СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ α-КЕТОГЛУТАРОВОЙ КИСЛОТЫ ИЗ РАПСОВОГО МАСЛА С ПОМОЩЬЮ ДРОЖЖЕЙ Yarrowia lipolytica

Изобретение относится к области микробиологического получения органических кислот, в частности α-кетоглутаровой кислоты, которая может быть использована, для фармацевтического применения.

Известно применение α-кетоглутаровой кислоты в фармакологии для лечения и профилактики болезней печени, крови, рака, артрита, Helicobacter pylori у млекопитающих, включая человека.

Известна заявка CN 101011371 (2007-08-08) китайской фирмы «BEIJING HEWEIKANG MEDICAL TECH» [1]. Изобретение раскрывает способ получения фармацевтического препарата α-кетоглутаровой кислоты и ее применение. Эксперимент на животных показывает, что препарат обладает очевидным фармакологическим действием для лечения заболеваний печени.

Известно применение α-кетоглутаровой кислоты или ее фармацевтически приемлемой соли для изготовления фармацевтического препарата или пищевой, или кормовой добавки для стимулирования продукции липидов высокой плотности (ЛВП) у позвоночных животных, включая человека, патент РФ №2375055 (10.12.2009) фирмы SGP & SONS AB [SE] СГП энд Сане АБ (SE) [2].

Известно изобретение CN 101584687 (2009-11-25) китайской фирмы BEIJING JIASHILIANBO PHARMACEU [3]. Изобретение описывает новый препарат, который в основном состоит из соли железа α-кетоглутаровой кислоты. Препарат имеет очевидный эффект лечения железодефицитной анемии, алиментарной анемии, геморрагической анемии и апластической анемии, а также может быть использован для вспомогательного лечения анемии.

Для тканевой инженерии разработан биодеградируемый синтетический биоматериал на основе полимеров α-кетоглутаровой кислоты [4]. Смесь L-аргинина и α-кетоглутаровой кислоты является популярной биодобавкой у спортсменов во время тренировок с отягощением [5].

Во всем мире α-кетоглутаровую кислоту производят путем химического синтеза. Исходным сырьем являются диэтиловый эфир янтарной и эфир щавелевой кислот.

Известны способы получения α-кетоглутаровой кислоты с помощью различных штаммов дрожжей Yarrowia lipolytica (син. Candida lipolytica). Кислоту получают путем культивирования указанных выше дрожжей в жидких минеральных средах, содержащих источники азота, фосфора и минеральные соли. В качестве источника углерода используют н-алканы, этиловый спирт, глицерин, растительные масла.

Описаны способы получения α-кетоглутаровой кислоты в среде с жидкими парафинами. С использованием природного штамма С. lipolytica BKM Y-2402D достигнут выход 108,7 г/л (120% от использованного субстрата) [6]. С использованием природного штамма С. lipolytica ВКПМ Y-2412 достигнут выход продукта - 37,3 г/л (75,6% от использованного субстрата) [7]. Недостаток всех вышеприведенных способов получения α-кетоглутаровой кислоты из жидких парафинов - их канцерогенность [8], и, следовательно, неприемлемость применения продукта в пищевой промышленности и медицине.

Известны способы получения α-кетоглутаровой кислоты из этилового спирта. С использованием мутантного штамма Y. lipolytica №1 достигнут выход продукта - 49 г/л (42% от использованного субстрата) [9]. С использованием природного штамма Y. lipolytica BKM Y-2412 достигнут выход 172 г/л (70% от использованного субстрата) [10]. Недостаток всех вышеприведенных способов получения α-кетоглутаровой кислоты из этилового спирта - низкий выход продукта и токсичность высоких концентраций этанола для клетки.

Описан способ получения α-кетоглутаровой кислоты из глицерина. С использованием природного штамма Y. lipolytica WSH-Z06 достигнут выход α-кетоглутаровой кислоты 39,2 г/л (39% от использованного субстрата), при этом содержание побочного продукта ферментации - пировиноградной кислоты было значительно (16,84 г/л) [11]. Недостаток способа заключается в том, что он не обеспечивает достаточно высокого выхода α-кетоглутаровой кислоты.

Наиболее близким к предлагаемому по достигаемому эффекту и совокупности существенных признаков является способ получения α-кетоглутаровой кислоты из рапсового масла с помощью дрожжей Y. lipolytica H222-27-11 [12]. Согласно этому способу штамм Y. lipolytica H222-27-11 выращивают на среде, содержащей в качестве источника углерода и энергии рапсовое масло, а также источники азота, фосфора, минеральные соли и тиамин. Выход продукта составил 34 г/л (37% от использованного субстрата). Недостаток способа заключается в том, что он не обеспечивает достаточно высокого выхода α-кетоглутаровой кислоты.

Цель предлагаемого изобретения - увеличение выхода α-кетоглутаровой кислоты для фармацевтического и пищевого применения при росте дрожжей на среде с рапсовым маслом.

Указанная цель достигается тем, что α-кетоглутаровую кислоту получают путем аэробного культивирования с использованием штамма Y. lipolytica BKM Y-2412 на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода и энергии рапсовое масло а также источники азота, фосфора, минеральные соли и тиамин. В состав среды вводят ионы железа в интервале от 1 до 1,5 мг/л, рапсовое масло вводят в концентрации от 20 г/л до 40 г/л, сульфат аммония в концентрации от 5 до 6 г/л среды. Первый этап роста биомассы проводят в течение 44-48 часов, в течение которого pH поддерживают на уровне 4,1-5,0, аэрацию осуществляют на уровне 20-25% от насыщения. На втором этапе с 44-48 часов повышают аэрацию до 50-55%. На третьем этапе с 72-74 часов снижают pH до 3,0-4,0, дополнительно вводят сульфат аммония по 1,2 г/л через каждые 20-30 часов, поддерживают pH в диапазоне 3,0-4,0 и величину аэрации на уровне 50-55% до 188-196 часов культивирования, при этом на втором и третьем этапах контролируют уровень концентрации растворенного в среде кислорода (pO₂) и добавляют рапсовое масло при увеличении концентрации растворенного в среде кислорода (pO₂) выше 10%.

Описание изобретения

Способ осуществляют непрерывным культивированием штамма Y. lipolytica BKM Y-2412 в ферментере, снабженным датчиками pH и датчиком растворенного в среде кислорода pO₂ с необходимым эксплуатационным и контрольно-измерительным оборудованием. Штамм дрожжей Y. lipolytica культивируют в оптимальном диапазоне температур от +29 до +30°C и pH от 3,0 до 5,0; с увеличенным содержанием в среде ионов железа в интервале от 1 до 1,5 мг/л и при дополнительном введении сульфата аммония по 1,2 г/л через каждые 20-30 часов. Первый этап роста биомассы проводят в течение 44-48 часов, в течение которого pH поддерживают на уровне 4,1-5,0, аэрацию осуществляют на уровне 20-25% от насыщения pO₂. На втором и третьем этапе культивирования pH снижают до 3,0-4,0 и повышают аэрацию до 50-55%, а также контролируют уровень концентрации растворенного в среде кислорода (pO₂) и добавляют рапсовое масло по 20-40 г/л при увеличении концентрации растворенного в среде кислорода (pO₂) выше 10%.

Предпочтительно на первом этапе процесса культивации величину pH поддерживать на уровне 4,5+0,1 в течение 44-48 часов роста и далее снижать до значения 3,5+0,1 до конца культивирования.

Также предпочтительно обеспечить концентрацию Fe²⁺ на уровне 1,2 мг/л, концентрацию сульфата аммония регулировать от 6 г/л на первом этапе до 13,2 г/л на третьем этапе, а уровень концентрации рапсового масла поддерживать 20 г/л при увеличении концентрации растворенного в среде кислорода (pO₂) выше 10%.

Штамм Y. lipolytica BKM-2412 ранее был выделен из образцов активного ила очистных сооружений нефтеперерабатывающих предприятий [13] и был использован как объект научных исследований [10], а также как продуцент α-кетоглутаровой кислоты из жидких парафинов [7].

Штамм Y. lipolytica BKM-2412 имеет следующие характеристики:

3-х суточная культура в жидком сусле и на агаризованном сусле представлена овальными, удлиненно-овальными и округлыми клетками размером 4,0-6,5×4,5-13 µ. Встречаются мелкие клетки 2,0-2,5×3,0-3,5 µ. Часть крупных клеток имеет неправильную форму. Почкование полярное или латеральное. Клетки одиночные или соединены в цепочки из 2-3 клеток. Штрих на сусло-агаре (возраст 10 суток) сплошной, плоский, кремового цвета, гладкий, пастообразный, края ровные. Колонии на сусло-агаре округлые, диаметр большинства колоний 6 мм, встречаются мелкие колонии диаметром 3 мм (5-6% популяции). Колонии беловато-кремового цвета, пастообразные, края ровные, центр колоний приподнят. У большинства колоний (90%) поверхность гладкая, у 10% колоний - морщинистая. Колонии на сусло-агаре (4 недели) кремового цвета, края бахромчатые, поверхность колонии шероховатая, пастообразная, центр колонии приподнят. На стекле, картофельном агаре на 5 сут культура образует псевдомицелий типа Candida и Mycocandida. Спор не образует. Строгий аэроб. Сахара не сбраживает. Ассимилирует: рапсовое масло, подсолнечное масло, глюкозу, D-галактозу (медленно), L-сорбозу, D-рибозу, этанол, глицерин, эритрит, адонит, D-маннит, сорбит и молочную, янтарную, лимонную, глюконовую кислоты. Не ассимилирует: сахарозу, мальтозу, лактозу, целлобиозу, трегалозу, мелибиозу, раффинозу, мелицитозу, инулин, крахмал, D-ксилозу, L- и D-арабинозу, раммозу, дульцит, инозит, D-глюкозамин и глюкуроновую, 2-кетоглюконовую, 5-кетоглюконовую кислоты. Не ассимилирует нитраты. Не растет в безвитаминной среде, требует тиамин, не требует биотин. Не растет на среде с 50% глюкозы. Растет в среде с 10-12% α-кетоглутаровой кислотой. Оптимальное рН для роста 4,0-6,0, для синтеза α-кетоглутаровой кислоты 3,5-4,5. Оптимальная температура 29-30°C. Максимальная температура роста 35°C. Не растет при 37°С. Разжижает желатин. Гидролизует мочевину.

Способ иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1

Этот способ наиболее близок к способу-прототипу [12]. Наш штамм Y. lipolytica BKM-2412, аналогично штамму Y. lipolytica H222-27-11 - продуценту α-кетоглутаровой кислоты, выращивают на среде, содержащей в качестве единственного источника углерода и энергии рапсовое масло.

Штамм Y. lipolytica BKM-2412 хранится на агаризованной минеральной среде Ридер следующего состава (г/л): парафин - 20, (NH₄)₂SO₄-3,0, MgSO₄·7H₂O-0,7, Са(NО₃)₂-0,4, NaCl - 0,5, КН₂PO₄-1,0, К₂НРO₄-0,1, микроэлементы (смесь Буркгольдера) (мг/л): KJ - 0,1, В³⁺ - 0,01, Мn²⁺ - 0,01, Zn²⁺ - 0,01, Cu²⁺ - 0,01, Mo²⁺ - 0,01, Fe²⁺ - 0,05, тиамин - 1,2 мкг/л, вода дистиллированная - до 1 л.

Дрожжи выращивают на косяках агаризованной среды в течение трех суток при 28-30°C. Клетки с двух косяков суспендируют в 5 мл стерильной дистиллированной среды и переносят в колбу объемом 750 мл, содержащую 100 мл среды следующего состава (г/л): рапсовое масло - 10, (NH₄)₂SO₄ - 4,5, MgSO₄·7H₂O - 0,7, Са(NO₃)₂ - 0,4, NaCl - 0,5, KH₂PO₄ - 1,0, К₂НРO₄ - 0,1, микроэлементы (смесь Буркгольдера) (мг/л): KJ -0,1, В³⁺ - 0,01, Мn²⁺ - 0,01, Zn²⁺ - 0,01, Cu²⁺ - 0,01, Mo²⁺ - 0,01, Fe²⁺ - 0,05, тиамин - 6 мкг/л, вода дистиллированная - до 1 л. Инкубирование посевного материала проводят на качалке (220 об/мин) в течение 24 ч при 28-30°C. Выросшие клетки (из расчета 100 мг/л по сухому весу) переносят в другую партию колб со средой того же состава и инкубируют в течение 48 ч при 28-30°C. На 24 ч и 48 от начала культивирования измеряют рН культуральной среды и проводят подтитровку среды стерильным раствором 10%-ной КОН до рН среды 4,5-6,0. В конце культивирования выросшую культуру (5-6 колб) сливают в колбу с отростком и используют для засева ферментера с рабочим объемом 5 л. Сухой вес посевного материала, используемого для засева питательной среды в ферментере - не менее 3-4 г/л.

Среда для ферментации имеет следующий состав (г/л): рапсовое масло - 100; (NH₄)₂SO₄ - 13,2, MgSO₄·7H₂O - 1,4, Са(NO₃)₂ - 0,8, NaCl - 0,5, KH₂PO₄ - 2,0, К₂НРO₄ - 0,2, микроэлементы (смесь Буркгольдера) (мг/л): КJ - 0,1, В³⁺ - 0,01, Мn²⁺ - 0,01, Zn²⁺ - 0,01, Cu²⁺ - 0,01, Mo²⁺ - 0,01, тиамин - 1,2 мкг/л, вода дистиллированная - до 1 л.

Культивирование проводят при 29-30°С, концентрация растворенного кислорода 20-25% насыщения, рН 4,1-5,0 (поддерживают добавлением 20%-ного раствора КОН). В процессе ферментации на 24 ч роста дополнительно вводят 60 г/л рапсового масла. Общий расход масла составляет 800 г на ферментацию в 10 л ферментере с рабочим объемом 5 л.

В процессе ферментации на 192 ч накапливается 63 г/л α-кетоглутаровой кислоты с выходом 58,4% от использованного субстрата. Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить конечную концентрацию α-кетоглутаровой кислоты в 1,85 раза выше, чем ранее известный способ-прототип при культивировании на среде с рапсовым маслом [12].

Пример 2

Дрожжи выращивают на агаризованной среде, как в примере 1.

Посевной материал выращивают, как в примере 1.

Среда для ферментации отличается от среды в примере 1 пониженным содержанием рапсового масла, сульфата аммония и увеличенной концентрацией ионов железа и имеет следующий состав (г/л): рапсовое масло - 20; (NH₄)₂SO₄ - 6, MgSO₄·7H₂O - 1,4, Са(NO₃)₂ - 0,8, NaCl - 0,5, KH₂PO₄ - 2,0, К₂НРO₄ - 0,2, микроэлементы (мг/л): КJ - 0,1, В³⁺ - 0,01, Мn²⁺ - 0,01, Zn²⁺ - 0,01, Cu²⁺ - 0,01, Mo²⁺ - 0,01, Fe²⁺ - 1,2 мг/л, тиамин - 1,2 мкг/л, вода дистиллированная - до 1 л.

Способ подачи рапсового масла отличается от способа в примере 1: рапсовое масло вносят дискретно - по 20 г/л с 44-48 ч в момент повышения концентрации растворенного кислорода на 10% в сравнении со стабильным уровнем насыщения кислорода. Такое повышение концентрации растворенного кислорода указывает на полное потребление дрожжами ранее присутствующего субстрата. Общий расход масла, как и в примере 1, составляет 800 г на ферментацию.

Способ подачи сульфата аммония отличается от способа в примере 1: Сульфат аммония вносят дискретно - 5-6 г/л исходно и далее по 1,2 г/л с 48 ч один раз в сутки (6 раз). Общая концентрация сульфата аммония, как и в примере 1, составляет 13,2 г/л.

Культивирование проводится при 29-30°С. Оптимально проводить культивирование при 30°C.

Концентрацию растворенного кислорода в начале культивирования - 20-25% насыщения, и с 44-48 ч до конца культивирования концентрация растворенного кислорода - 50-55% насыщения.

В первые 72 ч культивирования рН среды поддерживают на уровне 4,1-5,0 добавлением 20% раствора КОН, а затем с 72 ч рН среды понижают до 3-4 и далее в ходе всего процесса кислотообразования поддерживают рН 3-4. Предпочтительно на первом и втором этапе процесса культивации величину рН поддерживать на уровне 4,5+0,1 с 72-74 ч снижать до значения 3,5+0,1 и далее до конца культивирования поддерживать на уровне 3,5+0,1.

В процессе ферментации на 192 ч накапливается 102,5 г/л α-кетоглутаровой кислоты, что составляет 95% от использованного субстрата.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить концентрацию α-кетоглутаровой кислоты при культивировании на среде с рапсовым маслом в 3,01 раза выше, чем ранее известный способ-прототип на рапсовом масле [12].

По сравнению с известными аналогами и прототипом заявленный способ позволяет существенно увеличить выход α-кетоглутаровой кислоты.

Предлагаемое изобретение удовлетворяет критериям новизны, так как при определении уровня техники не обнаружены способы, которым присущи признаки, идентичные (то есть совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков) всем признакам, перечисленным в формуле изобретения.

Заявленный способ имеет изобретательский уровень, поскольку не выявлены технические решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками данного изобретения, и не установлена известность влияния отличительных признаков на указанный технический результат.

Заявленное техническое решение можно реализовать в ферментерах большого объема для синтеза а-кетоглутаровой кислоты путем аэробного культивирования, используя известное стандартное оборудование. Это соответствует критерию "промышленная применимость", предъявляемому к изобретениям

ЛИТЕРАТУРА

1. Wen Shouming Pharmaceutical preparation of alpha-ketoglutaric acid, its preparation process and use. Китай заявка CN 101011371 (2007-08-08).

2. Перзиновский С., Радский Р.П., Биенко М. ПРИМЕНЕНИЕ АЛЬФА-КЕТОГЛУТАРАТА И РОДСТВЕННЫХ СОЕДИНЕНИЙ ДЛЯ СНИЖЕНИЯ ЛИПИДОВ ПЛАЗМЫ патент РФ №2375055 (10.12.2009).

3. Feng Zhao, Wenyao Liu Application of alfa ketoglutaric acid, in preparing iron-filling drug and health care product Китай заявка CN 101584687 (2009-11-25).

4. Barrett D.G., YousafM. Poly(triol α-ketoglutarate) as biodegradable, chemoselective, and mechanically tunable elastomers // Macromolecules. - 2008. - V.41. - P. 6347-6352.

5. Campbell В., Roberts М., Kerksick С., Wilbom С., Marcello В., Taylor L., Nassar E., Leutholtz В., Bowden R., Rasmussen C., Greenwood М., Kreider R. Pharmacokinetics, safety, and effects on exercise performance of L-arginine aketoglutarate in trained adult men // Nutrition. - 2006. - V.22. - P. 872-881.

6. Лозинов А.Б. и др.СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ α-КЕТОГЛУТАРОВОЙ КИСЛОТЫ Авторское свидетельство СССР № 259791 (01.01.1970).

7. Винокурова Н.Г. и др. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКАЛИЕВОЙ СОЛИ α-КЕТОГЛУТАРОВОЙ КИСЛОТЫ Авторское свидетельство СССР № 1524486, 20.11.1996

8. Otto Ch., Yovkova V., Barth G. Overproduction and secretion of α-ketoglutaric acid by microorganisms // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2011. - V.92. - P. 689-695.

9. Chernyavskaya O.G., Shishkanova N.V., Ilchenko A.P., Finogenova T.V. Synthesis of alpha-ketoglutaric acid by Yarrowia lipolytica yeast grown on ethanol // Appl Microbiol Biotechnol. - 2000. - V.53. - №2. - P. 152-158.

10. Kamzolova S.V., Chiglintseva M.N., LuninaJ.N. and Morgunov I.G. α-Ketoglutaric acid production by Yarrowia lipolytica and its regulation // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2012 - V.96. - №3. Р.783-791.

11. Zhou J., Zhou H., Lui L., Chen J., Du G. Screening ofathiamin auxotrophic yeast for α-ketoglutaric acid overproduction // J. Appl. Microbiol. - 2010. - V.51. - P. 264-271.

12. Stottmeister U., Aurich A., Wilde H., Andersch J., Schmidt S., Sicker D. White biotechnology for Green chemistry: fermentative 2-oxocarboxylic acids as novel building blocks for subsequent chemical syntheses // J. Ind. Microbiol. Biotech. - 2005. - V.32. - P. 651-664.

13. Иерусалимский Н.Д., Андреева Е.А., Гришанкова Е.Л., Головлев Е.Л., Дорохов В.В., Жукова Л.Н. // Прикл. биохим. микробиол. - 1965. - №1. - С.163-166.