Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВАГИНИТА У ЖЕНЩИН РЕПРОДУКТИВНОГО ВОЗРАСТА ПО УРОВНЮ ЭКСПРЕССИИ мРНК ГЕНОВ ЦИТОКИНОВ ВО ВЛАГАЛИЩНЫХ МАЗКАХ

1. Область техники

Изобретение относится к области медицины, акушерства, гинекологии, иммунологии и молекулярной биологии и может быть использовано для определения локальной воспалительной реакции во влагалище (диагностика неспецифического вагинита) у женщин репродуктивного возраста.

2. Уровень техники

Вагинит - воспаление слизистой оболочки влагалища, является одной из наиболее частых причин обращения женщин для консультации к врачу акушеру-гинекологу. Согласно данным IUSTI 2011 года (International Union against Sexually Transmitted Infections) основными причинами инфекционно-воспалительных заболеваний влагалища являются бактериальный вагиноз (22-50%), вульвовагинальный кандидоз (17-39%) и трихомониаз (4-35%), а также аэробный вагинит [Sherrard J.]. В последние годы в России отмечена тенденция к снижению доли специфических вагинитов, обусловленных абсолютными патогенами (Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, Treponema pallidum, Mycobacterium tuberculosis и Chlamydia trachomatis). При этом все большее распространение приобретают неспецифические вагиниты, обусловленные условно-патогенными микроорганизмами (УГГМ), такими как грибы, стрептококки, стафилококки, кишечная палочка, а также облигатные анаэробы [Серов В.Н., Eckert L.O., Owen М.К.]. В норме в составе биоценоза доминируют лактобактерии, а УПМ представлены в незначительном количестве. Сдвиг баланса микробиоты в сторону увеличения доли УПМ приводит с дисбиотическим состояниям, которые характеризуются разнообразием клинических проявлений: от бессимптомного носительства до клинически выраженных признаков воспаления.

На сегодняшний день единственным лабораторным методом оценки воспалительной реакции и состояния локального иммунитета служит микроскопический метод подсчета количества лейкоцитов в поле зрения бинокуляра в нативном материале. Обнаружение во влагалищных мазках более 10 лейкоцитов в поле зрения микроскопа (более 20 у беременных женщин) является признаком воспаления. Установление более точных маркеров, описывающих состояние локального иммунитета, является крайне актуальным.

Известно, что персистирование патогенных и условно-патогенных микроорганизмов на слизистой влагалища приводит к стимуляции клеток иммунной системы и эпителия, что проявляется в изменении профиля цитокинов, экспрессируемых клетками. При взаимодействии высококонсервативных структур микроорганизмов с паттерн-распознающими рецепторами, прежде всего толл-подобными рецепторами ТЛР-2, ТЛР-4 на поверхности макрофагов, дендритных и других клетках врожденного иммунитета, происходит активация синтеза ряда провоспалительных цитокинов (ФНО-а, ИЛ-1в, ИЛ-6, IL-8, IL-12) [Долгушина В.Ф., Medzhitov R.]. Вместе с тем научные разработки, полученные в отношении диагностической и прогностической значимости иммунологических показателей в алгоритме диагностики воспалительных состояний влагалища на сегодняшний день не нашли широкого применения [Campos A. et. al., 2012; Hickey D. et. al., 2011].

В данном патенте предложен метод определения локальной воспалительной реакции, необходимой для верификации диагноза вагинит. К преимуществам предложенного способа диагностики локального воспаления с помощью определения экспрессии мРНК генов цитокинов можно отнести возможность одновременного исследования полученного биоматериала на наличие абсолютно и условно-патогенных микроорганизмов с помощью метода полимеразной цепной реакции, который все чаще применяется для установления этиологического агента заболевания. Предложенный метод может быть полностью автоматизирован.

Предложенный способ определения локальной воспалительной реакции может быть особенно актуальным в тех случаях, когда этиологический агент заболевания остается неустановленным. По данным литературы до 30% случаев заболевания могут быть представлены вагинитами неясного генеза [Anderson M.R.].

Из данных зарубежной литературы патентов и патентных заявок на использование измерения уровня мРНК цитокинов во влагалищных мазках для диагностики вагинитов не известно. Наиболее близким аналогом является следующий патент:

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИЙ ВЛАГАЛИЩА (патент РФ №2391664 С2) от 10.06.2010 г. Изобретение относится к медицине, в частности к дерматовенерологии и гинекологии. Предложен способ ранней иммунодиагностики вульвовагинальных инфекций. Диагностику инфекций влагалища проводят путем установления клинических признаков, определения количества лейкоцитов, эпителия, лактобактерий, проведения pH-метрии вагинального отделяемого и аминотеста. Дополнительно исследуют секреторный иммуноглобулин A (sIgA) и при его значении 200,5±26,3 диагностируют аэробный вагинит. При значении sIgA 168±29,9, pH более 5,6-6,0 и положительном аминотесте диагностируют бактериальный вагиноз. При значении sIgA 172,1±53,2, pH, не превышающем 6,2, и наличии лейкоцитов в присутствии трихомонад диагностируют трихомониаз. При значении sIgA 375,61±23,1, pH 4,0-4,5 и отрицательном аминотесте диагностируют кандидоз, значение sIgA 248,4±18,8 соответствует отсутствию инфекций.

3. Описание изобретения

Предложен способ диагностики вагинита путем оценки уровня мРНК определенных генов цитокинов в клетках вагинальных соскобов.

В частности, предложен способ диагностики вагинитов у женщин репродуктивного возраста путем определения индексов отношений уровней экспрессии мРНК генов TLR4/GATA3 и TNF/L18.

В клетках влагалищных соскобов женщин репродуктивного возраста с вагинитами грибковой, бактериальной и смешанной грибково-бактериальной этиологии по сравнению с контрольной группой существенно возрастает относительное количество мРНК генов TLR4 и TNF и снижается относительное количество IL18 и GATA3.

Для оценки уровня представленности мРНК исследуемых генов в мазках используются методы обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) с регистрацией накопления продуктов реакции в режиме «реального времени».

На основании экспериментальных данных при сравнении женщин с неспецифическими вагинитами грибковой, бактериальной и смешанной грибково-бактериальной этиологии и условно-здоровых женщин без признаков воспалительных заболеваний органов женской репродуктивной системы были получены и проанализированы результаты с применением методов математической статистики (бинарная логистическая регрессия), выбрана линейная функция, позволяющая вычислить вероятность наличия заболевания.

Уравнение функции имеет вид:

z=l,4*ln([TLR4]/[GATA3])+l,3*ln([TNF]/[IL18])+7,8 (формула 1),

где [TLR4]/[GATA3], [TNF]/[IL18] - отношение уровней экспрессии мРНК соответствующих генов.

Отношение уровней экспрессии исследуемых генов определяют по формулам:

[TLR4]/[GATA3]=2^(Cp_GATA3-Cp_TLR4) (формула 2)

[TNF]/[IL18]=2^(Cp_IL18-Cp_THF) (формула 3),

где Ср - значение порогового цикла соответствующего маркера в образце, определяемого автоматически.

Вероятность вагинита определяют по формуле:

р=1/(1+е^-z)*100% (формула 4).

Оптимальное значение величины порога отсечения (точки cut off) определено с помощью ROC-анализа (Receiver Operator Characteristic). Основой данного анализа является построение ROC-кривой, которая показывает зависимость количества верно классифицированных положительных примеров от количества неверно классифицированных отрицательных примеров. Критерием выбора точки cut off выбрано требование максимальной суммарной чувствительности и специфичности модели.

Для небеременных женщин площадь под ROC-кривой составила AUC=0,989±0,007 (p=3,4×10^-21). Пороговое значение вероятности воспаления составило 57% (P=57%). Значения показателей P выше 57% следует классифицировать как маркер вагинитов. Чувствительность и специфичность предложенного метода - 95,4% и 96,2% соответственно.

Для беременных женщин площадь под ROC-кривой составила AUC=0,985±0,015 (p=1,9×10^-11). Пороговое значение вероятности воспаления составило 68,5% (P=68,5%). Значения показателей P выше 68,5% следует классифицировать как маркер вагинитов. Чувствительность и специфичность предложенного метода - 100% и 96% соответственно.

Ограничение метода - применение антибиотиков и антимикотических препаратов менее чем за месяц до исследования.

4. Реализация изобретения

4.1. Взятие материала

Взятие влагалищных соскобов осуществляют с помощью специальных зондов. Во избежание деградации сразу после взятия материала зонд погружают в пластиковую пробирку объемом 1,5 мл, в которую предварительно внесено 500 мкл транспортной среды для РНК. В качестве транспортной среды используется лизирующий раствор (Комплект реагентов “Проба НК”, регистрационное удостоверение № ФСР 2008/02938 от 4 мая 2010 г., ДНК-Технология, Россия). Зонд вращают в течение 10-15 секунд, избегая разбрызгивания раствора. Вынимают зонд из раствора, отжав избыток жидкости, прижимая зонд к стенке пробирки, удаляют зонд, закрывают пробирку. Пробирку доставляют в лабораторию в течение 2 часов либо хранят при температуре 4-8°C в течение 1 суток.

Образцы можно хранить при температуре -20°C в течение 3 месяцев или при температуре -70°C в течение 1 года.

4.2. Выделение нуклеиновых кислот

Выделение РНК производят с использованием комплекта реагентов “Проба НК” или другим любым сопоставимым методом (с использованием колонок, магнитных частиц, сорбентов).

На этапе выделения РНК можно использовать только наконечники с маркировкой «RNAase-free, DNAase-free».

4.2.1. Пробирки, содержащие анализируемый материал в транспортной среде для РНК, разморозить при комнатной температуре. Осадить капли со стенок пробирок путем центрифугирования при 13000 об/мин в течение 15 сек. Довести объем образца до 500 мкл, добавив лизирующий раствор (комплект реагентов “Проба НК”). Встряхнуть пробирки на вортексе в течение 30 сек.

4.2.2. Прогреть пробирки при 65°C в течение 10 мин. Осадить капли со стенок путем центрифугирования при 13000 об/мин в течение 15 сек.

4.2.3. Добавить 500 мкл реагента для преципитации и встряхнуть пробирки на вортексе в течение 3-5 с.

4.2.4. Центрифугировать пробирки при 13000 об/мин в течение 15 мин.

4.2.5. Не задевая осадок, полностью удалить надосадочную жидкость из каждой пробирки отдельным наконечником.

4.2.6. Добавить к осадку 500 мкл промывочного раствора №1, закрыть крышки пробирок и перемешать, 3-5 раз аккуратно перевернув пробирки.

4.2.7. Центрифугировать пробирки при 13000 об/мин в течение 5 мин.

4.2.8. Не задевая осадок, полностью удалить надосадочную жидкость из каждой пробирки отдельным наконечником.

4.2.9. Добавить к осадку 300 мкл промывочного раствора №2, закрыть крышки пробирок и перемешать, 3-5 раз аккуратно перевернув пробирки.

4.2.10. Центрифугировать пробирки при 13000 об/мин в течение 5 мин.

4.2.11. Не задевая осадок, полностью удалить надосадочную жидкость из каждой пробирки отдельным наконечником.

4.2.12. Открыть крышки пробирок и высушить осадок при 65°C в течение 5 мин.

4.2.13. Добавить к осадку 100 мкл буфера для растворения и прогреть пробирки при 65°C в течение 10 мин, осадить конденсат центрифугированием при 13000 об/мин в течение 30 с.

Полученный препарат РНК/ДНК сразу использовать для постановки реакции обратной транскрипции. Оставшийся материал хранить при минус 70°C в течение 1 года, а также можно использовать для выявления ДНК патогенных и УПМ.

Для исключения коамплификации геномной ДНК желательно расположить праймеры на стыках экзонов. Тогда перед проведением обратной транскрипции не требуется обработка образцов ДНК-азой, т.к. при постановке ПЦР используются праймеры, не отжигающиеся на геномной ДНК.

4.3. Проведение реакции обратной транскрипции

4.3.1. Промаркировать необходимое количество новых пластиковых пробирок объемом 0,5 мл с учетом пробирок для отрицательного контрольного образца «К-».

4.3.2. Разморозить ОТ-буфер (4-кратный) и смесь дНТФ (концентрация 2,5 мМ каждого) и праймеров для обратной транскрипции (специфические олигонуклеотиды) при комнатной температуре (18-25°C), затем встряхнуть пробирки на вортексе в течение 3-5 с и осадить капли центрифугированием при 1000 об/мин в течение 3-5 с.

4.3.3. В отдельной пластиковой пробирке приготовить ОТ-смесь путем смешивания ОТ-буфера, смеси праймеров+ дНТФ и обратной транскриптазы:

4,0×(N+1) мкл «ОТ-буфера»,

2,0×(N+1) мкл «смеси праймеров и дНТФ,

1,0×(N+1) мкл обратной транскриптазы,

где (N+1) - количество анализируемых образцов с учетом «К-» (N) с запасом на 1 образец.

4.3.4. По 7 мкл ОТ-смеси внести в промаркированные пробирки.

4.3.5. В пробирки с ОТ-смесью внести по 33 мкл соответствующего образца РНК (или образца «К-»), используя отдельные наконечники для каждого образца.

4.3.6. Пробирки встряхнуть на вортексе в течение 3-5 с и осадить капли центрифугированием при 1000 об/мин в течение 3-5 с.

4.3.7. Пробирки поместить в термостат и инкубировать при температуре 40°C в течение 30 мин, затем при температуре 95°C в течение 5 мин.

4.3.8. Осадить конденсат центрифугированием при 13000 об/мин в течение 30 с.

Полученный препарат кДНК готов для проведения ПЦР.

Хранить кДНК можно при температуре минус 20°C в течение 1 года.

Перед постановкой ПЦР необходимо развести препарат кДНК, добавив 40 мкл ТЕ-буфера.

4.4.Проведение ПЦР

Для проведения ПЦР одновременно в постановке исследовать все изучаемые гены.

4.4.1. Разморозить при комнатной температуре (18-25 С) ПЦР-буфер, затем тщательно перемешать на вортексе и осадить капли центрифугированием при 1000 об/мин в течение 3-5 с.

4.4.2. Для каждого образца кДНК промаркировать по 2 пробирки с запечатанной парафином реакционной смесью*^прим. по 2 пробирки на каждый онкомаркер и каждый референсный ген.

*Реакционная смесь объемом 20 мкл содержит ПЦР-буфер, дНТФ, специфические праймеры (прямой и обратный), специфические олигонуклеотиды, несущие флуоресцентную метку. Для обеспечения горячего старта реакционная смесь запечатывается под парафин.

4.4.3. В отдельной пластиковой пробирке, предварительно перемешав реагенты, приготовить смесь ПЦР-буфера с Taq-полимеразой:

10×(N+1) мкл ПЦР-буфера,

0,5×(N+1) мкл Taq-полимеразы,

где N+1 - количество анализируемых образцов с учетом (К-) и (К+), кДНК-СТ (N) с запасом на 1 образец.

Смесь можно хранить при комнатной температуре (18-25°C) не более 1 ч.

4.4.4. Перемешать приготовленную смесь ПЦР буфера с Taq-полимеразой на вортексе и осадить капли центрифугированием при 1000 об/мин в течение 3-5 с.

4.4.5. Во все амплификационные пробирки, не повреждая слой парафина, добавить по 10 мкл тщательно перемешанной смеси ПЦР-буфера с Taq-полимеразой.

4.4.6. В каждую пробирку добавить по 1 капле (20 мкл) минерального масла, закрыть пробирки.

4.4.7. Внести в амплификационные пробирки, не повреждая слой парафина, по 5,0 мкл препарата кДНК.

4.4.8. В пробирки, промаркированные (К-), внести по 5,0 мкл отрицательного контрольного образца.

4.4.9. Закрыть крышки пробирок.

4.4.10. Осадить капли со стенок пробирок. Для этого провести центрифигирование при 1000 об/мин в течение 3-5 с.

4.4.11. Установить все пробирки в блок амплификатора и провести ПЦР в режиме, приведенном в таблице 1, с учетом объема реакционной смеси, равного 35 мкл.

4.5. Регистрация, учет, обработка и представление результатов

Регистрация и учет результатов амплификации проводится с помощью детектирующего амплификатора DTprime (ДНК-Технология, Россия), осуществляется прибором автоматически во время амплификации. Оформление протокола (тип анализа «Качественный», метод определения «Геометрический») и анализ результатов проводится в соответствии с инструкцией к прибору («Руководство по эксплуатации»).

Полученные автоматически в ходе реакции значения пороговых циклов генов цитокинов (Cp) позволяют определить отношения уровней экспрессии соответствующих генов (формулы 2 и 3). На основании полученных уровней экспрессии вычисляется значение линейной функции z (формула 1). Далее вычисляется вероятность (P) локальной воспалительной реакции (формула 4). Если значение P≤57% (P≤68,5% для беременных) делается заключение об отсутствии вагинита. Значения P>57% (P>68,5% для беременных) соответствуют вагиниту.

Примеры использования изобретения

Пример №1. Проведено клинико-лабораторное обследование 50 беременных женщин без признаков вагинита и других воспалительных заболеваний органов женской репродуктивной системы. Из них согласно предложенной методике вероятность локальной воспалительной реакции P<50% определена у 46 пациенток, 50<P<68% - у 2 пациенток, что может рассматриваться как отсутствие вагинита. У двух пациенток получен ложноположительный результат (P=70% и 99%).

Пример №2. Проведено клинико-лабораторное обследование 24 беременных женщин с вагинитами бактериальной и грибковой этиологии. Во всех случаях подтверждено наличие локальной воспалительной реакции.

Пример №3. Вульвовагинальный кандидоз у беременных женщин более чем в 40% случаев протекает без жалоб и выраженных клинических проявлений, так называемое кандидоносительство [Jensen J.S.]. С помощью предложенного метода обследованы 11 беременных женщин, у которых во влагалище обнаружены грибы Candida albicans при отсутствии жалоб и воспалительной реакции.

Пример №4. Проведено клинико-лабораторное обследование 79 женщин репродуктивного возраста от 19 до 45 лет без признаков вагинита и других воспалительных заболеваний органов женской репродуктивной системы. Из них согласно предложенной методике вероятность локальной воспалительной реакции P<50% определена у 75 пациенток, P=53% - у 1 пациентки, что может рассматриваться как отсутствие вагинита. У 3 пациенток получен ложноположительный результат (P=94%, 92% и 78%).

Пример №5. Проведено клинико-лабораторное обследование 196 женщин репродуктивного возраста от 19 до 45 лет с вагинитами бактериальной, грибковой этиологии, смешанной и неясной этиологии. У 187 женщин вероятность локальной воспалительной реакции превышала 57%, что подтверждает диагноз вагинит.

Заключения, сделанные на основании предложенного метода, подтверждены клиническими данными, результатами бактериальных посевов и ПЦР-анализа, а также результатами микроскопии окрашенных по Граму влагалищных мазков. При проведении ПЦР-анализа использованы следующие тест-системы:

- набор реагентов для исследования биоценоза урогенитального тракта у женщин методом ПЦР в режиме реального времени (ФЕМОФЛОР) (регистрационное удостоверение № ФСР 2009/04663 от 26 апреля 2010 г., ДНК-Технология, Россия);

- комплект реагентов для ПНР амплификации ДНК Trichomonas vaginalis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis в режиме реального времени (TNC комплекс) (регистрационное удостоверение № ФСР 2011/10428 от 31 марта 2011 г., ДНК-Технология, Россия).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Долгушина В.Ф., Долгушин И.И., Телешова Л.Ф.. Местный иммунитет половой системы у беременных с генитальной инфекцией // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2000. - №2. - С.92-95.

2. Серов В.Н.. Рациональная терапия влагалищных инфекций // Гинекология. - 2005. - Т.7. - №2.

3. Anderson M.R., Klink K., Cohrssen A. Evaluation of vaginal complains // JAMA. - 2004. - Vol.291. - p.1368-1379.

4. Campos A.C., Murta E.F., Michelin M.A., Reis C. Evaluation of Cytokines in Endocervical Secretion and Vaginal pH from Women with Bacterial Vaginosis or Human Papillomavirus // ISRN obstetrics and gynecology. - 2012. - Vol.2012. P.342075.

5. Eckert L.O. Clinical practice. Acute vulvovaginitis // N Engl J Med. - 2006. - Vol.21, N355(12). - p.1244-1252.

6. Hickey D.K., Patel M.V., Fahey J.V., Wira C.R. Innate and adaptive immunity at mucosal surfaces of the female reproductive tract: stratification and integration of immune protection against the transmission of sexually transmitted infections // Journal of reproductive immunology. - 2011. - Vol.88. - №2. - P.185-194.

7. Jensen J.S., Sherrard J., Bonders G., White D. Guideline on the Management of Vaginal Discharge. 2011 European (IUSTI/WHO). 2011; 1-23.

8. Medzhitov R, Janeway CA. Innate immunity: the virtues of a nonclonal system of recognition // Cell. - 1997. - Vol.31, N91(3). - p.295-298.

9. Owen M.K., Clenney T.L. Management of vaginitis. American Family Physician // 2004. - Vol.70. - p.2125-2132.

10. Sherrard J., Donders G., White D., Jensen J.S. European (IUSTI/WHO) guideline on the management of vaginal discharge, 2011 // International journal of STD & AIDS. - 2011. - Vol.22. - №8. - P.421-429.