Результат интеллектуальной деятельности: ШТАММ БАКТЕРИЙ Bacillus thuringiensis, НЕЙТРАЛИЗУЮЩИЙ ИНФЕКЦИОННУЮ АКТИВНОСТЬ ВИРУСА ГРИППА ЧЕЛОВЕКА А/Н3N2 (ВАРИАНТЫ)

Изобретение относится к новым штаммам Bacillus thuringiensis (Bt), обладающим противовирусной активностью, в частности, относительно высокопатогенного вируса гриппа человека A/H3N2 для получения препаратов, направленных на подавление указанного вируса и может быть использовано в микробиологической промышленности, биотехнологии и медицине.

Эпидемиологически значимыми в последние 10 лет для человека являлись вирусы гриппа «А» с поверхностными антигенами A(H1N1), A(H2N2), A(H3N2), способные к быстрому генетическому изменению. Это их свойство создает большие проблемы при лечении инфицированных вирусом гриппа не только человека, но и животных и птиц Отмечается высокая заболеваемость населения (до 40%) с почти одинаковым поражением всех возрастных групп.

С июля 2012 года установлено значительное увеличение случаев заражения «вариантным» вирусом H3N2v, содержащим ген М из вируса гриппа (H1N1)pdm09 (пандемический вирус 2009 H1N1). По данным Всемирной организации здравоохранения в 2012 году в девяти штатах США зарегистрированы случаи заболеваний людей, вызванные этим вирусом. В связи с этим в настоящее время особую актуальность имеет поиск актуальных средств противовирусной защиты и создание препаратов подавляющих вирусную активность.

Известно, что бактерии вида Bacillus thuringiensis (Bt), обладают избирательным антагонистическим действием в отношении микроорганизмов [1, 2]. Показана противовирусная активность штаммов Bt против фитопатогенов, вредителей сельскохозяйственных растений [3, 4].

Известны штаммы бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis, используемые в качестве компонентов препарата против вирусных и бактериальных инфекций (Патент 2142287, МПК A61K 35/74, опубл. 10.12.1999 г.).

Известен штамм VNPB 17-3 бактерий Bacillus thuringiensis (патент США №6528480, МПК A01N 63/00, опубл. 04.03.2003 г.), содержащий белковый токсин, обладающий противовирусным действием против вируса табачной мозаики.

Наиболее близким аналогом (прототипом) являются штаммы В. thuringiensis В-1065 и В. thuringiensis В-1083 (варианты), обладающие противовирусной и антикандидозной активностью (Патент РФ №2405035, МПК C12N 1/20, опубл. 27.11.2010 г.).

Однако все выше приведенные аналоги и прототип не обладают ингибирующим действием против вируса гриппа человека A/H3N2.

Техническим результатом заявляемого решения является выявление бактериальных штаммов, обладающих ингибирующей активностью в отношении вируса гриппа человека A/H3N2.

Указанный технический результат достигается получением спорообразующего, формирующего параспоральные кристаллы, штамма бактерий Bacillus thuringiensis AK-1 (первый вариант), нейтрализующий инфекционную активность вируса гриппа человека A/H3N2 и депонированный в коллекции бактерий, бактериофагов и грибов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным номером В-1272.

Указанный технический результат достигается также получением второго варианта спорообразующего, формирующего параспоральные кристаллы, штамма бактерий Bacillus thuringiensis, нейтрализующий инфекционную активность вируса гриппа человека A/H3N2 и депонированный в коллекции бактерий, бактериофагов и грибов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным номером В-1273.

Характеристика штаммов.

Штаммы В. thuringiensis AK-1 и Bacillus thuringiensis AK-2 получены при селекции на наличие противовирусной активности штаммов Bt, выделенных ранее из образцов грунта грязевого горячего котла (Долина Гейзеров, Камчатка).

Морфология штаммов:

Штаммы В. thuringiensis AK-1 и В. thuringiensis AK-2 имеют сходную морфологию колоний и клеток. На агаризованной среде Nutrient Broth с добавлением 18-20% агара (среда NBA) формируют округлые, белесые, плоские, мелкозернистые, непрозрачные колонии. Клетки штаммов представлены грамположительными, палочками, размером 1,2-1,4×2-4 мкм, с расположением по 2 или в цепочках; формируют параспоральные включения округлой формы. Эндоспоры эллиптические, диаметр клетки не превышают, после разрушения спорангия споры и параспоральные включения исследуемых штаммов остаются соединенными в пары, соединялись со спорой не плотно, а через связующие их структуры. Центральные оси споры и кристалла совпадают. Для клеток штаммов В. thuringiensis AK-1 и В. thuringiensis AK-2 характерно наличие четко выраженной макрокапсулы (толщиной более 0,2 мкм). Кристаллы штаммов имеют одинаковый состав белков с характерной для Bt молекулярной массой (130, 125 и 100 кДа).

Биохимические признаки штаммов:

По биохимическим признакам штаммы В. thuringiensis AK-1 и В. thuringiensis AK-2 также проявляют большое сходство, незначительно отличаясь по некоторым альтернативным признакам (гидролиз сахарозы, эскулина) и по резистентности к антибиотикам. Штаммы В. thuringiensis AK-1 и В. thuringiensis AK-2 при культивировании на питательных средах растут в присутствии 0,001% лизоцима, способны к анаэробному росту, выделяют кислоту из глюкозы и мальтозы, но, не из арабинозы, ксилозы, маннита и лактозы, не образуют индол, не дезаминируют фенилаланин, имеют лизинкарбоксилазу, не обладают аргининдекарбоксилазой, восстанавливают нитраты, гидролизуют казеин, положительны в реакции MR, FP, в реакции на каталазу, оксидазу, амилазу, липазную, лецитиназную и гемолитическую (на эритроцитах кролика) активность, гидролизуют желатин; отрицательны в реакции на плазмокоагулазную и фибринолитическую активность, в реакции на уреазу и фосфатазу; не образуют индол, сероводород, аммиак, не утилизируют цитрат.

Для определения возможности применения штаммов В. thuringiensis совместно с антибактериальными препаратами необходимо выяснить их резистентность по отношению к антибиотикам. Показано, что штамм В. thuringiensis AK-1 устойчив к азлоциллину, ампициллину, бензилпенициллину, карбенициллину, оксациллину, полимиксину и цефотаксину; чувствителен к амикацину, ванкомицину, гентамицину, канамицину, рифампицину, имипенему, левомицетину, линкомицину, неомицину, стрептомицину, тетрациклину и ципрофлоксацину. Штамм В. thuringiensis AK-2 резистентен к азлоциллину, ампициллину, бензилпенициллину, карбенициллину, оксациллину и цефотаксину; слабо чувствителен к полимиксину; чувствителен к амикацину, ванкомицину, гентамицину, канамицину, рифампицину, имипенему, левомицетину, линкомицину, неомицину, стрептомицину, тетрациклину и ципрофлоксацину.

Хранение штаммов осуществляется периодическими пересевами на агаризованную среду NBA, длительное хранение осуществляется в 15% растворе глицерина при низкотемпературном замораживании (65°C) [6] и в лиофильно-высушенном состоянии. Штаммы В. thuringiensis AK-1 и В. thuringiensis AK-2 депонированы в коллекции бактерий, бактериофагов и грибов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»» под коллекционными номерами В-1072 и В-1073, соответственно.

Справки о депонировании штаммов прилагаются.

Посевной материал получали при выращивании штаммов на жидких или агаризованных средах: LB (“Difco”, США), LB с добавление агара до 1,7%, среда NBA с добавлением 18-20% агара; значение рН всех сред составляло 7.0-7.2.

Исследование штаммов В. thuringiensis AK-1 и В. thuringiensis AK-2 на активность против вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (A/H3N2) проводится впервые, в связи с чем можно сделать вывод о соответствии предлагаемых штаммов критериям изобретения «новизны» и «изобретательский уровень».

1. Подготовка препаратов на основе водорастворимых метаболитов штамма В. thuringiensis AK-1 и В. thuringiensis AK-2.

1.1. Наработка культуральной жидкости (КЖ) штамма. С использованием культуры исследуемого штамма, наработанного на агаризованной среде в течение 18-24 часов при температуре 28-30°C, готовили суспензии клеток с концентрацией 1×10⁷ кл/мл. Приготовленную суспензию вносили в количестве 1% в колбы с 50 мл среды LB и культивировали в течение 18 часов с использованием термостатированной качалки (КТ 104, Россия). Для приготовления препаратов использовали клеточные культуры бацилл, находящиеся в вегетативной стадии развития. Отсутствие процесса споруляции и формирования параспоральных включений контролировали при микроскопировании культуры методом фазового контраста (микроскоп Axioskop 40, “Карл Цейсс”, Германия).

1.2. Получение препарата на основе культуральной жидкости штамма. Для приготовления препарата полученную КЖ штамма центрифугировали при 6000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21 (Beckman, США). Надосадочную жидкость стерилизовали дважды последовательной ультрафильтрацией через Whatman фильтры, с размерами пор 0.2 µm, и хранили до использования при температуре минус 20°C.

Отсутствие бактериальных клеток в препарате контролировали микроскопически и при его высеве на агаризованную среду LB.

2. Исследование токсичности и противовирусной активности штамма В. thuringiensis AK-1 и В. thuringiensis AK-2 относительно вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (A/H3N2).

2.1. Определение токсичности и противовирусной активности препаратов Вт. Для оценки противовирусной эффективности полученных препаратов Bt использовали вирус гриппа человека A/Aichi/2/68 (A/H3N2) из «Коллекции микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»». Для тестирования токсичности и противовирусной активности препаратов использовали перевиваемую культуру клеток MDCK, полученную из «Коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»».

2.2. Определение токсических доз препаратов. В стерильном месте суспензию с известной концентрацией клеток MDCK разводили предварительно подогретой до температуры 37°C средой RPMI-1640 до концентрации 1×10⁵ кл./мл и по 100 мкл вносили в лунки 96-луночных планшетов. Планшеты с клетками помещали в термостат при температуре 37°C, 5% CO₂ и 100% влажности на 2-3 суток до образования монослоя.

Препараты разводили в 2, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000 раз средой RPMI-1640, вносили по 150 мкл в соответствующие лунки планшета с клетками MDCK и ставили в термостат при температуре 37°C, 5% CO₂ и 100% влажности на 2 суток. Через 2 суток с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток MDCK, инкубированных с разными концентрациями препаратов. Для определения противовирусной активности препаратов использовали максимально переносимые концентрации (МПК).

2.3. Определение противовирусной активности препаратов. Готовили десятикратные разведения ВАЖ от 1 до 8 с использованием среды RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина. Для определения противовирусной активности препаратов в монослой культуры клеток MDCK вносили по 100 мкл выбранного разведения препарата и 100 мкл от 1 до 8 разведения ВАЖ. Клетки инкубировали 2 сут при температуре 37°C в атмосфере 5% CO₂ в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 2 суток в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами кур.

3. Примеры конкретного применения заявляемых штаммов.

Схема подготовки образцов препаратов на основе заявляемых штаммов для исследования противовирусной активности приведена в таблице.

3.1. Пример №1. Испытание противовирусного действия препарата №4, приготовленного на основе культуральной жидкости штамма Bacillus thuringiensis AK-1, на вирус гриппа человека A/H3N2.

С использованием культуры штамма Bacillus thuringiensis AK-1, наработанной на агаризованной среде в течение 18-24 часов при температуре 28-30°C, готовили суспензию клеток с концентрацией 1×10⁷ кл/мл. Приготовленную суспензию вносили в количестве 1% в колбы с 50 мл среды LB и культивировали в течение 18 часов с использованием термостатированной качалки. Для приготовления препаратов использовали клеточные культуры бацилл, находящиеся в вегетативной стадии развития. Отсутствие процесса споруляции и формирования параспоральных включений контролировали при микроскопировании культуры методом фазового контраста.

Для приготовления препарата №4 полученную КЖ штамма центрифугировали при 6000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21 (Beckman, США). Надосадочную жидкость стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman фильтр, с размерами пор 0.2цт, полученный препарат №4 хранили до использования при температуре минус 20°C.

Отсутствие бактериальных клеток в препарате контролировали микроскопически и при его высеве на агаризованную среду LB.

Для определения токсических доз препарат №4 разводили в 2, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000 раз средой RPMI-1640, вносили по 150 мкл в соответствующие лунки планшета и ставили в термостат при температуре 37°C, 5% CO₂ и 100% влажности на 2 суток. Через 2 суток с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток MDCK, инкубированных с разными концентрациями препаратов. Препарат №4 был нетоксичен на клеточной культуре MDCK начиная с разведения в 5 раз. Для оценки противовирусной активности препарата №4 использовали разведение в 5 раз.

Для определения противовирусной активности препарата №4 готовили десятикратные разведения ВАЖ от 1 до 8 с использованием среды RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина. Для определения противовирусной активности препаратов в монослой культуры клеток MDCK вносили по 100 мкл/лунку препарата, разведенного в 5 раз средой RPMI-1640, и 100 мкл от 1 до 8 разведения ВАЖ. Клетки инкубировали 2 суток при температуре 37°C в атмосфере 5% CO₂ в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 2 суток в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами кур.

При инфекционности вируса A/H3N2 на клетках MDCK (титр в lg ТЦД50/мл составил 6,7), ее нейтрализация под влиянием исследованного препарата составляла 0,5 lg.

3.2. Пример №2. Испытание противовирусного действия препарата №4-10, приготовленного на основе культуральной жидкости штамма Bacillus thuringiensis AK-1, на вирус гриппа человека A/H3N2.

С использованием культуры штамма Bacillus thuringiensis AK-1, наработанной на агаризованной среде в течение 18-24 часов при температуре 28-30°C, готовили суспензию клеток с концентрацией 1×10⁷ кл./мл. Приготовленную суспензию вносили в количестве 1% в колбы с 50 мл среды LB и культивировали в течение 18 часов с использованием термостатированной качалки. Для приготовления препаратов использовали клеточные культуры бацилл, находящиеся в вегетативной стадии развития. Отсутствие процесса споруляции и формирования параспоральных включений контролировали при микроскопировании культуры методом фазового контраста.

Для приготовления препарата №4-10 полученную КЖ штамма центрифугировали при 6000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21 (Beckman, США). Надосадочную жидкость стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman фильтр, с размерами пор 0.2 µm, полученный препарат №4-10 хранили до использования при температуре минус 20°C.

Отсутствие бактериальных клеток в препарате контролировали микроскопически и при его высеве на агаризованную среду LB.

Для определения токсических доз препарат №4-10 разводили в 2 раза, в 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000 раз средой RPMI-1640, вносили по 150 мкл в соответствующие лунки планшета и ставили в термостат при температуре 37°C, 5% CO₂ и 100% влажности на 2 суток. Через 2 суток с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток MDCK, инкубированных с разными концентрациями препаратов. Препарат №4-10 был нетоксичен на клеточной культуре MDCK начиная с разведения в 5 раз. Для оценки противовирусной активности препарата №4-10 использовали разведение в 10 раз.

Для определения противовирусной активности препарата №4-10 готовили десятикратные разведения ВАЖ от 1 до 8 с использованием среды RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина. Для определения противовирусной активности препаратов в монослой культуры клеток MDCK вносили по 100 мкл/лунку препарата, разведенного в 5 раз средой RPMI-1640, и 100 мкл от 1 до 8 разведения ВАЖ. Клетки инкубировали 2 суток при температуре 37°C в атмосфере 5% СО₂ в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 2 суток в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами кур.

По отношению к вирусу A/H3N2 (титр в lgТЦД50/мл составил 6, 7) индекс нейтрализации под влиянием исследованного препарата равнялся 1.0 lg.

3.3. Пример №3. Испытание противовирусного действия препарата №4/1, приготовленного на основе культуральной жидности штамма Bacillus thuringiensis AK-1, на вирус гриппа человека A/H3N2.

С использованием культуры штамма В. thuringiensis AK-1, наработанной на агаризованной среде в течение 18-24 часов при температуре 28-30°C, готовили суспензию клеток с концентрацией 1×10⁷ кл./мл. Приготовленную суспензию вносили в количестве 1% в колбы с 50 мл среды LB и культивировали в течение 18 часов с использованием термостатированной качалки. Для приготовления препарата №4/1 использовали клеточные культуры бацилл, находящиеся в вегетативной стадии развития. Полученную культуральную жидкость центрифугировали при 6000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21 (Beckman, США). Надосадочную жидкость стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman фильтр, с размерами пор 0.2 µm, полученный препарат №4/1 хранили до использования при температуре минус 20°C в течение 3х месяцев.

Для определения токсических доз препарат №4/1 разводили в 2, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000 раз средой RPMI-1640, вносили по 150 мкл в соответствующие лунки планшета и ставили в термостат при температуре 37°C, 5% СО₂ и 100% влажности на 2 суток. Через 2 суток с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток MDCK, инкубированных с разными концентрациями препаратов. Препарат №4/1 был нетоксичен на клеточной культуре MDCK начиная с разведения в 5 раз. Для оценки противовирусной активности препарата №4/1 использовали разведение в 5 раз.

Для определения противовирусной активности препарата №4/1 готовили десятикратные разведения ВАЖ от 1 до 8 с использованием среды RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина. Для определения противовирусной активности препаратов в монослой культуры клеток MDCK вносили по 100 мкл/лунку препарата, разведенного в 5 раз средой RPMI-1640, и 100 мкл от 1 до 8 разведения ВАЖ. Клетки инкубировали 2 суток при температуре 37°C в атмосфере 5% СО₂ в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 2 суток в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами кур.

При инфекционности вируса A/H3N2 на клетках MDCK (титр в lgТЦД50/мл составил 6,7) ее нейтрализация под влиянием исследованного препарата составляла 2.5 lg.

3.4. Пример №4. Испытание противовирусного действия препарата №4/1-10, приготовленного на основе культуральной жидности штамма Bacillus thuringiensis AK-1, на вирус гриппа человека A/H3N2.

С использованием культуры штамма В. thuringiensis AK-1, наработанной на агаризованной среде в течение 18-24 часов при температуре 28-30°C, готовили суспензию клеток с концентрацией 1х10⁷ кл./мл. Приготовленную суспензию вносили в количестве 1% в колбы с 50 мл среды LB и культивировали в течение 18 часов с использованием термостатированной качалки. Для приготовления препарата №4/1-10 использовали клеточные культуры бацилл, находящиеся в вегетативной стадии развития. Полученную культуральную жидкость центрифугировали при 6000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21 (Beckman, США). Надосадочную жидкость стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman фильтр, с размерами пор 0.2 µm, полученный препарат №4/1-10 хранили до использования при температуре минус 20°C в течение 3х месяцев.

Для определения токсических доз препарат №4/1-10 разводили в 2, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000 раз средой RPMI-1640, вносили по 150 мкл в соответствующие лунки планшета и ставили в термостат при температуре 37°C, 5% CO₂ и 100% влажности на 2 суток. Через 2 суток с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток MDCK, инкубированных с разными концентрациями препаратов. Препарат №4/1-10 был нетоксичен на клеточной культуре MDCK, начиная с разведения в 5 раз. Для оценки противовирусной активности препарата №4/1-10 использовали разведение в 10 раз.

Для определения противовирусной активности препарата №4/1-10 готовили десятикратные разведения ВАЖ от 1 до 8 с использованием среды RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина. Для определения противовирусной активности препаратов в монослой культуры клеток MDCK вносили по 100 мкл/лунку препарата, разведенного в 5 раз средой RPMI-1640, и 100 мкл от 1 до 8 разведения ВАЖ. Клетки инкубировали 2 суток при температуре 37°C в атмосфере 5% СО₂ в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 2 суток в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами кур.

По отношению к вирусу A/H3N2 (титр в lgТЦД50/мл составил 6,7) индекс нейтрализации под влиянием исследованного препарата равнялся 3,2 lg.

3.5. Пример №5. Испытание противовирусного действия препарата №5, приготовленного на основе культуральной жидкости штамма В. thuringiensis AX-2, на вирус гриппа человека A/H3N2, хранящейся до использования при температуре минус 20°C.

С использованием культуры штамма В. thuringiensis AK-2, наработанной на агаризованной среде в течение 18-24 часов при температуре 28-30°C, готовили суспензию клеток с концентрацией 1×10⁷ кл./мл. Приготовленную суспензию вносили в количестве 1% в колбы с 50 мл среды LB и культивировали в течение 18 часов с использованием термостатированной качалки. Для приготовления препаратов использовали клеточные КЖ бацилл, находящиеся в вегетативной стадии развития. Отсутствие процесса споруляции и формирования параспоральных включений контролировали при микроскопировании культуры методом фазового контраста.

Для приготовления препарата №5 полученную КЖ штамма центрифугировали при 6000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21 (Beckman, США). Надосадочную жидкость стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman фильтр, с размерами пор 0,2 µm, полученный препарат №5 хранили до использования при температуре минус 20°C.

Для определения токсических доз препарат №5 разводили в 2, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000 раз средой RPMI-1640, вносили по 150 мкл в соответствующие лунки планшета и ставили в термостат при температуре 37°C, 5% CO₂ и 100% влажности на 2 суток. Через 2 суток с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток MDCK, инкубированных с разными концентрациями препаратов. Препарат №5 был нетоксичен на клеточной культуре MDCK начиная с разведения в 5 раз. Для оценки противовирусной активности препарата №5 использовали разведение в 5 раз.

Для определения противовирусной активности препарата №5 готовили разведения ВАЖ от 1 до 8 с десятикратным шагом с использованием среды RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина. Для определения противовирусной активности препаратов в монослой культуры клеток MDCK. вносили по 100 мкл/лунку препарата, разведенного в 10 раз средой RPMI-1640, и 100 мкл от 1 до 8 разведения ВАЖ. Клетки инкубировали 2 суток при температуре +37°C в атмосфере 5% CO₂ в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 2 суток в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами кур.

При инфекционности вируса A/H3N2 на клетках MDCK (титр в lgТЦД50/мл составил 6,7), ее нейтрализация под влиянием исследованного препарата составляла 1,2 lg.

3.6. Пример №6. Испытание противовирусного действия препарата №5-10, приготовленного на основе культуральной жидкости штамма В. thuringiensis АР-2, на вирус гриппа человека A/H3N2, хранящейся до использования при температуре минус 20°C.

С использованием культуры штамма В. thuringiensis AK-2, наработанной на агаризованной среде в течение 18-24 часов при температуре 28-30°C, готовили суспензию клеток с концентрацией 1×10⁷ кл./мл. Приготовленную суспензию вносили в количестве 1% в колбы с 50 мл среды LB и культивировали в течение 18 часов с использованием термостатированной качалки. Для приготовления препаратов использовали клеточные КЖ бацилл, находящиеся в вегетативной стадии развития. Отсутствие процесса споруляции и формирования параспоральных включений контролировали при микроскопировании культуры методом фазового контраста.

Для приготовления препарата №5-10 полученную КЖ штамма центрифугировали при 6000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21 (Beckman, США). Надосадочную жидкость стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman фильтр, с размерами пор 0,2 µm, полученный препарат №5-10 хранили до использования при температуре минус 20°C.

Для определения токсических доз препарат №5-10 разводили в 2, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000 раз средой RPMI-1640, вносили по 150 мкл в соответствующие лунки планшета и ставили в термостат при температуре 37°C, 5% СО₂ и 100% влажности на 2 суток. Через 2 суток с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток MDCK, инкубированных с разными концентрациями препаратов. Препарат №5-10 был нетоксичен на клеточной культуре MDCK начиная с разведения в 5 раз. Для оценки противовирусной активности препарата №5-10 использовали разведение в 10 раз.

Для определения противовирусной активности препарата №5-10 готовили разведения ВАЖ от 1 до 8 с десятикратным шагом с использованием среды RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина. Для определения противовирусной активности препаратов в монослой культуры клеток MDCK вносили по 100 мкл/лунку препарата, разведенного в 10 раз средой RPMI-1640, и 100 мкл от 1 до 8 разведения ВАЖ. Клетки инкубировали 2 суток при температуре 37°C в атмосфере 5% СО₂ в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 2 суток в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами кур.

По отношению к вирусу A/H3N2 (титр в lgТЦД50/мл составил 6, 7) индекс нейтрализации под влиянием исследованного препарата равнялся 1,2 lg.

3.7. Пример №7. Испытание противовирусного действия препарата №5/1, приготовленного на основе культуральной жидкости штамма Bacillus thuringiensis AK-2, на вирус гриппа человека A/H3N2, хранящейся до использования при температуре минус 20°C в течение 3х месяцев.

С использованием культуры штамма В. thuringiensis AK-2, наработанной на агаризованной среде в течение 18-24 часов при температуре 28-30°C, готовили суспензию клеток с концентрацией 1×10⁷ кл./мл. Приготовленную суспензию вносили в количестве 1% в колбы с 50 мл среды LB и культивировали в течение 18 часов с использованием термостатированной качалки Для приготовления препарата №5/1 использовали клеточные культуры бацилл, находящиеся в вегетативной стадии развития. Полученную культуральную жидкость центрифугировали при 6000 об./мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21 (Beckman, США). Надосадочную жидкость стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman фильтр, с размерами пор 0.2 µm, и полученный препарат №5/1 хранили до использования при температуре минус 20°C в течение 3х месяцев.

Для определения токсических доз препарат №5/1 разводили в 2, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000 раз средой RPMI-1640, вносили по 150 мкл в соответствующие лунки планшета и ставили в термостат при температуре 37°C, 5% CO₂ и 100% влажности на 2 суток. Через 2 суток с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток MDCK, инкубированных с разными концентрациями препаратов. Препарат №5/1 был нетоксичен на клеточной культуре MDCK начиная с разведения в 5 раз. Для оценки противовирусной активности препарата №5/1 использовали разведение в 5 раз.

Для определения противовирусной активности препарата №5/1 готовили разведения ВАЖ от 1 до 8 с десятикратным шагом с использованием среды RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина. Для определения противовирусной активности препаратов в монослой культуры клеток MDCK вносили по 100 мкл/лунку препарата, разведенного в 10 раз средой RPMI-1640, и 100 мкл от 1 до 8 разведения ВАЖ. Клетки инкубировали 2 суток при температуре 37°C в атмосфере 5% CO₂ в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 2 суток в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами кур.

При инфекционности вируса A/H3N2 на клетках MDCK (титр в lgТЦД50/мл составил 6, 7) ее нейтрализация под влиянием исследованного препарата составляла 3,0 lg.

3.8. Пример №8. Испытание противовирусного действия препарата №5/1-10, приготовленного на основе культуральной жидкости штамма Bacillus thuringiensis AK-2, на вирус гриппа человека A/H3N2, хранящейся до использования при температуре минус 20°C в течение 3х месяцев.

С использованием культуры штамма В. thuringiensis AK-2, наработанной на агаризованной среде в течение 18-24 часов при температуре 28-30°C, готовили суспензию клеток с концентрацией 1×10⁷ кл./мл. Приготовленную суспензию вносили в количестве 1% в колбы с 50 мл среды LB и культивировали в течение 18 часов с использованием термостатированной качалки. Для приготовления препарата №5/1-10 использовали клеточные культуры бацилл, находящиеся в вегетативной стадии развития. Полученную культуральную жидкость центрифугировали при 6000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21 (Beckman, США). Надосадочную жидкость стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman фильтр, с размерами пор 0.2 µm, и полученный препарат №5/1-10 хранили до использования при температуре минус 20°C в течение 3х месяцев.

Для определения токсических доз препарат №5/1-10 разводили в 2, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000 раз средой RPMI-1640, вносили по 150 мкл в соответствующие лунки планшета и ставили в термостат при температуре 37°C, 5% CO₂ и 100% влажности на 2 суток. Через 2 суток с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток MDCK, инкубированных с разными концентрациями препаратов. Препарат №5/1-10 был нетоксичен на клеточной культуре MDCK начиная с разведения в 5 раз. Для оценки противовирусной активности препарата №5/1-10 использовали разведение в 10 раз.

Для определения противовирусной активности препарата №5/1-10 готовили разведения ВАЖ от 1 до 8 с десятикратным шагом с использованием среды RPMI-1640, содержащей 2 мкг/мл трипсина. Для определения противовирусной активности препаратов в монослой культуры клеток MDCK вносили по 100 мкл/лунку препарата, разведенного в 10 раз средой RPMI-1640, и 100 мкл от 1 до 8 разведения ВАЖ. Клетки инкубировали 2 суток при температуре 37°C в атмосфере 5% CO₂ в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 2 суток в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами кур.

По отношению к вирусу A/H3N2 (титр в ^ТЦД50/мл составил 6, 7) индекс нейтрализации под влиянием исследованного препарата равнялся 3,2 lg.

Таким образом, было показано, что препараты, приготовленные на основе культуральной жидкости штаммов Bacillus thuringiensis AK-1 и Bacillus thuringiensis AK-2 проявили высокую противовирусную активность относительно вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (A/H3N2).

Источники информации

1. Каменек Л.К., Левина Т.А., Терехин Д.А., Миначева Л.Д. Антибактериальное действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis как потенциального агента защиты растений // Биотехнология. - 2005. - №1. - С.59-67.

2. Юдина Т.Г., Бурцева Л.И. // Микробиология. - 1997. - Т.66. - №1. - С.25-31.

3. Патогены насекомых: структурные и функциональные аспекты / Под ред. Глупова В.В. - М.: Круглый год, 2001. - 716 с.

4. Ahern М., Verschueren S., van Sinderen D. // FEMS Microbiol. Letters. - 2003. - V.220. - P.127-131.