Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ Rhodococcus erythropolis ДЛЯ ОЧИСТКИ СОЛОНОВАТОВОДНЫХ И МОРСКИХ ЭКОСИСТЕМ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ

Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения нового штамма бактерий, эффективного для очистки от нефти пресноводных, солоноватоводных и морских экосистем в диапазоне температур от +2 до +25°C и солености среды до 27 г/л.

Известен штамм бактерий Pseudomonas putida BKM В-2380Д, продуцирующий поверхностно-активные вещества, для деградации полициклических ароматических углеводородов и углеводородов нефти. Обладает высокой деструктивной активностью в отношении полициклических ароматических углеводородов и нефти, а также способен продуцировать поверхностно-активные вещества, повышающие биодоступность гидрофобных соединений, входящих в состав нефти (Патент RU 2344170 С2, C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, 10.03.2006, опубл. 20.01.2009). Недостатком штамма является его чувствительность к температуре окружающей среды.

Известен способ очистки водных поверхностей от нефтяного загрязнения (Патент RU 2241032 С2, C12N 1/20, C02F 3/34, опубл. 27.11.2004 (аналог), когда в загрязненную нефтью и нефтепродуктами воду вносят бактериальную культуру, представляющую собой консорциум клеток микроорганизмов Bacillus brevis ИБ ДТ 5-1 и Arthrobacter species ИБ ДТ 5-3 в виде культуральной жидкости с общим титром не менее 10⁸ КОЕ/мл и проводят аэрацию водной среды. Недостатком способа является необходимость дополнительной аэрации среды и чувствительность используемых штаммов к температуре.

Известен штамм бактерий Rhodococcus species MFN, депонирован в ВКПМ под АС-1558, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов (Штамм бактерий Rhodococcus species MFN, депонирован в ВКПМ АС-1558, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов (патент RU 2133769 C1, C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/20, C12R 1:01, 1998 г., опубл. 27.07.1999 (прототип).

Несмотря на то, что штамм относительно быстро утилизирует нефть, мазут, дизельное топливо и керосин при температуре от 10°C до 28°C, а также утилизирует нафталин, тетрадекан, пентадекан, гексадецен, фенилдекан и прислан, данные по утилизации бензо(а)пирена для штамма отсутствуют, опыты для температуры ниже +10°C не проводились.

Задача изобретения - получение штамма бактерий, обеспечивающего деструкцию нефти в водных объектах при температуре от +2 до +25°C и солености до 27 г/л.

Штамм Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2613D выделен в 2010 году из накопительной культуры пробы загрязненного нефтью донного грунта солоноватоводного озера в Архангельской области с глубины 1 м в зоне хронического нефтяного загрязнения. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов, номер BKM Ac-2613D.

В классификации микроорганизмов по группам патогенности Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 от 1 мая 2008 г. «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» данный вид (род) не значится.

Штамм растет на агаризованной среде, содержащей жидкие алканы в качестве единственного источника углерода, и характеризуется следующими морфологическими, культуральными и физиологическими признаками: грамположительные бактерии с морфологическим циклом от клеток с элементарным ветвлением в молодой культуре, палочки на стадии зрелой культуры и кокки в старой культуре. Колонии на питательном агаре округлой формы с ровными краями, выпуклые, непрозрачные, матовые, розоватого цвета. Консистенция мягкая. Выделяемый в среду пигмент отсутствует, микобактины отсутствуют, кислотоустойчив. Аэроб, факультативный анаэроб, галотолерантный психрофилл.

Режим хранения штамма - длительное хранение в лиофилизированной форме в плотно запаянных стеклянных ампулах. Кратковременное хранение (для подготовки биомассы с целевым использованием) - периодические пересевы - 1 раз в 2 месяца с хранением выросшей чистой культуры на скошенном агаре среды следующего состава: на 1000 мл воды - пептон 5 г, NaNO₃ - 2,0 г; KH₂PO₄ - 1,0 г; KCl - 0,5 г; MgSO₄×5H₂O - 0,5 г; агар микробиологический - 20,0; сахароза - 15,0; в закрытых пробирках в холодильнике при температуре не выше +6 и не ниже +1°C.

Культивирование штамма Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2613D проводят на стерильной питательной среде следующего состава: на 1000 мл воды - пептон 5 г, NaNO₃ - 2,0; NaCl - 10 г; KH₂PO₄ - 1,0 г; KCl - 0,5 г; MgSO₄×5H₂O - 0,5 г; сахароза - 15,0; алканы - 10 г, pH 6,5-7,5. Наработку биомассы проводят на качалке при 15-25°C, 220 об/мин, в течение 3-5 суток.

Способность штамма к биодеструкции нефти изучали в лабораторных опытах с пресной и соленой водой при отличающейся температуре и солености среды, результаты приведены в примере.

Пример 1. Деструкция нефтяных соединений в присутствии рабочего раствора культуры штамма Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2613D при отличающихся температуре и солености водной фазы.

Для опытов приготовили рабочую суспензию препарата из изучаемого штамма Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2613D следующим образом. На 1 литр дистиллированной воды добавляли на 1000 мл воды - пептон 5 г, NaNO₃-2,0; NaCl - 10 г; KH₂PO₄ - 1,0 г; KCl - 0,5 г; MgSO₄×5H₂O - 0,5 г; сахароза - 15,0 г, алканы - 10 г, pH 6,5-7,5. Раствор разливали по 100 мл в колбы на 250 мл и стерилизовали при 0,6 ати в течение 1 часа. После остывания содержимое колб заражали путем переноса на прокаленной микробиологической петле соскоба из пробирки чистой культурой исследуемого штамма. Колбы устанавливали на качалку при комнатной температуре на 3 суток. Титр клеток препарата на основе исследуемого штамма в колбах через 3 суток составлял 10¹⁰ на 1 мл. Для опытов брали по 1 мл наработанной культуры и заражали опытные колбы со стерильными растворами с разными уровнями солености воды по хлоридно-натриевому загрязнению. Титр клеток живой культуры в начале опыта во всех вариантах опыта составлял 10⁸. Контрольную колбу с пресной водой не заражали. Нефть добавляли по 2 мл в каждую колбу.

Варианты опыта приведены в таблице 1. Длительность опыта для температур +10 и +2°C была 10 суток, для температуры +25 для пресной и соленой воды составил 5 суток.

По истечении опыта анализировали массовую концентрацию и структуру алкановой фракции остаточной нефти.

Краткое описание фигур.

На Фигуре 1 представлен график структуры н-алканов по истечении времени экспозиции.

Как видно на Фигуре 1, все опытные варианты отличались от контроля довольно выраженной результативностью в отношении разрушения алканов, причем наиболее ярко эта активность проявилась в пресной среде при нормальной (+25°C) температуре. Здесь снижение массовой доли алканов составило 87% от исходного (вариант 1). При температуре +2°C этот показатель также высок и составляет в пресной среде 75% (вариант 2), при солености 27 г/л (вариант 4) он снижается до 54%, а при температуре +10°C при солености 27 г/л составляет 68% (вариант 3).

Полученные данные позволяют сделать вывод о высокой степени активности штамма Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2613D в отношении деструкции алкановой фракции нефти как при нормальных условиях, так и при низкой, до +10 - +20°C, температуре среды и при увеличении солености до 27 г/л.

Изучение концентрации ПАУ показало, что штамм также активно способен разрушать полиароматические соединения нефти. Как видно из результатов, представленных в таблице 2, где показан анализ ПАУ в вариантах Контроль (0) и Rhodococcus erythropolis BKM Ac-2613D t+25°C пресная вода (2) сумма ПАУ в опыте уменьшается за 5 суток почти в 14 раз. Обращает на себя внимание снижение массы бензо(а)пирена в присутствии исследуемого штамма - в 12 раз, что говорит о перспективности штамма для очистки субстратов после выжигания нефти, которое, как известно, приводит к резкому возрастанию концентрации опасных ксенобиотиков в среде.

Оценка изменения в водной фазе растворенных углеводородов в опыте при нормальных условиях показала (таблица 3), что концентрация растворенных углеводородов возрастает в опыте сразу после внесения микробной массы в нефтеводную среду, что может говорить о выработке штаммом поверхностно-активных веществ - биосурфактантов, обеспечивающих практически мгновенное изменение физических свойств нефти. Последующее увеличение в опыте массы растворенных углеводородов может являться следствием разрушение более сложных соединений до простых, которые способны переходить в растворенное состояние. В природных условиях растворенные углеводороды достаточно быстро усваиваются другими группами нефтеокисляющих микроорганизмов.

Как видно из таблицы 3, штамм также снижает концентрацию в остаточной нефти массы смолисто-асфальтовых веществ, которые как правило накапливаются в донных отложениях и достаточно тяжело подвергаются разрушению в природных средах.

Таким образом, достигнут технический результат очистки водных сред от нефти в широком диапазоне температуры и солености до 27 г/л, а также для очистки массы донных отложений от ПАУ и гетероциклических соединений.