ШТАММ БАКТЕРИЙ Serratia plymuthica, ОБЛАДАЮЩИЙ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ ВИРУСОВ ГРИППА ТИПА А (ЕГО ВАРИАНТЫ)

Изобретение относится к новым штаммам бактерий рода Serratia, выделенных из различных источников и отобранных по признаку наибольшей нуклеазной активности для производства препаратов, обладающих противовирусной активностью, и может быть использовано в медицине, микробиологии и биотехнологии.

Известны данные об антивирусной активности панкреатической рибонуклеазы в отношении ряда РНК- и ДНК-содержащих вирусов, а также об их применении в клинике для лечения вирусных заболеваний. Рядом исследователей изучаются антивирусные свойства нуклеаз, выделенных из микроорганизмов, которые обладают более выраженными антивирусными свойствами, чем панкреатическая рибонуклеаза [Шапот В.С. Нуклеазы, М., 1968; Нуклеазы микроорганизмов, под ред. A.M. Безбородова, М., 1974 Nucleuses, ed. by S.M. Linn, R.J. Roberts, Cold Spring Harbour, 1982].

Известны сообщения об антивирусной, в частности, антигриппозной активности веществ, имеющих природное происхождение. Так, авторы И.Д. Макаренкова и др. (2010) сообщают о способности сульфатированного полисахарида - фукоидана из морской бурой водоросли Laminaria japonica подавлять продукцию высокопатогенного вируса гриппа птиц A/H5N1 в течение 24 ч инфекции при профилактической и лечебно-профилактической схемах применения [Противовирусная активность сульфатированного полисахарида из бурой водоросли LAMINARIA JAPONICA в отношении инфекции культур клеток, вызванной вирусом гриппа А птиц (H5N1) Макаренкова И.Д., Дерябин П.Г., Львов Д.К., Звягинцева Т.Н., Беседнова Н.Н. Вопросы вирусологии. 2010. Т.55. №1. С.41-45].

Показана противовирусная активность препаратов грибного происхождения [Разумов И.А., Косогова Т.А., Казачинская Е.В., Пучкова Л.И., Щербакова Н.С., Горбунова И.А., Михайловская И.Н., Локтев В.Б., Теплякова Т.В. Противовирусная активность водных экстрактов и полисахаридных фракций, полученных из мицелия и плодовых тел высших грибов. // Антибиотики и Химиотерапия, т.55, №9-10, 2010].

Рибонуклеазы обладают выраженной противовирусной активностью в отношении таких РНК-содержащих вирусов, как вирусы гриппа, полиомиелита, клещевого энцефалита, бешенства [Грибенча С.В. Противовирусная активность РНКазы Bacillus intermedius у морских свинок и кроликов, зараженных вирусом бешенства // Вопросы вирусологии, 2006, №5, с.41-43]. Дезоксирибонуклеазы тормозят синтез и размножение ДНК-содержащих вирусов, осповакцины, аденовируса, герпеса.

Одним из наиболее изученных энзимов этого класса является секретируемая эндонуклеаза Serratia marcescens. Грамотрицательные бактерии рода Serratia, в культуральной жидкости отдельных штаммов которых обнаружены высокие РНК-азная и ДНК-азная активности широко известны как продуценты различного рода препаратов [Габдуллина Г.К. Действие нуклеазы Serratia marcescens на клетки и рост асцитной опухоли Эрлиха: Афтореф. дис… канд. биол. наук. - Казань, 1980. - 20 с.; Патент РФ №2148645, МПК C12N 9/20, опубл. 10.05.2000 г. «Штамм бактерий Serratia marcescens-продуцент липазы»]. Фермент тормозит размножение вирусов везикулярного стоматита и осповакцины в культуре клеток куриных фибробластов.

Известен штамм Serratia marcescens В-10 М-1 продуцент дезоксирибонуклеазы наиболее часто используемой в лабораторных условиях. [Нуклеазы микроорганизмов и их практическое использование. Рига, 1989, с.3. 2. Биосинтез микроорганизмами нуклеаз и протеаз М.: Наука, 1979, с.7].

Первый созданный на основе эндонуклеазы Serratia marcescens противовирусный препарат получил название эндонуклеаза бактериальная. В настоящее время нуклеазы из бактерий Sarratia marcescens используют для лечения вирусных заболеваний пчел [Патент РФ №2038776, МПК A01K 51/00, опубл. 09.07.1995 г. «Средство “Эндоглюкин” для профилактики и лечения вирусных заболеваний пчел и стимуляции развития пчелиных семей»].

Наиболее близким аналогом (прототипом) является штамм Serratia marcescens, опубликованный в патенте на средство на основе культуральной жидкости, полученной с использованием указанного штамма [патент РФ №2420309, МПК A61K 39/00, опубл. 10.06.2011 г.].

Однако не известны опубликованные данные о том, что выше приведенные аналоги, в том числе и прототип, обладают ингибирующим действием против высокопатогенного вируса гриппа птиц A/H5N1 и человека A/H3N2.

Техническим результатом заявляемого решения является выявление бактериальных штаммов, обладающих противовирусными свойствами, в отношении вируса гриппа птиц A/H5N1 и гриппа человека (H3N2).

Указанный технический результат достигается тем, что получен штамм бактерий Serratia plumuthica Dg-91, обладающий противовирусной активностью в отношении вирусов гриппа типа A и депонированный в коллекции бактерий, бактериофагов и грибов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»» под регистрационным номером B-1288.

Указанный технический результат достигается также получением штамма бактерий Serratia plumuthica Dg-98, обладающий противовирусной активностью в отношении вирусов гриппа типа A и депонированный в коллекции бактерий, бактериофагов и грибов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»» под регистрационным номером B-1297.

Указанный технический результат достигается также получением штамма бактерий Serratia plumuthica Bp-868, обладающий противовирусной активностью в отношении вирусов гриппа типа A и депонированный в коллекции бактерий, бактериофагов и грибов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»» под регистрационным номером B-1296.

Указанный технический результат достигается также получением штамма бактерий Serratia plumuthica Az-372, обладающий противовирусной активностью в отношении вирусов гриппа типа A и депонированный в коллекции бактерий, бактериофагов и грибов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»» под регистрационным номером B-1285.

Заявляемые штаммы изолированы при высеве исследуемых образцов на среду РПА (pH 7,0-7,2, температура инкубирования 30-37°C). Характеристика заявляемых штаммов, связанная с источниками их выделения, представлена в таблице 1.

Определение таксономической принадлежности бактериальных изолятов.

Для определения таксономической принадлежности бактерий Вр-868, Dg-91, Dg-98 и Az-372, выделенных из природных источников, стандартными методами исследовали их фенотипические признаки и определяли нуклеотидные последовательности продуктов ПНР, соответствующие гену 16S рРНК штаммов. Определение исследуемых бактерий до вида проводили по Бердже [“Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology”. 8 th ed. / Ed. John G. Holt. - Baltimore-London, Williams and Wilkins, 1986. - V.1-2. - 1105 p.].

Для получения геномных характеристик выделяли суммарные ДНК из чистых культур и проводили ПНР с универсальными праймерами, соответствующими гену 16S рРНК эубактерий: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ и 5′-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3′. Нуклеотидные последовательности продуктов ПЦР определяли с использованием BigDye 3,1 Terminator Cycle Sequencing Kit и автоматического анализатора ДНК модели ABI 3130xl (Applied Biosystems, США), в Межинститутском Центре секвенирования ДНК СО РАН (г. Новосибирск). Филогенетический анализ выполняли с использованием программы MEGA версии 4 для нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, определенных в данной работе, и близкородственных видов из базы данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

При культивировании применяли питательную среду “S” (Пептон, NaCI, MgCl₂×6H₂O, Трис-аминометан, pH 8.0) или “LB” (“Difco”, США) состава: дрожжевой экстракт, пептон, NaCI, pH 7,2.

Хранение штаммов: Штаммы хранили в лиофильно-высушенном состоянии, в 30%-ном растворе глицерина при температуре минус 65°C и при периодических пересевах на агаризованную среду LB.

Морфологические и биохимические признаки штаммов

Грамотрицательные, неспороносные, подвижные или неподвижные клетки штаммов Вр-868, Dg-91, Dg-98 и Az-372 представлены палочками, в основном укороченными, размером 0,5-0,8×1,0-2,5 мкм (табл.2).

Штаммы являются факультативными анаэробами, хорошо растут при температуре 30-37°C. Согласно результатам определения нуклеотидной последовательности 16S рРНК бактерии данной группы отнесены к роду Serratia.

Показано, что штаммы Вр-868, Dg-91, Dg-98 Az-372 в соответствии с признаками представителей рода Serratia, отрицательны в тестах по уреазе, на индол, сероводород, амилазу; образуют ДНКазу, гидролизуют желатин, утилизируют цитрат, восстанавливают нитрат, с образованием кислоты гидролизуют сахарозу, лактозу, манит, мальтозу, глюкозу. Все культуры, за исключением штамма Az-372, были отрицательны в тесте с метиловым красным. В реакции Фогес-Проскауэра штаммы имеют отличия допустимые в рамках признаков бактерий рода Serratia (табл.3).

Совокупные данные по фенотипическим и геномным признакам позволяют идентифицировать штаммы Dg-91, Dg-98, Bp-868, Az-372, как принадлежащие к виду Serratia plumuthica.

Посевной материал получали при выращивании штаммов на среде LB, на агаризованной среде LB (0,25% LB, 1,7% агара) и среде А (0,7% пептона, 0,4% рыбного гидролизата, 0,5% NaCl, 1,7% агара). Значение pH всех сред составляло 7,0-7,2.

Для получения образцов культуральной жидкости (КЖ) штаммы культивировали в среде “S” или “LB” в течение 18 ч при температуре 37°C с последующим центрифугированием в течение 20 мин при 8000 об/мин на центрифуге JA-21 (Beckman, США). Полученные образцы КЖ и биомассы хранили до использования в замороженном состоянии при температуре минус 20°C.

Для получения клеточных экстрактов (КЭ) бактериальные клетки разрушали ультразвуком в стерильной дистиллированной воде на дезинтеграторе MSE (Великобритания). Степень разрушения контролировали на спектрофотометре при длине волны 560 нм.

Ниже приведены данные по исследованию нуклеазной активности штаммов.

Количественное определение РНКазной и ДНКазной активности проводили по превращению субстратных нуклеиновых кислот: суммарной дрожжевой РНК (НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ «Вектор») и ДНК из молок лосося (Медиген, Новосибирск) во фрагменты, которые растворимы в 4%-ной HClO₄, с появлением кислоторастворимого материала с адсорбцией при 260 нм.

В процессе работы нами показано, что все эти штаммы бактерий обладают не только РНКазной, но и ДНКазной активностью и гидролизуют не только ДНК из молок лосося, но и ДНК фага λ и ДНК фага Т7.

Подготовка к тестированию штаммов вируса гриппа и культуры клеток.

Для оценки противовирусной эффективности полученных препаратов использовали высокопатогенный вирус гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (A/H5N1) из коллекции ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор, наработанный на 10-суточных развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ). Концентрация вируса составила: 10^3,5-6,5 lg ТЦД₅₀/мл. Вирус гриппа человека A/Aichi/2/68(A/H3N2) (из коллекции ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»), титр 10^2,5-6,5 lg ТЦД₅₀/мл вирусаллантоисной жидкости (ВАЖ)). Для тестирования токсичности и противовирусной активности препаратов использовали перевиваемую культуру клеток MDCK.

Определение токсичности препаратов. Для определения токсических доз препараты разводили в 2, 5, 10, раз средой Axcevir-MDCK, вносили по 150 мкл в соответствующие лунки планшета с клетками MDCK и ставили в термостат при температуре 37°C, 5% CO2 и 100% влажности на 2 суток.

Через 2 суток с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток MDCK, инкубированных с разными концентрациями препаратов.

Для определения противовирусной активности препаратов использовали максимально переносимые концентрации (МПК).

Определение противовирусной активности препаратов. Для определения противовирусной активности препаратов готовили десятикратные разведения ВАЖ от 1 до 8 с использованием среды Axcevir-MDCK, содержащей 2 мкг/мл трипсина. В монослой культуры клеток MDCK вносили по 50 мкл выбранного разведения препарата и 100 мкл от 1 до 8 разведения ВАЖ. Клетки инкубировали 2 суток при температуре 37°C в атмосфере 5% CO2 в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 2 суток в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами петуха. Ниже приведены примеры конкретного применения заявляемых штаммов.

Определение наличия нуклеолитической и противовирусной активности штаммов Serratia plumuthica Bp-868, Serratia plumuthica Dg-91, Serratia plumuthica Dg-98, Serratia plumuthica Az-372 относительно вирусов гриппа человека A/Aichi/2/68, а штаммов Serratia plumuthica Dg-91, Serratia plumuthica Az-372 (H3N2) относительно птичьего гриппа A/chicken/Kurgan/05/2005 (A/H5N1), проводится впервые, в связи с чем можно сделать вывод о соответствии предлагаемых штаммов критериям изобретения «новизны» и «изобретательский уровень».

Изобретение подтверждено следующими примерами практического применения.

Получение образцов (препаратов).

Пример 1. Получение препарата (образец 11-13), на основе экстракта клеток (КЭ) штамма Serratia plumuthica. Bp-868.

Биомассу клеток штамма (0,4 г), полученную после культивирования в «LB» и последующего центрифугирования и освобождения от надосадочной жидкости, ресуспендировали в 4 мл дистиллированной воды и обрабатывали 4 раза по 30′′ с интервалом 30′′, на ультразвуковом (УЗ)-дезинтеграторе (с амплитудой 18), добиваясь максимально возможного разрушения клеток. После УЗ-обработки разрушенные клетки осаждали центрифугированием 10 мин при 12000 об/мин на микроцентрифуге “Eppendorf”, КЭ отбирали и стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman фильтр с размерами пор 0,2 мкм. Полученный препарат хранили до использования при температуре минус 20°C. Концентрация белка в образце составила 3,6 мг/мл, активность РНКазы 332,2 ед/мл или 3322 ед/г влажной биомассы.

Пример 2. Испытание противовирусного действия препарата №11-13, приготовленного на основе КЭ штамма Serratia plumuthica Bp-868 (в профилактической схеме) на вирусе гриппа человека (A/H3N2).

Для испытания препарат №11-13 развели в 5 раз и внесли на клетки MDCK в объеме 50 мкл на лунку 96-луночного планшета. Инкубация 2 часа. Удалили препарат, затем в лунки внесли среду RPMI-1640 без сыворотки и без трипсина. Добавили вирус A/Aichi/2/68 (H3N2) с -1 по -7 по 50 мкл на лунку. Инкубация 2 сут. Учет с 1% эритроцитами петуха.

Планшеты с обработанными клетками и вирусом помещали в термостат при температуре 37°C, 5% CO₂ и 100% влажности на 2-3 суток до образования монослоя. Индекс нейтрализации составил 2,5 lg при исходной концентрации вируса 10^2,5 lg ТЦД₅₀/мл (табл.4).

Пример 3. Получение препарата (образца) 12-16, на основе экстракта клеток (КЭ) штамма Serratia plumuthica Dg-91.

Биомассу клеток штамма Serratia plumuthica Dg-91. (0,4 г), полученную после культивирования в «LB» и последующего центрифугирования и освобождения от надосадочной жидкости, ресуспендировали в 4 мл стерильной дистиллированной воды и обрабатывали 4 раза по 30′′ с интервалом 30′′, на ультразвуковом (УЗ)-дезинтеграторе. После УЗ-обработки разрушенные клетки осаждали центрифугированием 10 мин при 12000 об/мин на микроцентрифуге “Eppendorf”, КЭ отбирали и стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman фильтр с размерами пор 0,2 мкм. Полученный препарат хранили до использования при температуре минус 20°C. Концентрация белка в образце составила 7,4 мг/мл, активность РНКазы 574,75 ед/мл., а ДНКазы - 463,1 ед/мл.

Пример 4. Испытание противовирусного действия КЭ штамма Serratia plumuthica Dg-91 на вирусе гриппа человека A/Aichi/2/68(A/H3N2). Анализ противовирусной активности штамма как в примере 2.

Клеточный экстракт (КЭ) штамма Serratia plumuthica Dg-91 (препарат №12-16) проверили в профилактической схеме на противовирусную активность. Индекс нейтрализации составил 6,5 lg при исходной концентрации вируса 10^6,5 lg ТЦД₅₀/мл (табл.4).

Пример 5. Получение препарата (образца) 12-01 на основе культуральной жидкости (КЖ) штамма Serratia plumuthica Dg-91.

Суспензию клеток готовили с использованием культуры штамма Serratia plumuthica Dg-91, наработанного на агаризованной среде «LB» в течение 18 часов при температуре 28-30°C. Суспензию вносили в количестве 2% в колбы с 50 мл среды LB и культивировали в течение 24 часов на термостатированной качалке (КТ 104, Россия). Для приготовления препарата на основе культуральной жидкости полученную КЖ штамма Serratia plumuthica Dg-91 центрифугировали при 10000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21. Осветленную надосадочную жидкость стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman фильтр с размерами пор 0,2 мкм и использовали для испытания в качестве противовирусного препарата в профилактической схеме. РНКазная активность в КЖ составила 220,5 ед/мл. Хранили препарат до использования при температуре минус 20°C.

Пример 6. Испытание противовирусного действия КЖ штамма Serratia plumuthica Dg-91 на вирусе гриппа человека A/Aichi/2/68(A/H3N2). Анализ противовирусной активности штамма как в примере 2.

Культуральную жидкость штамма Serratia plumuthica Dg-91 (препарат №12-01) проверили в профилактической схеме на противовирусную активность. Индекс нейтрализации составил 6,5 lg при исходной концентрации вируса 10^6,5 lg ТЦД₅₀/мл (табл.4).

Пример 7. Испытание противовирусного действия КЖ штамма Serratia plumuthica Dg-91 на вирусе гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (A/H5N1). Для испытания препарат №12-01 развели в 5 раз и внесли на клетки MDCK в объеме 50 мкл на лунку 96-луночного планшета. Инкубация 2 часа. Удалили препарат, затем в лунки внесли среду RPMI-1640 без сыворотки и без трипсина. Добавили вирус A/Aichi/2/68 (H3N2) с -1 по -7 по 50 мкл на лунку. Инкубация 2 сут. Учет с 1% эритроцитами петуха.

Планшеты с обработанными клетками и вирусом помещали в термостат при температуре 37°C, 5% CO₂ и 100% влажности на 2-3 суток до образования монослоя. Индекс нейтрализации составил 6,5 lg (табл.4) при исходной концентрации вируса 10^6,5 lg ТЦД₅₀/мл.

Пример 8. Получение препарата (образца) 12-25 на основе культуральной жидкости (КЖ) штамма. Serratia plumuthica. Az-372.

Образец 12-25 получен как в примере 5.

Испытание противовирусного действия препарата 12-25 на вирусе гриппа человека (A/H3N2) (профилактическая схема) как в примере 8. Индекс нейтрализации составил 3,0 lg при исходной концентрации вируса гриппа человека (A/H3N2) 10^6,5 lg ТЦД₅₀/мл Концентрация белка составила 10,2 мг/мл., РНКазная активность - 108,9 ед/мл кж. (табл.4).

Пример 9. Испытание КЖ Serratia plumuthica. Az-372 на вирусе гриппа птиц (A/H5N1). Препарат (образец) штамма под №11-41 получен как в примере 5 на среде «S». Концентрация белка составила 8,8 мг/мл, а РНКазная активность - 185,3 ед/мл. Индекс нейтрализации вируса гриппа (A/H5N1) составил 3,5 lg при исходной концентрации вируса 10^3,5 lg ТЦД₅₀/мл (табл.4)

Пример 10. Получение препарата (образца) 12-54 на основе культуральной жидкости (КЖ) штамма Serratia plumuthica Dg-91.

Образец получали, как в примере 5, за исключением того, что клетки культивировали на среде «S».

Для приготовления препарата полученную КЖ штамма Serratia plumuthica Dg-91 центрифугировали при 10000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21. Осветленную надосадочную жидкость стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman фильтр с размерами пор 0,2 мкм и использовали для испытания в качестве противовирусного препарата. Хранили препарат до использования при температуре минус 20°C. РНКазная активность в КЖ составила 129,8 ед/мл.

Испытание противовирусного действия образца 12-54 проводили на вирусе гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (A/H5N1) как в примере 7. Индекс нейтрализации составил 6,5 lg при исходной концентрации вируса 10^6,5 lg ТЦД₅₀/мл (табл.4).

Пример 11. Образец (12-20) получали как описано в примере 1. За исключением того, что использовали штамм Serratia plumuthica Dg-98. Осадок клеток штамма, полученный после центрифугирования и освобождения от надосадочной жидкости, как в примере 1, ресуспендировали в 4 мл дистиллированной воды и обрабатывали 4 раза по 30′′ с интервалом 30′′, на ультразвуковом (УЗ)-дезинтеграторе. Процент разрушения 90%. После УЗ-обработки разрушенные клетки осаждали центрифугированием при 10000 об/мин на микроцентрифуге “Eppendorf”, КЭ отбирали и стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman фильтр с размерами пор 0,2 мкм. Полученный препарат хранили до использования при температуре минус 20°C.

Полученный КЭ после размораживания разводили в 2 раза дистиллированной водой и использовали для испытания на противовирусное действие на вирусе гриппа человека A/Aichi/2/68(A/H3N2): Индекс нейтрализации составил 3,5 lg при исходной концентрации вируса 10^3,5 lg ТЦД₅₀/мл (табл.4).

Пример 12. Для испытания использовали чистые стерильные среды «LB» и «S» в качестве противовирусного агента. Испытание проводили для исключения влияния компонентов среды на вирусы гриппа. Обработку клеток проводили как в примере 2. Данные среды не оказывали противовирусного эффекта и не влияли на культуру клеток MDCK. Титр вирусов не изменился по сравнению с контролем и составил: A/chikenKurgan/05/2005 (H5N1) 10^3,5-6,5 lg ТЦД₅₀/мл, а вируса гриппа человека A/Aichi/2/68(A/H3N2): 10^2,5-6,5 lg ТЦД₅₀/мл в зависимости от эксперимента.

Пример 13. КЖ штамма Serratia plumuthica Dg-91 (образец 12-01) и КЭ (образец 12-16), а также КЭ штамма Serratia plumuthica Dg-91 хранились в течение 4-5 месяцев (время наблюдения) при температуре -20°C. Определение противовирусной активности проводили, как в примерах 7-8. Титр вируса (A/H3N2) в lg ТЦД₅₀/мл через 48 ч обработки препаратом (профилактичекая схема) равен 0 при концентрации вируса в контроле 10^3,5 lg ТЦД₅₀/мл (Табл.5).

Таким образом, из приведенных таблиц 4 и 5 видно, что заявляемые штаммы обеспечивают достижение технического результата, а именно обладают противовирусными свойствами, в отношении вируса гриппа птиц A/H5N1 и гриппа человека (H3N2).