение токсичного источника углерода (метанола), а также слабую эффективность штамма Pseudomonas polysaccharogenes М-30 как продуцента ксантана.

Техническая задача, решаемая посредством разработанного технического решения, состоит в оптимизации получения культуральной жидкости, содержащей ксантан.

Технический результат, получаемый при реализации способа, состоит в повышении содержания ксантана в культуральной жидкости, содержащей ксантан на стадии завершения процесса при одновременном использовании в качестве источника углерода нетоксичной предварительно гидролизованной низкосортной древесины.

Для достижения указанного технического результата предложено использовать разработанный способ получения культуральной жидкости, содержащей ксантан, включающий культивирование культуры бактерий Xanthomonas campestris на питательной среде, содержащей источники углерода и азота, а также минеральные соли, в условиях аэрации, причем в качестве источника углерода в питательной среде используют предварительно гидролизованную низкосортную древесину, при этом на питательной среде осуществляют культивирование штамма Xanthomonas campestris ВКПМ В-2228.

Выращивание штамма Xanthomonas campestris ВКПМ В-2228, полученного из коллекции ВНИИГенетика, в совокупности с использованием в качестве источника углерода предварительно гидролизованной низкосортной древесины (ольха, осина, береза и т.д) позволяет решить поставленную задачу и достичь указанного технического результата - исключить из технологического процесса токсичное вещество и утилизировать низкосортную древесину с одновременным повышением эффективности культивирования, выраженным повышенным содержанием продуктов жизнедеятельности микроорганизмов.

Кроме предварительно гидролизованной низкосортной двевесины в качестве источника углерода могут быть использованы и другие предварительно гидролизованные целлюлозосодержащие субстраты.

Культивирование продуцента ксантана проводят в присутствии источников калия, фосфора, магния, кальция, органического и неорганического азота.

Для усиления получаемого технического результата в питательную среду дополнительно может быть добавлена органическая кислота.

Гидролиз низкосортной древесины может быть осуществлен путем обработки измельченной низкосортной древесины неорганической кислотой или ферментативным путем.

Поскольку процесс биотехнологического получения ксантана достаточно чувствителен к присутствию посторонней микрофлоры желательно проводить процесс в асептическом режиме.

Поскольку в ходе культивирования ксантана расходуются компоненты питательной среды, желательно в ходе культивирования культуры бактерий добавлять в ферментер питательную среду.

Разработанный способ осуществляют следующим образом.

В состав ферментационной среды для культивирования продуцента ксантана входят источник сахаров (упаренный гидролизат древесного сырья - УГДС), кукурузный экстракт (ростовой фактор), аммоний сернокислый, калий фосфорнокислый однозамещенный, магний сернокислый и вода.

Основным источником сахаров является отход - древесная щепа. Размер исходных частиц щепы варьирует в широком пределе и зависит от вида древесины. Гидролиз щепы может быть как кислотным, так и ферментативным. В любом варианте гидролиз проводят известным образом.

Выращивание посевного материала проводят на скошенной агаризованной среде.

В качестве среды для твердофазного культивирования используют агаризованный 2% агара бульон МПА с добавлением 2% стерильной глюкозы.

Полученную среду в асептических условиях разливают в стерильные пробирки с ватными пробками. Укладывают пробирки на валик для получения скошенной твердой среды. После остывания и затвердения агаризованной среды в пробирках пробирки помещают в термостат при температуре 37^°С на 5 суток для проращивания.

Через 5 суток отбирают визуально стерильные пробирки со скошенной агаризованной средой и производят в асептических условиях посев культуры продуцента ксантана микробиологической петлей с пробирки с культурой, проверенной на отсутствие контаминантов визульано и микроскопированием, хранящейся в холодильнике не более 20 суток.

Пробирки после посева помещают в термостат при температуре 27-28^°С на 24 часа.

Посевная среда для выращивания в колбах имеет следующий состав, г/л:

В асептических условиях посевную среду по 10 мл заливают в пробирки с культурой Xanthomonas campestris ВКПМ В-2228, полученные ранее, и производят смыв с поверхности агаризованной среды стерильной пипеткой. Среду с культурой Xanthomonas campestris ВКПМ В-2228 из пробирок асептически переносят в посевную среду Перемешивают и разливают по стерильным колбам емкостью 250 мл по 30 мл в каждую колбу. Приготовленные колбы устанавливают на качалке. Включают перемешивание на 380-400 об/мин и устанавливают температуру культивирования 26-28^°С. В установленном режиме колбы культивируют 24 часа.

Затем колбы снимают с качалки и в асептических условиях сливают посевной материал культуры бактерий Xanthomonas campestris ВКПМ В-2228 из каждой колбы в стерильную колбу с нижним тубусом, шлангом и зажимом на нем. Из этой колбы отбирают пробу усредненного посевного материала и осуществляют проверку посевного материала на отсутствие контаминантов микроскопированием и высевом на твердую питательную среду.

При культивировании продуцента ксантана Xanthomonas campestris ВКПМ В-2228 в биореактор, в котором находится 8 л стерильной УГДС, вносят ранее полученный посевной материал, а также ранее приготовленные стерильные растворы солей и ростового фактора. Включают подачу стерильного воздуха в биореактор. Процесс проводят при термостатировании и перемешивании содержимого биореактора. В процессе культивирования из биореактора периодически отбирают пробу на отсутствие контаминантов, оптическую плотность и содержание редуцирующих веществ (РВ, по глюкозе). По показаниям контрольного рН-метра корректируют значение рН в начальной ферментационной среде. При соблюдении всех вышеперечисленных условий, в асептических условиях присоединяют к биореактору колбу с 2 л посевного материала и переносят содержимое колбы в биореактор.

Затем осуществляют культивирование продуцента ксантана Xanthomonas campestris ВКПМ В-2228 в биореакторе.

В течение всего процесса культивирования из биореактора периодически отбирают пробу культуральной жидкости для контроля на отсутствие контаминантов, определения концентрации биомассы, ксанатана и концентрации остаточных РВ.

При необходимости проводят корректировки состава питательной среды.

Окончание процесса культивирования определяется по результатам анализа проб из биореактора на содержание РB и показаниям датчика измерения парционального давления растворенного кислорода. По окончании процесса культивирования культуральную жидкость сливают из биореактора через нижний штуцер в пластиковые канистры и культуральная жидкость поступает на стадию выделения ксантана.

Использование разработанного способа позволяет повысить содержание ксантана в культуральной жидкости на 0,4% при одновременном использовании в качестве источника углерода предварительно гидролизованной низкосортной древесины.