Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ КОНСЕРВАЦИИ ИММУНОПЕРОКСИДАЗНОГО КОНЪЮГАТА

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии производства иммунопероксидазных конъюгатов (ИПК), используемых для выявления антигенов возбудителей инфекционных болезней в твердофазном иммуноферментном анализе (ТИФА).

Конъюгаты на основе иммуноглобулинов G (IgG) и пероксидазы хрена (ПХ) - это специфические белковые биополимеры, имеющие слабожесткую структуру, обладающие способностью связываться с антигенами и ускорять химические реакции. В процессе хранения при температуре 4°C они подвергаются отрицательному влиянию продуктов метаболизма микроорганизмов, буферных изменений, концентрации водородных ионов и других факторов, которые по нашим наблюдениям ограничивают срок их годности от нескольких дней до двух недель.

Известен способ консервации ИПК, заключающийся в том, что после приготовления его хранят при минус 20°C в присутствии бычьего сывороточного альбумина (БСА) концентрацией 10 мг/мл [1].

Недостатками данного способа являются необходимость хранения готового продукта отдельно от остальных ингредиентов для постановки ТИФА и создание особых условий при транспортировке по «холодовой цепи».

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ консервации ИПК, включающий добавление к нему БСА из расчета 10 мг/мл и лиофилизацию с последующим хранением при 4°C [2].

Недостатком способа является то, что использование БСА в качестве стабилизирующей среды при лиофилизации препарата ограничивает срок годности иммуноферментного конъюгата 12 месяцами [3, 4].

Целью изобретения является разработка способа консервации ИПК путем подбора стабилизирующей среды высушивания, которая может служить альтернативой БСА при лиофилизации и после растворения препарата с сохранением стабильности физических и иммунохимических показателей на более продолжительный срок.

Технический результат изобретения достигается тем, что при консервации ИПК в качестве стабилизирующей среды высушивания используют белковый стабилизатор (БС), приготовленный на основе водной эмульсии белка куриного яйца, обладающий регулируемым составом белковых биополимеров с инертными поверхностными свойствами. Во время лиофильного высушивания молекулы ИПК оказываются между мономерами белков стабилизатора, благодаря чему активные центры фермента и иммуноглобулинов защищены от потери специфической активности под воздействием факторов окружающей среды во время высушивания и последующего хранения.

Стабилизирующая среда высушивания ИПК должна обладать рядом необходимых свойств: не препятствовать связыванию иммуноглобулинов с антигеном; обеспечивать возможность проникновения субстрата к активному центру ПХ; оставаться инертной по отношению к химическим характеристикам продукта, способствуя сохранению его биологической активности как в жидком, так и в высушенном состоянии; удерживать в процессе лиофилизации высушиваемый продукт внутри ампулы, предотвращая его улетучивание с сублимированными водяными парами; обеспечивать высокий уровень активности препарата в течение срока хранения [5].

Принимая во внимание выше перечисленные факторы, и учитывая свойства биополимеров водной эмульсии белка куриного яйца, очевиден вывод, что наиболее подходящей стабилизирующей средой высушивания для ИПК является БС, приготовленный из белка куриного яйца по ранее разработанному и запатентованному методу [6].

Иммунопероксидазные конъюгаты получали методом перйодатного окисления по методу P.K. Nacane, A. Kawaoi [1]. Для конъюгации IgG использовали фермент ПХ - тип VI-A, RZ-3 (Sigma, США). ПХ в количестве 5 мг растворяли в 1 мл свежеприготовленного 0,3 M раствора двухуглекислого натрия. Добавляли 0,025 мл 0,32%-ного раствора формалина, осторожно перемешивали на шуттель-аппарате в темном футляре 30 мин. Затем добавляли 1 мл 0,04 M раствора перйодата натрия и инкубировали на шуттель-аппарате в темном футляре в течение 30 мин, после чего раствор приобретал зеленовато-желтый оттенок, что является признаком образования активной формы ПХ. Далее вносили 1 мл 0,16 M раствора этиленгликоля и инкубировали в темноте при легком встряхивании в течение 1 ч. Все перечисленные операции проводили при комнатной температуре. Активированную пероксидазу хрена диализировали против 1 л 0,01 M карбонат-бикарбонатного буфера (КББ) pH 9,5 при 4°C в течение 18 ч на магнитной мешалке.

К активированной ПХ добавляли 5 мг IgG против возбудителя туляремии в 1 мл 0,01 M раствора КББ (специфическая активность в реакции иммунодиффузии (РИД) не менее 1:16-1:32). Инкубацию реакционной смеси проводили при перемешивании в течение 2 ч при комнатной температуре в темном футляре. По истечении времени добавляли 5 мг боргидрида натрия и оставляли в темном футляре без перемешивания в течение 2 ч при 4°C. Затем диализировали против 1 л 0,1 M фосфатно-солевого буфера (ФСБ) pH 7,4 в течение 18 ч при 4°C на магнитной мешалке.

БС готовили следующим образом: к 25 мл белка куриного яйца добавляли 75 мл дистиллированной воды и 1,25 г натрия двууглекислого, перемешивали в течение 10-15 мин на магнитной мешалке. Затем прогревали при температуре 56°C 40-60 мин, фильтровали через 8 слоев марли. БС использовали в различных разведениях (от нативного до 1:2) с 0,1 M раствором стерильного ФСБ и добавляли к готовому ИПК в объемном соотношении 1:1. Препарат разливали в ампулы по 0,2 мл, замораживали при температуре минус (45±5)°C не менее 18 ч и лиофилизировали до конечной температуры продукта 25°C. Ампулы с препаратом сразу же после высушивания запаивали в среде атмосферного воздуха. Готовый препарат хранили при 4-6°C.

Физические свойства (растворимость, цветность, прозрачность, потеря в массе при высушивании) и иммунохимические (специфическая активность, чувствительность) контролировали после лиофилизации ИПК в процессе хранения в течение 18 месяцев (срок наблюдения) и после разведения. Чувствительность и специфическую активность ИПК определяли в «сэндвич»-варианте ТИФА. Для постановки ТИФА использовали все компоненты из набора реагентов тест-системы диагностической для выявления возбудителя туляремии в иммуноферментном анализе «ИФА-Тул-СтавНИПЧИ», кроме иммунопероксидазного конъюгата [4]. Приготовленные серии препарата соответствовали основным требованиям нормативных документов.

В таблице 1 представлены результаты изучения физических и иммунохимических свойств туляремийного ИПК, лиофильно высушенного в присутствии БС, подлежащего хранению в течение 18 месяцев (срок наблюдения).

При использовании в качестве стабилизирующей среды высушивания БС в различных разведениях с 0,1 M раствором стерильного ФСБ наилучшие результаты специфической активности ИПК и его чувствительности, а также стабильность характеристик в процессе хранения получены с разведением 1:1,5 (серия 3).

Таким образом, в результате проведенных исследований отработан способ консервации ИПК путем подбора стабилизирующей среды высушивания, обеспечивающей стабильность физических и иммунохимических показателей лиофилизированного и растворенного препарата.

Возможность практического применения изобретения иллюстрируется примерами его конкретного выполнения с использованием совокупности заявляемых признаков.

Пример 1. Получение туляремийного ИПК и его контроль после лиофильного высушивания в присутствии нативного БС.

Получение ИПК. ПХ в количестве 5 мг растворяли в 1 мл свежеприготовленного 0,3 M раствора двууглекислого натрия. Добавляли 0,025 мл 0,32%-ного раствора формалина, осторожно перемешивали на шуттель-аппарате в темном футляре 30 мин. Затем добавляли 1 мл 0,04 M раствора перйодата натрия, инкубировали на шуттель-аппарате в темном футляре 30 мин, после чего раствор приобретал зеленовато-желтый оттенок. Далее вносили 1 мл 0,16 M раствора этиленгликоля и инкубировали в темноте при легком встряхивании в течение 1 ч. Все перечисленные операции проводили при комнатной температуре. После диализировали против 1 л 0,01 M раствора КББ pH 9,5 при 4°C в течение 18 ч на магнитной мешалке.

Раствор активированной ПХ переносили из диализного мешка во флакон и добавляли IgG против возбудителя туляремии в концентрации 5 мг/мл в 1 мл 0,01 M КББ со специфической активностью в РИД не менее 1:16-1:32, содержимое перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре в темном футляре. Добавляли 5 мг боргидрида натрия, оставляли в темном футляре без перемешивания в течение 2 ч при 4°C. Затем диализировали против 1 л 0,1 M раствора ФСБ pH 7,4 в течение 18 ч при 4°C на магнитной мешалке.

БС готовили следующим образом: к 25 мл белка куриного яйца добавляли 75 мл дистиллированной воды и 1,25 г натрия двууглекислого, перемешивали в течение 10-15 мин на магнитной мешалке. Затем прогревали при температуре 56°C 40-60 мин, фильтровали через 8 слоев марли. К готовому ИПК добавляли БС в нативном состоянии в объемном соотношении 1:1. Препарат разливали в ампулы по 0,2 мл, замораживали при температуре минус (45±5)°C не менее 18 ч и лиофилизировали до конечной температуры продукта 25°C. Ампулы с препаратом сразу же после высушивания запаивали в среде атмосферного воздуха. Готовый препарат хранили при 4-6°C (серия 1).

Контролировали физические и иммунохимические свойства препарата после лиофилизации и в процессе хранения в течение 18 месяцев (срок наблюдения). Чувствительность и специфическую активность ИПК определяли в «сэндвич»-варианте ТИФА. Для постановки ТИФА использовали все компоненты из набора реагентов тест-системы диагностической для выявления возбудителя туляремии в иммуноферментном анализе «ИФА-Тул-СтавНИПЧИ», кроме иммунопероксидазного конъюгата [4]. Специфическая активность и чувствительность препарата не снижалась в течение 18 месяцев хранения (срок наблюдения). Внешний вид и растворимость препарата оставались без изменений в течение всего срока наблюдения.

Пример 2. Получение туляремийного ИПК и его контроль после лиофильного высушивания в присутствии БС, разведенного 1:1 в 0,1 M растворе ФСБ.

ИПК получали аналогично примеру 1.

БС готовили аналогично примеру 1.

БС разводили 1:1 0,1 M раствором стерильного ФСБ. Полученный раствор БС добавляли к готовому ИПК в объемном соотношении 1:1. Препарат разливали в ампулы по 0,2 мл, замораживали при температуре минус (45±5)°С не менее 18 ч и лиофилизировали до конечной температуры продукта 25°С. Ампулы с препаратом сразу же после высушивания запаивали в среде атмосферного воздуха. Готовый препарат хранили при 4-6°С (серия 2).

Контролировали физические и иммунохимические свойства препарата после лиофилизации и в процессе хранения в течение 18 месяцев (срок наблюдения) аналогично примеру 1. Специфическая активность и чувствительность ИПК не снижалась в течение 18 месяцев хранения (срок наблюдения). Внешний вид и растворимость препарата оставались без изменений в течение всего срока наблюдения.

Пример 3. Получение ИПК и его контроль после лиофильного высушивания в присутствии БС, разведенного в 1:1,5 в 0,1 M растворе ФСБ.

ИПК получали аналогично примеру 1.

БС готовили аналогично примеру 1.

БС разводили 1:1,5 0,1 M раствором стерильного ФСБ. Полученный раствор БС добавляли к готовому ИПК в объемном соотношении 1:1. Препарат разливали в ампулы по 0,2 мл, замораживали при температуре минус (45±5)°С не менее 18 ч и лиофилизировали до конечной температуры продукта 25°С. Ампулы с препаратом сразу же после высушивания запаивали в среде атмосферного воздуха. Готовый препарат хранили при 4-6°С (серия 3).

Контролировали физические и иммунохимические свойства препарата после лиофилизации и в процессе хранения в течение 18 месяцев (срок наблюдения) аналогично примеру 1. Специфическая активность и чувствительность - не снижалась в течение 18 месяцев хранения (срок наблюдения). Внешний вид и растворимость препарата оставались без изменений в течение всего срока наблюдения.

Пример 4. Получение туляремийного ИПК и его контроль после лиофильного высушивания в присутствии БС, разведенного 1:2 в 0,1 M растворе ФСБ.

ИПК получали аналогично примеру 1.

БС готовили аналогично примеру 1.

БС разводили 1:2 0,1 M раствором стерильного ФСБ. Полученный раствор БС добавляли к готовому ИПК в объемном соотношении 1:1. Препарат разливали в ампулы по 0,2 мл, замораживали при температуре минус (45±5)°С не менее 18 ч и лиофилизировали до конечной температуры продукта 25°С. Ампулы с препаратом сразу же после высушивания запаивали в среде атмосферного воздуха. Готовый препарат хранили при 4-6°С (серия 4).

Контролировали физические и иммунохимические свойства препарата после лиофилизации и в процессе хранения в течение 18 месяцев (срок наблюдения) аналогично примеру 1. Специфическая активность - не снижалась в течение 18 месяцев хранения (срок наблюдения). Чувствительность - снизилась в 2 раза после 18 месяцев хранения (срок наблюдения). Внешний вид и растворимость препарата оставались без изменений в течение всего срока наблюдения.