Результат интеллектуальной деятельности: ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ СЕЛЕКТИВНОГО НАКОПЛЕНИЯ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ, СУХАЯ (БУЛЬОН МОССЕЛЯ), ВАРИАНТЫ

Изобретение относится к санитарной и клинической микробиологии и может быть использовано для селективного накопления энтеробактерий из воды, пищевых продуктов, клинического материала и т.д.

Ведущие зарубежные фирмы: Merck «Микробиология», 2004-2005 стр.202; HiMedia (HiMedia Laboratories Pvt. Limited (Индия), 1993, стр.80; и ООО «ГЕМ» «Среды бактериологические». Каталог 2009-2010, стр.48, выпускают накопительный бульон для энтеробактерий по Мосселю на основе панкреатического гидролизата желатина или пептона мясного. Компонентное содержание в г/л представлено в табл.1.

Для бактериологического контроля в соответствии с Государственной Фармакопеей Российской Федерации, XII издание, регламентирующей перечень питательных сред для селективного обогащения энтеробактерий, предусмотрен бульон Мосселя (Enterobacteria Enrichment Broth-Mossel) ОФС 42-0067-07.

Селективное накопление всех видов энтеробактерий в бульоне Мосселя обусловлено тем, что высокая концентрация бычьей желчи в совокупности с бриллиантовым зеленым подавляет рост сопутствующей микрофлоры, а глюкоза способствует росту энтеробактерий. Натриево-калийные фосфаты обеспечивают большую буферную емкость в среде, что защищает культуру от губительного действия образующейся кислоты.

До настоящего времени в России в связи с отсутствием отечественной коммерческой сухой питательной среды для селективного обогащения энтеробактерий в практике клинической и санитарной микробиологии используется бульон Мосселя лабораторного приготовления, а для контроля микробиологической чистоты лекарственных сред - среда №3 (среда обогащения для бактерий семейства Enterobacteriaceae).

Недостатками бульона Мосселя лабораторного изготовления в соответствии с рецептурой, представленной в ГФ, XII издание, и среды №3 являются:

- сложность приготовления;

- использование в качестве элективного фактора неочищенной желчи крупного рогатого скота - вещества химически неопределенного состава, затрудняющего получение объективных результатов;

- отсутствие отечественных сухих препаратов - пептона и желчи, обладающих высокой степенью прозрачности в растворах;

- необходимость фильтрации в случае использования основных компонентов среды отечественного производства, как дополнительный этап в процессе приготовления;

- слабая ингибирующая способность в отношении сопутствующих грамположительных микробов ассоциантов при обеспечении роста энтеробактерий;

- увеличение себестоимости среды в случае необходимости использования импортных препаратов.

Наиболее близким к предлагаемому бульону Мосселя является коммерческий бульон Мосселя (Merck), который состоит из следующих компонентов, г/л:

Недостатком коммерческой среды (Merck) является:

- недостаточная эффективность при росте и селективном накоплении ряда энтеробактерий;

- недостаточно выраженные ингибирующие свойства в отношении микробов-ассоциантов;

- ограниченная доступность.

Задачей изобретения является создание отечественной сухой питательной среды для селективного накопления энтеробактерий, обладающей большей эффективностью, с более высокими селективными свойствами, обеспечивающей доступность и получение объективных результатов бактериологического контроля.

Поставленная задача решается тем, что предлагается питательная среда для селективного накопления энтеробактерий, сухая, содержащая белковую основу, глюкозу, калий фосфорнокислый однозамещенный и бриллиантовый зеленый, причем в качестве белковой основы она содержит панкреатический гидролизат рыбной муки, либо пептон мясной, либо панкреатический гидролизат рыбной муки и пептон мясной (в соотношении 1:1), желчь очищенную модифицированную (ЖОМ) и натрий хлористый при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:

Вариант первый:

Вариант второй:

Вариант третий:

Технический результат достигается за счет предварительной подготовки сырой желчи. С этой целью нативную желчь КРС кипятят и фильтруют через фильтровальную ткань (бельтинг) в изоэлектрических точках, при каждом значении pH, с целью осаждения белков и высокомолекулярных пептидов. Заключительный этап подготовки желчи состоит из адсорбции примесей активным углем, внесения расчетного количества двузамещенного фосфата натрия в пересчете на содержание сухих веществ, кипячения и фильтрации. Это позволяет исключить дополнительное внесение фосфата натрия в состав среды, обеспечивая высокую буферную емкость готовой среды и ее прозрачность. Сбалансированность компонентного состава среды, включая панкреатический гидролизат рыбной муки (ПГРМ), в качестве белковой питательной основы, обеспечивает хорошие ростовые и селективные свойства бульона Мосселя.

Способ получения бульона Мосселя предусматривает смешивание сухих компонентов, г/л:

Панкреатический гидролизат рыбной муки или пептон мясной обеспечивают ростовые потребности микроорганизмов в азотистом питании. Предварительная подготовка желчи КРС позволяет получить сухую желчь очищенную модифицированную (ЖОМ), обеспечивающую высокую буферную емкость и прозрачность готовой питательной среды, ингибирующие свойства в отношении нежелательной сопутствующей бактериальной флоры и селективное накопление энтеробактерий, не угнетаемое в результате образования кислых продуктов жизнедеятельности.

Отличием предлагаемой среды от прототипа является возможность использования наряду с пептоном мясным панкреатического гидролизата рыбной муки в качестве белковой основы. Технология подготовки сырой желчи с использованием натрия фосфорнокислого двузамещенного исключает дополнительное внесение его в среду. Количественное соотношение компонентов питательной среды, ее pH, обеспечивают среде сохранение хороших ростовых свойств, эффективность накопления энтеробактерий и ингибирующий эффект в отношении сопутствующей микрофлоры. Готовая среда сохраняет стерильность не менее 10 суток

Для достижения технического результата на стадии производства желчи очищенной модифицированной (ЖОМ) желчь после осаждения белков в изоэлектрических точках, адсорбции примесей активным углем с внесением двузамещенного фосфата натрия из расчета 12,0 г на каждые 20,0 г желчи, в пересчете на сухое вещество, сушат на сушильной установке в виброкипящем слое А1-ФМУ.

Пример 1. Для приготовления среды по первому варианту берут навески следующих ингредиентов, г/л:

Навески размешивают в 1 л дистиллированной воды, разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют автоклавированием при температуре 121°C в течение 5 мин.

Предлагаемая среда, прозрачная, зеленого цвета, обеспечивает рост и накопление следующих тест-штаммов семейства Enterobacteriaceae при посеве по 0,5 мл микробной взвеси из разведения 10^-7:

E. coli 25922

E. coli O55:K59 3912/41

S. flexneri 1a 8516

S. typhimurium 79

K. pneumonia 418

K. pneumonia 3534/51

Предлагаемая среда в значительной степени ингибирует рост грамположительных микроорганизмов, в частности S. aureus Wood-46, из разведения 10^-1.

Используемые для контроля среды тест-штаммы микроорганизмов получены из отдела коллекционных культур ФБУН ГНЦ ПМБ.

Готовят стандартную взвесь культуры каждого тест-штамма, соответствующую 10 единицам по стандартному образцу мутности ОСО 42-28-85 П, с использованием стерильного 0,9% раствора натрия хлористого. Полученные взвеси культур десятикратными разведениями (4,5 мл 0,9% раствора натрия хлорида с 0,5 мл микробной взвеси) доводят до разведения 10^-7 (для S. aureus Wood-46 - до разведения 10^-1) и используют для контроля среды.

Для определения ростовых свойств засев производят по 0,5 мл микробной взвеси каждого из тест-штаммов из разведения 10^-7 в 5,0 мл бульона Мосселя, т.е. 10 м.к./мл среды. Посевы инкубировали при температуре (37±1)°C в течение 20-24 ч. Результаты биологического контроля лабораторных образцов бульона Мосселя на наборе тест-штаммов представлены в таблице 2.

Пример 2. Среду готовят в соответствии с примером 1.

Результаты биологического контроля представлены в таблице 2 и аналогичны результатам проверки по примеру 1.

Пример 3. Среду готовят в соответствии с примером 1.

Результаты биологического контроля представлены в таблице 2 и аналогичны результатам проверки по примеру 1.

Пример 4. Для приготовления бульона Мосселя в соответствии со вторым вариантом берут навески следующих ингредиентов, г/л:

Навески размешивают в 1 л дистиллированной воды, разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют автоклавированием при температуре 121°C в течение 5 мин.

Результаты биологического контроля представлены в таблице 3 и аналогичны результатам проверки примеров 1, 2, 3 по варианту 1.

Пример 5. Среду готовят в соответствии с примером 4.

Результаты биологического контроля представлены в таблице 3 и аналогичны результатам проверки примеров 1, 2, 3 по варианту 1.

Пример 6. Для приготовления бульона Мосселя в соответствии с третьим вариантом берут навески следующих ингредиентов, г/л:

Навески размешивают в 1 л дистиллированной воды, разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют автоклавированием при температуре 121°C в течение 5 мин.

Результаты биологического контроля бульона Мосселя в соответствии с вариантом 3 представлены в таблице 3 и аналогичны результатам проверки по примерам 1, 2, 3.

Пример 7. Среду готовят в соответствии с примером 6.

Результаты биологического контроля представлены в таблице 3 и аналогичны результатам проверки по примерам 1, 2, 3.

Пример 8. Среду готовят в соответствии с примером 1.

Результаты биологического контроля представлены в таблице 2.

Оценка качества предлагаемой среды для селективного накопления энтеробактерий с нарушением количественного соотношения ингредиентов:

Пример 9. Среду готовят в соответствии с примером 1.

Результаты биологического контроля представлены в таблице 2. Нарушение количественного соотношения ингредиентов среды в примерах 8, 9 ведет к ухудшению ростовых, ингибирующих свойств и, как следствие, снижению коэффициента эффективности накопления энтеробактерий.

Из таблиц сравнительных характеристик биологического контроля (табл.2, 3) видно, что предлагаемая питательная среда в соответствии с примерами 1-7 обладает хорошими ростовыми свойствами, эффективна в накоплении энтеробактерий и подавляет рост стафилококка.

Визуальный учет результатов накопления энтеробактерий по окончании срока инкубации посевов показал идентичные результаты в испытуемых и контрольной средах.

Изменение количественного соотношения компонентов среды ведет к нарушению биологических показателей качества предложенной среды.

Так, в случае приготовления среды в соответствии с примерами 8, 9 наблюдается снижение эффективности накопления энтеробактерий и ингибирующего эффекта среды в отношении S. aureus Wood-46.

Для получения данных по показателю эффективности бульона Мосселя засеянные пробирки каждого тест-штамма, содержащие около 10 м.к./мл - (нулевой посев) инкубировали при температуре (37±1)°C в течение 3 ч. Для определения посевной дозы 0,1 мл микробной взвеси каждого тест-штамма из разведения 10^-7 высевали на чашки Петри с ГРМ агаром. После инкубации посевов в накопительной среде содержимое пробирок перемешивали и производили аналогичный высев на ГРМ агар.

Через 18-20 часов инкубации посевов на ГРМ агаре при температуре (37±1)°C производили подсчет сформировавшихся колоний. Показатель эффективности рассчитывали по приросту числа колоний после инкубации культуры в накопительной среде к числу колоний при нулевом посеве.

Сравнительная характеристика эффективности бульона Мосселя по варианту 1 представлена в таблице 3. Результаты эффективности накопления энтеробактерий бульона Мосселя, приготовленного в соответствии вариантами 2, и аналогичны и сопоставимы с результатами, полученными при испытании бульона Мосселя, вариант 1.

Таким образом, разработана отечественная конкурентоспособная сухая питательная среда для селективного обогащения энтеробактерий, имеющая ряд преимуществ:

эффективность накопления энтеробактерий в 1,5-2,0 раза выше, чем в коммерческой среде;

коэффициент ингибиции в отношении стафилококка более чем в 100 раз превышает показатель коммерческого накопительного бульона;

питательная среда проста в приготовлении;

разработана технология осветления желчи в изоэлектрических точках с использованием активного угля и двузамещенного фосфата натрия, исключающая дальнейшее внесение его в питательную среду, обеспечивающая прозрачность готового препарата;

исключена необходимость использования безводного натрия фосфорнокислого двузамещенного при изготовлении сухого препарата;

возможность использования панкреатического гидролизата рыбной муки наряду с пептоном мясным при сохранении ростовых и селективных свойств;