Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ Rhodococcus erythropolis ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ, ПОЧВЫ, БЕРЕГОВОЙ ЗОНЫ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ И ДОННЫХ ОТЛОЖЕНИЙ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ

Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения нового штамма бактерий, эффективного для очистки воды, донных отложений и береговой зоны водоемов от загрязнений нефтью в течение 3-40 суток в диапазоне температур от +4 до +25°C.

Известен нефтеокисляющий штамм бактерий Acinetobacter valentis subspecies paraffinicum (Патент RU 2053204 C1, C02F 3/34, E02B 15/04, публ. 27.01.1996), способный к деградации в широком диапазоне температур и pH. Недостатком данного штамма является неспособность деградировать ПАУ.

Известен штамм бактерий Rhodococcus species 56Д (Патент RU 2101352 С1, C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, публ. 10.01.1998), используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. Недостатком данного штамма является относительно низкий процент биодеструкции нефти (69,8%).

Известен штамм бактерий Pseudomonas putida BKM B-2380D (Патент RU 2344170 С2, C12N 1/20, C02F 3/34, C02F 101/32, В09С 1/10, публ. 20.01.2009), продуцирующий поверхностно-активные вещества при росте на полициклических ароматических углеводородах и углеводородах нефти, для деградации полициклических ароматических углеводородов и углеводородов нефти. Недостатком штамма является его чувствительность к температуре среды.

Задача изобретения - получение штамма бактерий, обеспечивающего эффективное разрушение нефти в воде, почве береговой зоны и в почвах, загрязненных нефтью и подвергавшихся выжиганию в диапазоне температур от +4°C до +25°C, активизация разрушения бензо(а)пирена в среде.

Штамм выделен в 2008 году из пробы загрязненной нефтью заболоченной почвы путем высева водного разведения испытуемой пробы методом предельных разведений аликвоты по 100 мкл на поверхность агаризованной среды Чапека. Далее выделенную культуру изучали с целью установления субстратспецифичности к нефтяным углеводородам путем исследования возможности использования штаммом в качестве единственного источника углерода нефти (смешанный образец нефтей, добываемых в Ненецком автономном округе). Авторское обозначение штамма КР-718 СО.2. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов, номер BKM Ac-2612D.

В классификации микроорганизмов по группам патогенности Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 от 1 мая 2008 г. «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» данный вид (род) не значится.

Штамм растет на агаризованной среде, которая может содержать жидкие алканы в качестве единственного источника углерода и характеризуется следующими морфологическими, культуральными и физиологическими признаками: грамположительные бактерии с морфологическим циклом от клеток с элементарным ветвлением в молодой культуре, палочки на стадии зрелой культуры и кокки в старой культуре. Колонии на питательном агаре округлой формы с ровными краями, выпуклые, непрозрачные, матовые, кремового цвета. Консистенция мягкая. Выделяемый в среду пигмент отсутствует, микобактины отсутствуют, кислотоустойчив. Аэроб, факультативный анаэроб. Выделяет в среду биосурфактанты.

Режим хранения штамма - длительное хранение в лиофилизированной форме в плотно запаянных стеклянных ампулах. Кратковременное хранение (для подготовки биомассы с целевым использованием) - периодические пересевы (1 раз в 2 месяца) с хранением выросшей чистой культуры на скошенном агаре среды следующего состава: на 1000 мл воды - пептон 5 г, NaNO₃ - 2,0 г; KH₂PO₄ - 1,0 г; KCl-0,5 г; MgSO₄×5H₂O - 0,5 г; агар микробиологический - 20,0; сахароза - 15,0; в закрытых пробирках в холодильнике при температуре не выше +6 и не ниже +1°C.

Условия культивирования. Среда для культивирования следующего состава: на 1000 мл воды - пептон 5 г, NaNO₃ - 2,0 г; KH₂PO₄ - 1,0 г; KCl - 0,5 г; MgSO₄×5H₂O - 0,5 г; сахароза - 15,0; алканы - 10 г, 15-25°C, pH 6,5-7,5. Условия культивирования - 15-25°C, 5 суток на шейкере при 220 об/мин.

Способность штамма к биодеструкции нефти и нефтепродуктов изучали в лабораторных опытах, результаты приведены в примерах ниже. Для исследования нефтеокисляющих свойств штамма проводили культивирование бактерии путем высева соскоба из пробирки на среду для культивирования. Титр клеток после культивирования не менее 10¹⁰/1 мл.

Пример 1. Исследование нефтеокисляющих свойств штамма Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2612D в водной среде

Для опытов готовили минеральную среду, содержащую на 1 л дистиллированной воды: NaNO₃ - 3,0 г; KH₂PO₄ - 1,5 г; KCl - 1 г; MgSO₄×5H₂O - 0,5 г. Среду разливали в колбы по 100 мл и стерилизовали. После остывания в колбы (кроме контроля) добавляли 1 мл препарата на основе Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2612D с исходным титром не менее 10¹⁰ кл/1 мл. В начале опыта титр живой культуры составлял 10⁸ кл/1 мл. В опытные колбы добавляли сырую нефть по 5 мл. Колбы устанавливали на качалку и выдерживали 5-7 суток при температуре (+20)-(-25)°C, затем проводили анализ состава остаточной нефти. В процессе опыта наблюдали эффект поверхностной активности во всех вариантах, куда был добавлен испытуемый штамм, что было обусловлено действием биосурфактантов, выделяемых штаммом, на нефтяные молекулы: нефть в колбах с препаратом на основе Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2612D не налипала на стенки и в течение короткого времени (в течение 1-2 часов после обработки при комнатной температуре) переходила в водный раствор. В контрольном варианте такого эффекта не наблюдали.

Анализ состава остаточной нефти через 5 суток опыта показал следующее. Массовая доля н-алканов в пробах снижается в присутствие испытуемого штамма на 89%, наиболее подвержены деструкции алканы с длиной цепи С15-С28, концентрация которых снизилась в среднем на 92%. Уровень растворенных углеводородов в водной среде также понижается с 15,7 мг/л до 1,26 мг/л за 5 суток. Общая концентрация (масса) нефти в присутствие штамма понизилась на 75%. Таким образом можно говорить о выраженных углеводородокисляющих свойствах штамма Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2612D и его перспективности для использования при очистке водных сред от углеводородов нефти.

Пример 2. Изучение скорости и эффективности разрушения нефти в почвах из зоны горельников

Одной из самых проблемных ситуаций после ликвидации последствий нефтеразливов является очистка экосистем после процедуры отжига нефти. Такой метод практикуют достаточно осторожно и, как правило, несанкционированно. Тем не менее, выжженные нефтезагрязненные участки не редкость. К зонам горельников можно отнести и тот грунт, который скапливается в подфакельных зонах. Грунт и почвы под воздействием высоких температур становятся практически стерильными и на долгие годы консервируются. В них крайне мала степень биологической активности, оцениваемая по численности микробиотов разных трофических групп, слаба ферментативная активность. И дело даже не столько в том, что в таких грунтах выгорает активная и потенциально эффективная аборигенная микробиота, способная принять участие в деструкции нефти со временем при развитии сукцессионных процессов. Основной причиной является особый состав нефти, остающейся после выжигания загрязненной почвы. В ней нет привычно доминирующих нормальных алканов, но аномально высоко содержание тяжелых ПАУ, а также смолистых веществ. Рекультивировать участки после термического воздействия (отжига) крайне сложно из-за высокой степени гидрофобности и токсичности субстратов, а получение вторичного товарного продукта (нефти) из шламов зон горельников не представляет практического интереса, поскольку процент потенциальных нефтепродуктов здесь очень мал. Такие шламы подвергают либо высокотемпературному (плазменному) отжигу, либо ищут способы их нейтрализации, либо захоранивают. Однако следует признать, что наиболее экологичным способом ликвидации последствий горения нефти на почве может быть подбор оптимальных мер биодеструкции на стадии биоремедиации почв и в первую очередь биопрепаратов, способных разрушать ПАУ, смолистые вещества, тяжелые парафины. С учетом выраженной гидрофобности почв и грунтов из зон горельников особое значение может иметь способность микроорганизмов выделять биосуфактанты в среду в процессе своей жизнедеятельности. В этой связи мы сочли возможным провести оценку эффективности очистки почв из зон горельников в присутствии исследуемого штамма Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2612D.

Почву для испытаний отбирали на одном из участков в Усинском районе Республики Коми через 8-10 лет после выжигания. Грунт подфакельной площадки также из Усинского района Республики Коми брали из зоны недействующего факела с глубины 40-80 см. Характеристика ПАУ в испытуемых почве и грунте, а также в сырой нефти приведена в таблице 1. Как видно, в пробах концентрация ПАУ значительно выше, чем в сырой нефти. Так, в пробах грунта из подфакельной зоны концентрация ПАУ в составе остаточной нефти в 10 раз выше, чем в сырой нефти, а в почве горельника превышает массовую долю от исходной нефти в 15 раз.

Пробы подфакельного грунта характеризовались исключительной гидрофобностью и практически не смачивались водой, в механическом составе преобладал песок. Пробы из зоны горельника были менее гидрофобны, механический состав был представлен смесью горелого торфа и глины.

Для оценки возможности деструкции ПАУ испытуемым штаммом Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2612D поставили 2 опыта.

Опыт 1. Пробы загрязненной почвы и грунта помещали по 10 г в колбы, добавляли 100 мл питательного минерального раствора (как в примере 1) и 10 мл суспензии культуры Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2612D с исходным титром 10¹⁰ кл/1 мл. Колбы ставили на качалку при комнатной температуре на 20 суток. Затем в содержимом колб анализировали ПАУ.

Опыт 2. Пробы загрязненной почвы и грунта выкладывали слоем 10 см с кюветы, увлажняли минеральным раствором (приготовлен, как в примере 1) из расчета 100 мл раствора на 1 кг почвы/грунта и вносили суспензию культуры Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2612D с исходным титром не менее 10¹⁰ кл/1 мл из расчета 10 мл суспензии на 1 кг почвы/грунта. Кюветы накрывали пленкой и ставили в холодильник при постоянной температуре +4°С на 60 дней. Затем анализировали ПАУ в испытуемых пробах.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 и 2 представлены результаты анализа проб до и после опытов при отличающихся условиях по температуре и среде инкубации. Фиг. 1 - изменение массовой доли ПАУ (мкг/г) при обработке почвы горельника раствором культуры Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2612D. Фиг. 2 - изменение массовой доли ПАУ (мкг/г) при обработке грунта подфакельной зоны раствором культуры Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2612D.

Обработка препаратом на основе культуры Rhodococcus erythropolis BKM Ас-2612D почвы горельника в водной среде в условиях интенсивной аэрации и при температуре (+20) -( +25)°С привела к существенному снижению массовой доли ПАУ за 20 суток (фиг. 1). Так, концентрация бензо(а)пирена в пробах почвы снизилась в 40 раз, а сумма ПАУ в 4,4 раза. Это дает основание полагать, что штамм может быть эффективен для очистки почв в зонах горельников на стадии рекультивации земель.

В условиях инкубирования обработанной исследуемым штаммом почвы при низкой (+4°С) температуре скорость разрушения ПАУ ниже. Так, снижение массовой доли бензо(а)пирена произошло в 10 раз за 60 суток экспозиции, общая концентрация ПАУ снизилась в 2,5 раза. Таким образом, в условиях холодного климата применение штамма также может быть перспективно при планировании работ по восстановлению нефтезагрязненных экосистем.

Испытание штамма Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2612D для деструкции ПАУ в грунтах, образующихся в подфакельных зонах, также показало перспективность изучаемой культуры (фиг. 2). Так, в условиях интенсивной аэрации при комнатной температуре сумма ПАУ в пробе грунта снижается в 4,2 раза, а массовая доля бензо(а)пирена в 36 раз. При низкой температуре экспозиции за 60 суток сумма ПАУ уменьшается в присутствие штамма в 2,6 раза, а доля бензо(а)пирена в 16 раз. Именно в отношении бензо(а)пирена исследуемая культура наиболее перспективна.

Полученные результаты позволяют заключить, что штамм Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2612D эффективен для разрушения нафтеновых углеводородов, полициклических соединений нефти, снижения массы растворенных в воде углеводородов и может применяться в широком диапазоне температур в различных экологических условиях для очистки водных сред и участков, подвергавшихся выжиганию после нефтяных загрязнений. Поскольку для эффективной деструкции штамм нуждается в достаточном количестве увлажнения и работает в водных средах заметно эффективнее, чем в почвенных системах, можно говорить о его перспективности при очистке береговой зоны водных объектов, пострадавших в результате нефтяных разливов и донных отложений водоемов.