Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ПОЛИМОРФИЗМА rs2551715 ГЕНА ГЛУТАТИОНРЕДУКТАЗЫ У ЧЕЛОВЕКА

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генетики, а именно к разработке методов генотипирования полиморфизма генов ферментов антиоксидантной системы у человека.

Система антиоксидантной защиты представляет собой разветвленную, многокомпонентную сеть физиологически активных веществ, объединяющих ферментные и неферментные соединения, которые включаются в работу последовательно, взаимно дополняя друг друга, тем самым, обеспечивая контроль окислительных реакций и инактивацию всего многообразия токсичных продуктов свободнорадикального окисления. Хорошо известно, что антиоксидантная система включает в себя большое количество звеньев, но генетически детерминированными являются антиоксидантные ферменты, характеризующиеся выраженными межиндивидуальными и популяционными различиями в ферментативной активности, благодаря наличию в структуре их генов функционально неравноценных полиморфных аллелей [Gutteridge J.M.C., Halliwell В. Antioxidants: Molecules, medicines, and myths // Biochemical and biophysical research communications. - 2010. - Vol.393, issue 4. - P.561-564]. В последние годы отмечается значительный интерес исследователей к изучению полиморфизма генов системы антиоксидантной защиты при различной патологии у человека.

Глутатионредуктаза, GSR (OMIM 138300) представляет собой фермент (ЕС 1.6.4.2), восстанавливающий активную форму глутатиона (GSH) из его дисульфидной формы (GSSG) с помощью НАДФН, тем самым, поддерживая достаточно высокий уровень глутатиона в различных типах клеток [Halliwell, В. Free raicals in biology and medicine / B. Halliwell, M.C.J. Gutteridge. - Fourth edition. - Oxford: University press, 2007. - 851 р.]. Восстановленный глутатион осуществляет детоксикацию перекиси водорода и гидроперекисей, которые возникают при реакции активных форм кислорода (АФК) с полиненасыщенными жирными кислотами мембран. Глутатион известен как главный природный антиоксидант, играющий важнейшую роль в контроле провоспалительных процессов и иммунной модуляции, вносит значительный вклад в регуляции внутриклеточного редокса-статуса, защищая клетки от окислительного стресса [Sies H. Glutathione and its role in cellular functions // Free Radic. Biol. Med. - 1999. - Vol.27, №9-10. - P.916-21]. Фермент глутатионредуктаза экспрессируется во многих тканях и органах, особенно в иммунокомпетентных клетках (лимфоциты, моноциты, дендритные клетки), костном мозге, тимусе, эндодотелии и эпителии бронхов.

Ген GSR расположен на хромосоме 8р21.1. Одним из наиболее частых полиморфизмов, потенциально способных оказывать влияние на экспрессию гена GSR, является tagSNP - Т/С полиморфизм (rs2551715) в 9 интроне гена. Недавно была обнаружена выраженная взаимосвязь данного полиморфизма с повышенным риском развития системной красной волчанки [Paula S. Ramos, James С. Oates, Diane L. Kamen et al. Variable association of reactive intermediate genes with systemic lupus erythematosus (SLE) in populations with different African ancestry // J. Rheumatol - 2013. - Vol.40, №6. - P.842-849]. Это наглядно демонстрирует функциональную значимость полиморфизма rs2551715 гена GSR и открывает перспективы дальнейших исследований по оценке вовлеченности данного полиморфизма в развитие различных болезней человека.

Существует несколько разработанных методик генотипирования полиморфизма rs2551715 гена GSR. Компания Life Technologies предлагает коммерческий набор для генотипирования данного полиморфизма с помощью технологии ПЦР с дифференцировкой аллелей посредством флуоресцентно меченых TaqMan-зондов, так называемая TaqMan SNP Genotyping Assay [http://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/browse/genotyping/keyword/rs2551715?ICID=uc-snp-rs2551715].

Кроме того, компания предлагает набор для проведения автоматического секвенирования методом Сенджера участка гена GSR, охватывающего полиморфизм rs2551715 [http://www.lifetechnologies.com/order/genome-database/browse/pcr-sequencing-primers/keyword/rs2551715?ICID=uc-ce-rs2551715]. Наряду с указанными технологиями существует метод генотипирования посредством гибридизационных ДНК-чипов, которые специально разработаны для генотипирования большого спектра генетических маркеров (от нескольких десятков до сотен тысяч полиморфизмов) на больших выборках пациентов для решения научных задач. Одним из таких ДНК-чипов является панель SNPlex, разработанная компанией Applied Biosystems (USA) [Dai Z., Papp A.C., Wang D., Hampel H., Wolfgang S. Genotyping panel for assessing response to cancer chemotherapy // BMC Med Genomics. - 2008. Vol.1. - P.24.; Depondt C., Godard P., Espel R.S., Da Cruz A.L., Lienard P., Pandolfo M. A candidate gene study of antiepileptic drug tolerability and efficacy identifies an association of CYP2C9 variants with phenytoin toxicity // Eur. J. Neurol. - 2011. Vol.18, №9. - P.1159-1164.]. В то же самое время, до настоящего времени не разработан рутинный метод генотипирования Т/С полиморфизма гена GSR с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и рестрикционного анализа. Следует отметить, что указанные выше методы, несмотря на свою высокую чувствительность и специфичность, требуют специального дорогостоящего оборудования, а также специальных наборов реагентов, необходимых для проведения анализа, что, в конечном счете, выливается в крайне высокую себестоимость генотипирования данного полиморфизма у отдельно взятого пациента. Таким образом, анализ литературных данных показывает, что на сегодняшний день не существует простого в исполнении, чувствительного, легко воспроизводимого и недорого метода идентификации полиморфизма rs2551715 гена GSR-метода полимеразной цепной реакции в сочетании с рестрикционным анализом, который мог бы использоваться в качестве рутинного метода генотипирования в ПЦР-лаборатории со стандартным набором оборудования и реактивов.

Технический результат - разработать простой в исполнении и экономически целесообразный способ генотипирования однонуклеотидного полиморфизма rs2551715 гена GSR с помощью полимеразной цепной реакции и полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ).

Технический результат достигается следующим образом: при разработке способа генотипирования полиморфизма rs2551715 гена GSR использовали образцы геномной ДНК, выделенные из замороженной венозной крови стандартным двухэтапным методом фенольно-хлороформной экстракции (Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генной инженерии. Молекулярное клонирование. / Пер. с анг. М.: Мир, - 1984. - 480 с.). Сначала на основе нуклеотидной последовательности гена глутатионредуктазы (Gene ID: 2936, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/2936) с помощью программы "GeneFisher" 1.3 (http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de) была подобрана пара олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих интересуемую область гена GSR, имеющих следующую структуру:

F: 5′-GGAAGAAGCAATGAAATTTGATC-3′ (SEQ ID NO 1);

R: 5′-CCGAAACATTTGTGAATCTCC-3′ (SEQ ID NO 2).

Кроме того, в 3′ конце антисмыслового праймера (SEQ ID NO 2) была внесена нуклеотидная замена (искусственно измененный нуклеотид подчеркнут). Таким образом, посредством ПЦР-опосредованного сайт-направленного мутагенеза искусственно создается сайт рестрикции для эндонуклеазы BssT1I (сайт узнавания C↑CWWGG/GGWWC↓C), который включает в себя нуклеотидную замену Т>С (rs2551715).

Изобретение поясняется фигурой. На фигуре представлены результаты электрофоретического разделения продуктов ПЦР-рестрикции полиморфизма rs2551715 гена GSR. При наличии аллеля Т существует сайт узнавания для эндонуклеазы BssT1I, которая расщепляет ампликон размером 138 п.н. на два фрагмента размерами 114 и 24 п.н. При наличии аллеля С гена GSR происходит потеря сайта узнавания для эндонуклеазы BssT1I, в результате чего ампликон остается нерасщепленным данной рестриктазой и визуализируется в виде одного фрагмента размером 138 п.н. У гетерозиготных носителей СТ благодаря наличию обоих аллельных вариантов гена присутствуют все три фрагмента ДНК: 138, 114 и 24 п.н. Для демонстрации эффективности разработанного способа идентификации полиморфизма rs2551715 гена GSR было проведено генотипирование тотальной ДНК 23 добровольцев.

При разработке способа генотипирования полиморфизма rs2551715 гена GSR использовали праймеры, которые были синтезированы в компании "Синтол" (г. Москва). Амплификацию проводили на многоканальном термоциклере "Терцик" (ЗАО НПФ "ДНК-Технология", г. Москва).

При приготовлении растворов для проведения ПЦР использовали импортные реагенты высокой степени очистки (Ultra pure и Biotechnology Grade). ПЦР проводили в 12 мкл реакционной смеси, содержащей 0,5 мкл образца геномной ДНК. Смесь для амплификации включала: 67 мМ Трис-HCl pH=8,8, 16,6 мМ сульфата аммония, 6,7 мкМ ЭДТА, 2,5 мM MgCl₂, 1 мМ β-меркаптоэтанола, 1 мМ каждого dNTPs (dATP, dCTP, dTTP и dGTP), 15 нМ каждого из праймеров и 1U (1 единица активности) Taq-полимеразы. Для предотвращения испарения амплификационной смеси и образования конденсата на реакционную смесь наслаивали по 30 мкл минерального масла.

Параметры ПЦР были следующими: "горячий старт" в течение 5 мин при 94°C, затем 38 циклов амплификации в режиме 94°C - 30 сек; 55°C - 35 сек; 72°C - 40 сек, заключительный цикл элонгации ДНК - 7 мин при 72°C. Размер амплифицированного в ходе ПНР фрагмента гена GSR составил 138 пар нуклеотидов (п.н.). С целью проверки качества амплификации интересуемого фрагмента ДНК нуклеотидную последовательность продукта ПНР гена GSR секвенировали на генетическом анализаторе ABI PRISM 310 Genetic Analyzer с использованием набора реактивов Big Dye Termination Kit 1.1 ("Applied Biosystems", США). Контроль успешности проведения ПНР осуществлялся с помощью электрофореза продуктов амплификации на 2% агарозном геле. Обнаружение полиморфизма rs17522918 гена GSR проводилось путем обработки ампликона 5U (5 единиц активности) эндонуклеазой BssT1I (ООО "Сибэнзим", г. Новосибирск; прототип StyI) согласно протоколу, описанному производителем фермента. Рестрикционную смесь термостатировали в течение 6 ч при температуре 60°C. После инкубации фрагменты ДНК фракционировали с помощью электрофореза в 3% агарозном геле, приготовленном на основе ТАЕ буфера (0.089 М Трис-HCl, 2 мМ ЭДТА, 0,089 М борная кислота) с 0,01% бромистым этидием. Фракционирование фрагментов ДНК проводили в камере для горизонтального электрофореза SE-2 (ООО "Хеликон", г. Москва) в течение 40 мин при напряжении 180 В. В качестве маркера молекулярного веса использовали ДНК фага λ, гидролизированную эндонуклеазой PstI. Разделенные фрагменты ДНК визуализировали на трансиллюминаторе с помощью прибора компьютерной видеосъемки GDS-8000 ("UVP", США). Документирование и обработка изображений электрофоретических гелей проводилась с помощью аналитического пакета Labworks.

Таким образом, представленные результаты показывают, что предлагаемый способ позволяет эффективно идентифицировать полиморфизм rs2551715 в гене глутатионредуктазы с помощью предложенного нами метода ПЦР-ПДРФ. В связи с низкой себестоимостью анализа, обусловленной низкой ценой эндонуклеазы BssT1I (стоимость 1000 единиц активности фермента составляет 365 руб., данного количества будет достаточно для генотипирования полиморфизма до 200 человек) отечественного производства ООО "Сибэнзим" (http://russia.sibenzyme.com/info47.php), предлагаемый способ генотипирования может быть применен в любой ПНР-лаборатории с минимальным набором оборудования и реактивов.