СПОСОБ БИОХИМИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ МИКРОЭЛЕМЕНТНОГО ДИСБАЛАНСА У СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ КОПЫТНЫХ ЖИВОТНЫХ

Изобретение относится к области ветеринарии и охраны среды обитания человека, поскольку получение экологически чистой продукции животноводства непосредственно влияет на качество продуктов питания людей. Способ может быть использован для ранней диагностики, в том числе при стертых клинических проявлениях, затрудняющих постановку диагноза обычными диагностическими методами.

В современной геохимической экологии взаимодействие между живыми организмами и средой их обитания рассматривается через поток атомов химических элементов и их соединений. Поступая в организм через пищевые цепи, химические элементы выполняют различные функции, их соединения частично трансформируются в процессе метаболизма, аккумулируются тканями или выводятся с экскрементами и выдыхаемым воздухом. При этом существенная роль принадлежит биологической роли микроэлементов.

По теории, выдвинутой академиком В.В. Ковальским, отдельные химические элементы поступают в организм в основном в комплексе с другими, они обладают специфическими функциями. Считается, что каждый микроэлемент имеет четко очерченные точки приложения в общем метаболизме веществ. Именно с этими свойствами химических элементов связано развитие у животных и человека особой группы заболеваний (микроэлементозов), связанных с избытком, недостатком или дисбалансом поступления химических элементов в организм.

[Ковальский В.В. Геохимическая экология. М.: Наука, 1974. 300 с.].

В настоящей заявке мы рассмотрим 3 химических элемента: Cu, Mo и W. Первые два из них являются «истинными микроэлементами» - для них известны как гипер-, так и гипомикроэлементозы. Биологическая роль вольфрама менее изучена.

Медь - типичный металл, склонный к комлексообразованию. Содержание меди в Земной коре составляет 47 мг/кг, а в морской воде - 3 мкг/л. В наземных растениях присутствует меди 4-9 мг/кг сухого вещества, а в наземных животных - 5-30 мг/кг. Существуют организмы, концентрирующие медь, например асцидии (Busicon), членистоногие и ракообразные. В крови моллюсков содержится гемоцианин, осуществляющий перенос кислорода к клеткам. Обнаружение меди в организме моллюсков было сделано В. Bizio в 1833 г.

[Виноградов А.П. Биогеохимические провинции и эндемии // Докл. АН СССР, 1938. Т. 18. №4/5. С.820].

Медь - незаменимый микроэлемент, необходимый для нормальной жизнедеятельности организмов, включая растения, животных и человека. Соединения меди легко всасываются в кровь из желудочно-кишечного тракта (5-10% - у взрослых животных и 15-30% - у молодняка). Для меди характерен гомеостаз, регулируемый физиологически за счет ее всасывания и выделения. Концентрация меди в сыворотке крови животных практически равны 1000 мкг/л, а в цельной крови приближается к 1200-1300 мкг/л.

Значение меди в обменных процессах животного организма начало выявляться в результате работ висконсинской группы исследователей в США, показавших, что недостаток меди является причиной так называемой молочной анемии у крыс. Это наблюдение привело к установлению значения меди для процессов кроветворения и использования железа в организме [Hart Е.В., Waddell J., Elvehjem C.A. Irin in Nutrition. VII. Copper as supplement to iron for hemoglobin in the rat // J. Biol. Chem., 1928. Vol.77. №2. P.797-812.]. Вслед за этими работами появились сообщения об эндемических заболеваниях овец и крупного рогатого скота во Флориде, Голландии и Австралии, связанных с недостатком меди в пастбищных растениях и предупреждаемых включением в рацион животных небольших количеств медных соединений. Последующие исследования выявили широкую распространенность медной недостаточности среди различных видов животных. Было установлено, что медь кроме участия в кроветворении необходима также для нормального течения многих физиологических процессов - пигментации и кератинизации шерсти, остеогенеза, формирования миелина, воспроизводительной функции и других.

Молибден был открыт в 1778 г. К. Шееле как металл, подобный графиту и свинцу. Его содержание в Земной коре составляет 1,1-1,5 мг/кг. Наземные растения содержат Мо 0,2-8 мг/кг сухой массы, а животные организмы - 0,2-2 мг/кг. В конце 19 - начале 20 столетия была открыта биологическая фиксация азота с участием молибдена.

Молибден относится к микроэлементам, биологическая важность которых считается неоспоримой. Особенно большое значение этот элемент имеет в азотном обмене растений, животных и человека. Необходимость и специфичность молибдена доказана для ряда окислительно-восстановительных ферментных систем, участвующих в процессах восстановления нитратов и биологической азотфиксации у растений и микроорганизмов, а также в реакциях пуринового обмена в животном организме.

Растворимый в воде Mo⁶⁺, вводимый в виде солей молибденовой кислоты (молибдат натрия и аммония), Мо из нерастворимых соединений, таких как MoO₃, CaMoO₄, а также из трав и пищевого рациона быстро и практически полностью всасывается в желудочно-кишечном тракте различных лабораторных и сельскохозяйственных животных. Лишь в небольших количествах Mo всасывается из желудочно-кишечного тракта при введении его в форме MoS₂. При введении крысам раствора молибдата натрия (Na₂MoO₄) (pH 7,0-7,5) всасывание его из желудочно-кишечного тракта крыс составляло примерно 85%. Мо обнаруживается во всех органах млекопитающих, но наиболее богата им печень.

Среднее содержание молибдена в крови 14,7±1,2 мкг/л [Ермаков В.В., Сафонов В.А., Тютиков С.Ф. Географические особенности варьирования микроэлементов в крови крупного рогатого скота // Биогеохимия элементов и соединений токсикантов в субстратной и пищевой цепях агро- и аквальных систем. Тюмень: ТГСХА, 2007. С.100-103]. По результатам наших исследований содержание молибдена в крови крупного рогатого скота зависит от региона и изменяется от 10 до 30 мкг/л. Последняя цифра характерна для коров из молибденовой биогеохимической провинции Северного Кавказа (Тырныауз). Соединения молибдена, всасываясь в желудочно-кишечном тракте, выводятся из организма животных с однокамерным желудком в основном с мочой. Причем степень экскреции зависит от уровня сульфатов. Повышенные концентрации сульфатов тормозят или блокируют реабсорбцию Мо в почечных канальцах. Из организма коров и овец молибден экскретируется с мочой. Для человека общая кратность накопления микроэлемента равна 32, а период полувыведения - 27,5 суток.

Вольфрам - химический элемент VI группы периодической системы Менделеева, порядковый номер 74, атомная масса 183,85; тугоплавкий тяжелый металл светло-серого цвета. В природе состоит из смеси пяти стабильных изотопов с массовыми числами 180, 182, 183, 184 и 186.

Вольфрам мало распространен в природе; однако установлено, что у некоторых архебактерий и бактерий имеются ферменты, включающие вольфрам в своем активном центре. Существуют облигатно-зависимые от вольфрама формы архебактерий-гипертермофилов, обитающие вокруг глубоководных гидротермальных источников.

Пыль вольфрама, как и большинство других видов металлической пыли, раздражает органы дыхания. Существуют данные об антагонизме молибдена и вольфрама на молекулярном уровне при действии их на активность ксантиноксидазы молока (КСО - ЕС 1.17.3.2). Известна группа термофильных бактерий, где вольфрам-содержащие ферменты играют важную роль в их жизнедеятельности.

Современный уровень развития техники характеризуется нижеследующими патентами-аналогами нашего способа.

Известен способ прогнозирования развития послеоперационных осложнений, включающий исследование крови путем определения активности ее белковых составляющих, а именно - ксантиноксидазы. При превышении активности фермента в сыворотке крови выше 1,25±0,04 у.е. или снижении ниже 1,16±0,03 судят о возможностях развития осложнений [пат. РФ №2222014, G01N 33/48, опубл. 10.01.2004].

Способ весьма спорный с точки зрения биохимии, поскольку известно, что Мо- и Cu-содержащий фермент ксантиноксидаза в организме высших млекопитающих катализирует превращение гипоксантина в ксантин и далее в мочевую кислоту [Зайцев С.Ю., Конопатов Ю.В. Биохимия животных. Фундаментальные и клинические аспекты: Учебник. - СПб.: Издательство «Лань», 2004. - 384 с.]. Данная биохимическая реакция активно протекает в печени, почках и слизистой кишечника. Кроме данных органов высокие количества ксантиноксидазы обнаруживаются в крови и молоке. Однако уверенному определению фермента в сыворотке крови мешает ряд факторов. Кроме того, встает вопрос о самой взаимосвязи активности фермента (тем более в столь узком интервале) и наличии патологического состояния в организме. Метод интересен, однако он позволяет лишь отнести человека к группе риска, а не диагностировать у него конкретную патологию.

Известен способ диагностики нарушений гепетобилиарной системы у новорожденных детей и детей раннего возраста из группы перинатального риска. Метод также, как и предыдущий, относится к медицине. Характеризуется тем, что у детей в первые 12 месяцев жизни определяют активность ксантиноксидазы в сыворотке крови. При значениях активности фермента 10,2 нмоль/(с·мл) и ниже диагностируют морфофункциональные нарушения гепатобилиарной системы, обусловленные поражением паренхиматозной ткани печени. По мнению авторов, использование данного способа позволяет поставить диагноз на ранних сроках у детей, перенесших перинатальную гипоксию.

Способ страдает недостатками предыдущего. Кроме того, в данном случае речь вообще не идет о «норме», поскольку все дети заведомо перенесли перинатальную гипоксию.

[Пат. РФ №2389029, G01N 33/68, опубл. 10.05.10].

Известен способ оценки микроэлементного статуса региона, осуществляемый путем биоиндикации территории, при этом в качестве биоиндикаторов используют мышечную ткань диких копытных животных и их сельскохозяйственных видов-аналогов, определяют содержание в ней микроэлементов, сравнивают полученные результаты с критическими уровнями содержания элементов в пищевых продуктах, выход за границы которых свидетельствует об ухудшении микроэлементного статуса региона. Способ апробирован на примере 4 элементов: Zn, Cu, Mn, Se.

Недостатком способа является проведение сложной биопсии внутренних органов, связанные с этим материальные затраты и потеря продуктивности животных.

[Пат. РФ №2280869, G01N 33/50, опубл. 23.07.06].

Согласно пат. РФ №2477483 (G01N 33/50, опубл. 10.03.2013), разработанному ранее нами и взятому за прототип, способ диагностики хронических микроэлементозов сельскохозяйственных копытных животных характеризуется отбором образцов шерсти путем настрига ее с кисти хвоста, квартованием их до получения усредненной пробы в количестве 1,0-1,4 г, пробоподготовкой образца, включающей многократную обработку его в бидистиллированной воде при 30-40°C при постоянном шутелировании, последующую сушку при 105-110°C до воздушно-сухого состояния, озолением пробы в смеси концентрированной азотной и хлорной кислот, анализом концентраций микроэлементов и сравнением полученных результатов с данными критических концентраций элементов, по выходу за пределы которых судят от наличии заболевания. Анализ концентраций микроэлементов проводят методом атомно-адсорбционной спектроскопии, а для оценки полученных результатов используют данные верхних критических концентраций для стронция и меди, равные 10-11 мг/кг, для молибдена, свинца, ртути - 0,20-0,26 мг/кг, а для кадмия - 0,033 мг/кг.

Способ апробирован на примере определения Cu, Mo, Sr, Pb, Cd, однако возможность оценки не только Cu-Mo и Mo-W дисбаланса в организме копытных животных отсутствовала. Не обеспечивалась также возможность рассмотрения антагонистических взаимосвязей указанных химических элементов в среде обитания.

Задачей изобретения является также расширение числа видов биологических индикаторов в прижизненной диагностике микроэлементного дисбаланса у сельскохозяйственных копытных животных и повышение репрезентативности результатов оценки среды их обитания.

Поставленная задача решается тем, что в способе биохимической диагностики дисбаланса Cu, Mo и W у сельскохозяйственных копытных животных, включающем подготовку проб биоиндикаторов, определение в них содержания микроэлементов и оценку полученных результатов, в качестве биоиндикаторов используют образец пахты, выделенный из молока сельскохозяйственных копытных животных, определяют в нем валовое содержание меди, молибдена и вольфрама, находят отношение валовых содержаний Cu/Mo и Mo/W, причем при значениях отношения Cu/Mo, не превышающих 1, а отношения Mo/W, не превышающих 250, считают, что дисбаланс микроэлементов в организме животных и среде их обитания отсутствует, а при превышении указанных значений диагностируют наличие микроэлементного дисбаланса.

Обычно подготовку пробы биоиндикатора ведут путем отстаивания образца молока в холодильной камере в течение не менее 24 час при температуре не более 3-5°C, последующего отделения жировой составляющей молока, сепарирования, отделения масла и отбора образца пахты. Целесообразно образцы молока отбирать у не менее 1% лактирующих особей дойного стада, а для установления микроэлементного дисбаланса региона отбирать не менее 3 образцов молока на 1000 га сельскохозяйственных угодий.

Определение содержания микроэлементов ведут методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной аргоновой плазмой.

У лактирующих самок сельскохозяйственных копытных, обычно это крупный рогатый скот, берется образец молока объемом не менее 500 мл. Для статистически достоверного диагностирования микроэлементного дисбаланса у животных достаточно отобрать образцы молока у 1% лактирующих особей дойного стада (но не менее 3 особей - в случае небольшого хозяйства). Для уверенной констатации регионального микроэлементного дисбаланса необходимо исследовать не менее чем по 3 образца молока на каждую 1000 га сельскохозяйственных угодий (сенокосы и выпасы). При этом алиментарная привязка животных должна быть при отсутствии привозных комбикормов.

Пахта стоит отдельно от других молочных продуктов, потому, что получают ее не из молока, как всю остальную кисломолочную продукцию, а путем сбивания (или пахтанья) масла из сливок или сметаны. В результате этого процесса получается мутная, кисловатая на вкус жидкость, которая многими своими свойствами похожа на сыворотку, которая содержит полезные, биологически активные вещества.

В пахте есть белки, жиры, молочный сахар - лактоза, органические кислоты. Много в ней различных элементов - калия, натрия, кальция и магния, фосфора и железа, а также витамины группы B, витамины E и PP и даже немного витамина C.

Пахта в большом количестве содержит Cu-Mo-ксантиноксидазу, а также открытый нами ранее новый (для высших млекопитающих) фермент - W-ксантиноксидазу. Исследования нашей лаборатории показали, что для повышения достоверности оценки Cu/Мо дисбаланса среды обитания необходимы данные соотношения Mo/W. [Ермаков В.В., Тютиков С.Ф., Данилова В.Н. и др. Связь меди, молибдена и вольфрама в биогеохимической пищевой цепи // Материалы VII Междунар. начно-практ. конф. «Тяжелые металлы и радионуклиды в окружающей среде» (5-7 октября 2012 г.). Т.1. С.435-441].

В полиэтиленовой или стеклянной таре с завинчивающейся крышкой он доставляется в лабораторию, где производится его дальнейшая пробоподготовка.

Пробоподготовку производят в два этапа:

Первый этап (первичная пробоподготовка):

1. Молоко выдерживают в холодильнике в течение не менее 24 часов при 3-5°C.

2. Аккуратно снимают сливки в количестве не менее 50 мл.

3. Используя шюттель-аппарат отделяют сливочное масло.

4. Отбирают образец пахты (полупрозрачная белесая жидкость, остающаяся после отделения масла) объемом не менее 20 мл, который поступает на второй этап аналитической пробоподготовки.

Аналитическую пробоподготовку и приборное определение меди, молибдена и вольфрама производят согласно МУК 4.1.1483-03 от 29.06.2003 г.«Методы контроля. Химические факторы. Определение содержания химических элементов в диагностируемых биосубстратах, препаратах и биологически активных добавках методом масс-спектрометрии с индуктивно связанной аргоновой плазмой». Полученные данные усредняют общепринятыми математическими методами и определяют отношение валовых содержаний Cu/Мо и Mo/W. При значениях Cu/Mo-отношения не менее 1, а Mo/W-отношения не менее 250 считают, что дисбаланс химических элементов в организме животных и среде их обитания отсутствует. При превышении указанных критических значений диагностируют наличие микроэлементного дисбаланса.

Пример 1

В АОЗТ «Ника» Чернянского района Белгородской области у 10 коров дойного стада были отобраны образцы молока (по 500 мл). Для анализа использовали по 50 мл полученной пахты. Результаты анализа концентраций микроэлементов в пахте дали следующие результаты (мкг/л): Cu - от 102,3 до 148,1; Мо - от 73,3 до 109,2 и W - от 0,1 до 0,4. Использовали масс-спектрометрический метод анализа.

Отношение Cu/Мо находилось в пределах 1,4-1,7, a Mo/W - в пределах 733-273. Исходя из вычисленных среднестатистических отношений химических элементов констатируем:

1) отсутствие у коров хронического Cu-Мо и Mo-W дисбаланса,

2) отсутствие хронического Cu-Мо и Mo-W дисбаланса в среде их обитания.

Пример 2.

На рынке г. Тырныауз Эльбрусского района Кабардино-Балкарской Республики было куплено молоко местных коров (количество образцов 6). Площадь выпаса и сенокоса не превышает 1500 га. Количество субстанций в пробах и метод анализа аналогичны примеру 1. Результаты анализа концентраций микроэлементов в пахте дали следующие результаты (мкг/л): Cu - от 583,3 до 702,1; Мо - от 697,7 до 893,2 и W - от 3,8 до 4,8. Исходя из вычисленных отношений концентраций химических элементов, констатируем 1) наличие у коров хронического Cu-Мо и Mo-W дисбаланса и 2) наличие хронического Cu-Мо и Mo-W дисбаланса в среде их обитания.

Таким образом, данный метод диагностики позволяет прижизненно устанавливать наличие у животных микроэлементного дисбаланса различной этиологии, а равно и устанавливать нарушение естественных соотношений элементов в среде их обитания. Он сравнительно прост и позволяет практически единовременно обследовать значительное количество животных и крупный регион в целом.

Способ может быть использован для экологического картирования, выявления неблагоприятных участков исследуемых регионов и дифференцированной оценки загрязнения регионов вольфрамом.