Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ ИЗ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА

Изобретение относится к биохимии, а именно, к выделению белков из клеток костного мозга трубчатых костей животных.

Описан способ получения белка, RU 2041716 C1, A61K 35/28, 20.08.1995, известного как миелопид, путем выделения клеток из костного мозга свиньи, их культивирования в питательной среде, отделения супернатанта центрифугированием, концентрирования и выделения целевого продукта гельхроматографией на колонке, заполненной сефадексом G-50. Фракции, элюированные в области выхода цитохрома G с молекулярной массой около 13000 Da, концентрируют лиофилизацией.

Известен также способ получения белка, RU 2298939 C2, A61K 35/28, 20.05.2007, путем выделения клеток их костного мозга лисиц, их суспендирование, фильтрацию, центрифугирование фильтрата, после которого осадки вместе с надосадочными жидкостями в центрифужных пробирках подвергают трехкратному замораживанию-оттаиванию в холодильной камере, фильтрации через капроновые фильтры и осаждению 10% раствором трихлоруксусной кислоты и последующему диализу проточной водой.

Недостатки данных способов заключаются в трудоемкости, длительности во времени и соблюдении особых условий белкового синтеза. Кроме того, конечный продукт получается недостаточно чистым.

Упрощение способа выделения общего белка из трубчатых костей костного мозга и повышение чистоты целевого продукта достигаются тем, что клетки костного мозга берут у сельскохозяйственных и диких животных. Трубчатые кости отделяют от плоти. Клетки костного мозга из бедренной или плечевой кости суспендируют путем вымывания через созданные отверстия с помощью шприца средой Игла М в колбу. Содержимое колбы тщательно перемешивают до однородного состава пипетированием. Полученные клетки суспензии пропускают через капроновые фильтры для тщательной очистки от желтого костного мозга и отмывают 3 раза охлажденной средой Игла М. Фильтрат подвергают центрифугированию в течение 5-7 мин при 3 тыс. об/мин, затем пипеткой с надосадочной жидкости снимают остатки желтого костного мозга. Далее осадки с надосадочными жидкостями подвергают гомогенизации, в результате которого достигается разрушение клеточных стенок осадка из костного мозга (который затем отбрасывают) и происходит дополнительное высвобождение белковых молекул в надосадочную жидкость, что влияет на выход конечного продукта. Для выделения белка и освобождения от обломков клеток содержимое центрифужных пробирок фильтруют через капроновые фильтры. Из осадка делают мазки, окрашивают по общепринятым методикам и просматривают под микроскопом - клетки в них не обнаруживаются (гомогенная масса), следовательно, все биологически активные вещества переходят в раствор.

Выделение общего белка проводят следующим образом.

В пробирки для центрифугирования с раствором белков добавляют раствор сульфата аммония из расчета 6 частей раствора белка 3 части раствора соли. Для лучшего осаждения белков содержимое стаканов нагревают до температуры 40-60°C (в том случае если белки осаждаются плохо). Экстракты для полного осаждения оставляют на 12 часов в холодильнике при температуре +4°C. К надосадочной жидкости добавляют 1% раствор трихлоруксусной кислоты, вследствие чего происходит дополнительное осаждение белка и увеличивается вес общего белка, выделенного из костного мозга. Осадок белков отделяют от раствора центрифугированием при 2000 об/мин в течение 5 минут - все перечисленные приемы, их экспозиции и режимы установлены экспериментально, благодаря которым осуществляется наиболее полноценно данный способ и конечный результат, т.е. более полное осаждение и отделение белка костного мозга от раствора. Осадки смывают небольшим количеством спирта, затем эфира и переносят на часовое стекло для высушивания. Полученные таким образом белки для дальнейшей очистки подвергают диализу с целью полного удаления растворов сульфата аммония и трихлоруксусной кислоты и восстановления гидратных оболочек пептида. Для этого раствор белка помещают в емкость, отделенную от низкомолекулярного раствора (проточная либо дистиллированная вода) коллодийной пленкой. Диализ проводят проточной водой в течение 1-2 суток при непрерывной подаче и дистиллированной водой в течение 1-2 часов. Отсутствие соли контролируют нейтральной реакцией с индикатором.

Пример 1.

Бедренные кости от 6 коз отделяют от плоти, затем проводят распил кости с двух сторон в центре и вымывают костное содержимое средой Игла М в колбу. Клеточные суспензии фильтруют через капроновые фильтры, которые предварительно стерилизуют. Фильтрат центрифугируют в течение 7-10 минут при 3 тыс. об/мин. Осадок и надосадочную жидкость подвергают гомогенизации с помощью гомогенизатора типа Mini Mix 100VW в течение 12-15 минут. Впоследствии проводят подсчет клеток суспендированного осадка средой Игла М в разведении 1:10 в камере Горяева, в осадке обнаруживается гомогенная масса. Содержимое центрифужных пробирок вновь фильтруют через капроновые фильтры. Белки осаждают из раствора путем высаливания раствором сульфата аммония из расчета на 6 частей раствора белка 3 части сульфата аммония, оставляют отстаиваться на 12 часов. Осадок от раствора отделяют центрифугированием при 2000 об/мин в течение 5 минут. К надосадочной жидкости добавляют 1% раствор трихлоруксусной кислоты, затем также осадок от раствора отделяют центрифугированием при 2000 об/мин в течение 5 минут. Осадки смывают спиртом и эфиром, высушивают на часовом стекле, взвешивают.

Вес общего белка, выделенного из костного мозга коз, составляет 206±0,34 мг. Белок представляет собой сухой аморфный порошок светло-коричневого цвета.

Пример 2.

Трубчатые кости от 4 сибирских косуль отделяют от плоти. Подготовку костного содержимого к выделению белка проводят, как описано в предыдущем примере. Белки из раствора осаждают путем высаливания сульфатом аммония из расчета на 6 частей раствора белка 3 части сульфата аммония.

Содержимое колбы нагревают до температуры 40-60°C, оставляют на 12 часов в холодильнике при температуре +4°C. В колбе наблюдаются обильные хлопья осажденного белка. К надосадочной жидкости добавляют 1% раствор трихлоруксусной кислоты, затем также осадок от раствора отделяют центрифугированием при 2000 об/мин в течение 5 минут. Осадок обрабатывают и высушивают, как описано выше. Вес общего белка из мозгового вещества сибиркой косули, выделенных данным способом, составляет 208±0,28 мг. Белок представляет собой аморфный порошок красно-коричневого цвета.

(В примерах 1 и 2, так же как и в примере 3, технические операции по получению белков костного мозга одинаковы и процесс диализа в них также осуществляется для дополнительной очистки при их дальнейшем использовании, однако как проводится диализ описано только в третьем примере, чтобы не повторяться и разнообразить пример).

Пример 3.

Трубчатые кости от трех лосей отделяют от плоти. Вымывание клеточных популяций, избавление от жировых прослоек и выделение белка проводят, как описано в предыдущих примерах. Вес общего белка из костного мозга лося составляет 219±0,53 мг. Сухой кристаллический белок костного мозга лося переводят в раствор. Для этого берут 0,05 г белка и добавляют 0,45 мл 0,9% раствора хлорида натрия, тщательно перемешивают. Раствор белка подвергают диализу, поместив в емкость с коллодийной пленкой. Данную емкость ставят в чашу с проточной водой, которая подается непрерывно через шланг. Диализ в проточной воде протекает сутки (pH 8,0-8,5). Затем в дистиллированной воде диализ протекает в течение двух часов (нейтральная реакция индикатора). Содержание общего белка определяют с помощью биохимического анализатора типа Chem-7.

Отличительным преимуществом предлагаемого способа выделения белков из трубчатых костей костного мозга является доступность, сокращение времени экстракции белка, использование новых технологий, увеличение веса целевого продукта.