Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОДЕЛИ ХРОНИЧЕСКОГО ПАРОДОНТИТА У КРЫС

Изобретение относится к экспериментальной медицине, в частности к стоматологии, и предназначено для моделирования хронического пародонтита у крыс с целью изучения последующего клинического лечения.

Воспалительное заболевание пародонта представляет собой серьезную медико-социальную проблему. Пародонтит, который может приводить к выпадению зубов, обнаруживается у 85-90% людей старше 40 лет. Высокая трудоемкость лечения развившихся стадий воспалительных заболеваний пародонта диктует необходимость изыскания точных, объективных методов диагностики, позволяющих определить ранние признаки поражения тканей пародонта, отслеживать клиническую симптоматику в динамике, оценивать эффективность применяемых способов лечения.

Известен способ получения модели пародонтита, включающий помещение половозрелых крыс в общую клетку площадью 0,018 м² на особь, в котором перед помещением в клетку под эфирным наркозом, используя стоматологический цемент, создают искусственную зубную бляшку вокруг шейки верхних и нижних резцов с шероховатой поверхностью, заходящую под десну на 0,1-0,5 мм, при этом в процессе моделирования животные получают кашицеобразную пищу (патент RU 2252009, МПК A61K 6/06, G09B 23/28, 2004 год).

Недостатком известного способа является его сложность, обусловленная использованием специального цемента и необходимостью создания искусственных зубных бляшек.

Известен способ получения модели воспаления пародонта у крыс, вызванного острой механической травмой мягких тканей десны, в котором под легким эфирным наркозом крысам вводили металлический крючок так, чтобы животные не могли его уронить, с губной стороны параллельно зубному ряду на глубину 1,5 мм в зубодесневую борозду в области верхних резцов (Вохминцева Л.В.. Рымарь С.С, Маянская Н.Н., Железный П.А. "Функциональная активность нейтрофилов у крыс с воспалительным процессом в пародонте на фоне пониженной функции щитовидной железы", Стоматология (Москва) 2, 2009, с. 4-7)(прототип).

Недостатком известного способа является его ненадежность и повышенная травматичность, поскольку крепление крючка в десне ничем не фиксируется и может быть нарушено.

Таким образом, перед авторами стояла задача разработать простой и надежный, обеспечивающий минимальную травматичность способ получения модели хронического пародонтита у крыс.

Поставленная задача решена в предлагаемом способе получения модели хронического пародонтита у крыс путем нанесения острой механической травмы мягких тканей десны под анестезией, в котором вводят иглу цельнометаллическую длиной 12 мм в десневой край с вестибулярной поверхности правого нижнего зуба с медиального края вплотную вдоль зуба с небольшим усилием для разрыва тканей и внедрение в костную часть челюсти.

В настоящее время из патентной и научно-технической литературы не известен способ получения модели хронического пародонтита у крыс путем введения иглы цельнометаллической длиной 12 мм в десневой край с вестибулярной поверхности правого нижнего ряда с медиального края вплотную вдоль зуба.

Исследования, проведенные авторами, позволили сделать вывод о предпочтительном использовании для создания модели хронического пародонтита способа путем нанесения механической травмы вследствие анатомического строения пародонта у крыс. Так, авторами установлены три основных видовых особенности строения нижних резцов и их пародонта у крыс: во-первых, хрящевое соединение верхушек альвеолярных отростков; во-вторых, изогнутая форма корня зуба; в-третьих, "гидростатическая подушка" в области изгиба корня, выстланная амелобластическим эпителием (постоянно откладывающим эмаль на фронтальную поверхность коронки зуба). Таким образом, наличие "гидростатической подушки" в области изгиба корня создает больший риск нарушения соединения зуба с периодонтом, особенно на вестибулярной поверхности, где оно имеет минимальную площадь. Следовательно, нанесение механической травмы в этой области приведет к образованию пародонтального канала, который соединиться с полостью "гидростатической подушки", в результате чего формируются «ворота», способствующие прогрессированию воспалительного процесса в пародонте.

При этом патогенез воспаления происходит в четыре стадии следующим образом. На первой стадии начального воспаления происходит нарушение целостности эпителия за счет увеличения межклеточных щелей - важный фактор в развитии воспаления десны. Это нарушение происходит в результате деполимеризации гликозаминогликанов межклеточного вещества пародонта, а также вследствие действия противовоспалительных цитокинов ИЛ-1а и ИЛ-В, простагландинов, хемокинов и активированных С-реактивных белков комплемента - С3а, С5а. Кроме того, внутри кровеносных сосудов вследствие изменения ряда клеток эпителия наблюдается адгезия лейкоцитов к их стенкам. Лейкоциты, прикрепившиеся к эндотелию сосудов, начинают генерировать целый ряд цитотоксических свободных радикалов.

Фаза раннего воспаления проявляется клинически в виде незначительного воспаления краевой десны и кровоточивости десен. Для стадии раннего воспаления характерно проникновение в ткани десны большого количества (до 70% общего количества клеток) лимфоцитов мелкого и среднего размера, а также макрофагов, плазматических и тучных клеток. Поэтому морфологической особенностью ранней стадии воспаления являются именно плотные межклеточные инфильтраты с преобладанием лимфоцитов на препаратах. Кроме лимфоцитарных инфильтратов на ранней стадии морфологически выявляется разрушение коллагеновых волокон (до 70%) и соединительной ткани циркулярной связки, а также наблюдаются патологические изменения фибробластов.

В стадию установившегося воспаления наблюдается картина смешанного инфильтрата: мелкие и средние лимфоциты, крупные плазматические клетки. Это свидетельствует о том, что в тканях наблюдается одновременно картина и хронического и острого пародонтита. На этой стадии активируются и остеокласты, однако выраженных разрушений кости еще не происходит.

Фаза прогрессирующего воспаления состоит в том, что плазматические клетки составляют до 80% всех клеток экссудата. Это свидетельствует о хронизации воспаления и активном вовлечении иммунных механизмов воспаления. Количество плазматических клеток нарастает пропорционально тяжести процесса и степени разрушения тканей. Глубокие поражения претерпевают сосуды пародонта, его кровоснабжение нарушается. Прогрессирует разрушение коллагеновых тканей элементов и активная резорбция кости.

Авторами выявлено, что у грызунов, в начале клеточной фазы воспаления, преобладает нейтрофильная инфильтрация. Позже в очаге воспаления появляются лимфоциты, макрофаги и плазматические клетки. Последние доминируют в тканевой фазе при хроническом воспалении. Т- и В-лимфоциты, а также макрофаги помимо обеспечения реакции гуморального и клеточного иммунитета оказывают и разрушающее действие на клетки либо в результате прямого цитотоксического действия, либо опосредованно за счет выделения цитокинов, коллагеназы и других веществ.

Созданная авторами модель хронического пародонтита у крыс предназначена для поиска или создания фармакологических препаратов, коррегирующих эту патологию. Созданная модель предназначена для определения точных сроков хронизации процесса, что в последующем определяет достоверность создания модели именно хронического пародонтита. Модель позволяет определить момент начала лечения данной патологии. Если лечение начать ранее 19 суток, то говорить о хроническом воспалении рано, речь идет только об остром пародонтите.

Предлагаемый способ может быть осуществлен следующим образом. Под общей анестезией на фоне внутрибрюшинного тиопенталового наркоза из расчета 0,1 мл 5% тиопентала натрия на 100 грамм веса животного, вводится игла цельнометаллическая длиной 12 мм в десневой край с вестибулярной поверхности правого нижнего резца с медиального края вплотную вдоль зуба с небольшим усилием для разрыва тканей и внедрения в кость. Проводится визуальное наблюдение за внешними признаками воспаления: оценка цвета десны альвеолярного отростка нижней челюсти, измерение размера отека, консистенции, инструментально, с помощью стоматологического зонда, проводят измерения глубины десневого кармана и наличие кровоточивости, определяют подвижность.

Через 10, 14, 19, 25 суток после операции крыс декапитируют. Все болезненные процедуры выполняют согласно Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным. Зубы и часть альвеолярного отростка нижней челюсти фиксируют в 10% растворе формалина. Изготавливают срезы толщиной 3-5 мкм, которые окрашивают гематоксилином и эозином по стандартной методике для гистологического исследования.

Предлагаемый способ иллюстрируется следующим примером конкретного исполнения.

Пример. Исследования проведены на пяти крысах линии Вистар (средней массой тела 252 г), полученных из вивария Уральского государственного медицинского университета. Животные находились на обычном полноценном общевиварном рационе со свободным доступом к воде в едином температурном и световом режимах.

Под общей анестезией на фоне внутрибрюшинного тиопенталового наркоза из расчета 0,1 мл 5% тиопентала натрия на 100 грамм веса животного вводилась игла цельнометаллическая длиной 12 мм в десневой край с вестибулярной поверхности правого нижнего резца с медиального края вплотную вдоль зуба с небольшим усилием для разрыва тканей и внедрения в кость.

На 2-е сутки после травматизации наблюдалось удовлетворительное состояние десны, без видимых патологических изменений. Десна не увеличена в размерах, плотной консистенции, без нарушения краевого прилегания.

На 3-й сутки в области введения иглы наблюдалось появление отека, белесоватого цвета, размером 0,8-1 мм, плотной консистенции, плотность прилегания краевой десны к зубу не нарушена, кровоточивость отсутствует.

На 4-е сутки отек приобрел разлитой характер, увеличение произошло до 1,5-2 мм. Белесоватый цвет наблюдался в области введения иглы, а у основания альвеолярного отростка десна приобрела синюшный цвет. Произошла незначительная рецессия десны на 0,1 мм, десневой карман не зондировался, кровоточивость отсутствовала.

На 5-е сутки произошло значительное увеличение отека до 0,7-0,9 см в сторону основания альвеолярного отростка, плотной консистенции. В пришеечной части экспериментальных животных выявлен зубной налет. Отмечалась незначительная кровоточивость.

На 10-е сутки отмечалось неоднородное увеличение отека до 1-1,1 см, выраженная гиперемия в области шеек зубов, плотной консистенции, десневой карман увеличен на 0,2-0,3 мм, незначительная кровоточивость. Отмечено появление темного цвета в месте введения иглы.

На 14-е сутки наблюдался неравномерный отек в верхней и нижней частях альвеолярного отростка. В месте введения иглы десна рыхлая, гиперемирована, маргинальная часть легко отслаивается гладилкой от зуба, зубодесневой карман соответствовал 3 мм, легко кровоточил. У основания альвеолярного отростка отек белесоватого цвета, размером 0,4-0,5 см, плотной консистенции. При этом замечено окрашивание эмали в черный цвет в пришеечной области зубов.

На 19-е сутки сохранилась неравномерность распределения отека на альвеолярном отростке с увеличением размера как в верхней, так и в нижней части альвеолярного отростка. Отмечался обильный мягкий зубной налет. В передней части альвеолярного отростка отек имел бело-красный цвет, а в его боковых частях наблюдался синюшный оттенок десны. Эмаль в пришеечной области приобрела темный цвет. Размер зубодесневого кармана равен 7 мм, легко кровоточил при зондировании, подвижность в вестибулооральном направлении незначительная.

На 25-е сутки размер отека составил 0,9-1 см, гиперемированный, очень плотной консистенции, десневой карман 7 мм, при зондировании кровоточил.

При микроскопическом анализе гистологических препаратов визуально отмечено появление инфильтрата стадии установившегося воспаления на 14-е сутки, что соответствует острой фазе воспаления. Появление в поле зрения плазматических клеток выявлено на 19-е сутки, а значительное их увеличение на 25-е сутки исследования.

На фиг.1 изображен гистологический срез альвеолярного отростка десневой ткани экспериментального животного на 25-е сутки исследования, на котором в поле зрения обильное количество плазматических клеток, что подтверждает наличие хронического процесса пародонтита.

Таким образом, авторами предлагается простой и надежный способ моделирования хронического пародонтита на экспериментальных животных, обеспечивающий минимальную травматизацию. Созданная модель представляет обширные возможности для исследования уже имеющихся фармакологических препаратов, а также поиск или создание новых лекарственных форм при исследовании на стадии хронического процесса.