СПОСОБ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ПЛАНИРОВАНИЯ СКАНИРОВАНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ УЛЬТРАФИОЛЕТОВОГО ИЗЛУЧЕНИЯ

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0001] В медицине при получении изображений подготовленных образцов ткани с помощью микроскопического анализа возникает потребность в первоначальном определении местоположения ткани на твердом носителе. С целью более эффективного получения изображений срезов ткани система должна, во-первых, точно «знать», где именно находится ткань на твердом носителе. В самом простом виде система должна «осмотреть» весь твердый носитель и определить, какие участки являются тканью, а какие являются стеклом, меткой или инородным веществом. Местоположение ткани затем преобразуется в контурную линию области. Координаты данной области затем отображаются в виде карты в пространстве положений предметного столика микроскопа. Это позволяет программировать движение микроскопа с целью покрытия соответствующих областей твердого носителя и обхода областей, где отсутствует ткань. Этот способ часто называют планированием сканирования.

[0002] Хотя более предпочтительным может оказаться получение информации о местоположении ткани непосредственно во время проведения анализа, использование стандартных меток оказывается затруднительным в связи с вариативностью предметных стекол и операторов. Планирование сканирования ткани часто более предпочтительно, поскольку оно обеспечивает создание более надежных и воспроизводимых планов и одновременно позволяет не зависеть от требований в отношении специальных предметных стекол или особых методов крепления.

[0003] Типичные способы планирования сканирования включают выполнение грубого сканирования всего твердого носителя с относительно низким увеличением (например, х1,25) с целью определения местоположения ткани, изображение которой оцифровывается, воспроизводится и предоставляется пользователю в виде увеличенного изображения образца до проведения более детального анализа.

[0004] Для установления различия между тканью и твердым носителем современные способы часто опираются на цвет или структуру. Существует ряд потенциальных проблем, связанных с этими способами, так как при их использовании весьма вероятен захват следов чернил или побочных меток на предметном стекле, а также опорной перекрестной штриховки на гранях некоторых предметных стекол. В случае маркирования ткани флуоресцентными красителями время захвата изображения часто оказывается большим и возникает вероятность того, что окрашенный образец ткани может подвергнуться обесцвечиванию до завершения процесса получения изображения. Далее, когда ткань окрашивается флуоресцентными красителями, часто краситель локализуется в некоторой подобласти ткани и не покрывает полностью всю ткань, что затрудняет установление точного различия между тканью и не тканью, что возможно при использовании таких красителей как гематоксилин и эозин (Н&Е), которые видны на светлопольных изображениях. Следовательно, для флуоресцентных красителей требуются другие способы обнаружения. Наконец, современные методы, как правило, не обеспечивают нормальной работы с неокрашенными тканевыми срезами, поскольку тонкие тканевые срезы в значительной степени прозрачны в видимом свете, в результате формируется недостаточно информации, которая может быть обработана точным образом.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ

[0005] Во-первых, изобретение касается способа определения местоположения одного или более образцов ткани по существу круглой формы, расположенных на твердом носителе. Способ включает этапы подачи света заданной длины волны на образец ткани, в котором этом свет вызывает автофлуоресценцию, идентификации положения центра образца ткани с помощью автофлуоресцентного света, корреляции координат положения центра образца ткани на твердом носителе с помощью системы координат х, у и составления карты координат образца ткани на твердом носителе для различения областей, содержащих образец ткани, и незаполненных областей.

[0006] Во-вторых, изобретение касается устройства для определения местоположения одного или более образцов ткани по существу круглой формы, расположенных на твердом носителе. Устройство содержит микроскоп для формирования изображений, имеющий хотя бы один объектив для получения изображений с различным увеличением и предметный столик для размещения образца на твердом носителе, источник возбуждения для освещения образца на предметном столике, устройство формирования цифрового изображения, соединенное с микроскопом, для получения и оцифровки изображений образца, устройство памяти, связанное с устройством цифрового изображения и способное хранить оцифрованные изображения образца; а также процессор, связанный с устройством памяти и способный распознавать цифровые изображения и формировать один или более согласованных фильтров в зависимости от коэффициента корреляции.

ЧЕРТЕЖИ

[0007] Указанные и другие особенности, аспекты и преимущества настоящего изобретения будут более понятны из последующего подробного описания со ссылкой на сопровождающие чертежи, на которых подобные символы соответствуют подобным деталям на всех указанных чертежах.

[0008] На фиг.1 показана схема многоэтапного способа получения и анализа изображений в соответствии с настоящим изобретением.

[0009] На фиг.2 дано схематическое представление тканевой микроматрицы, показывающее в координатах х-у направление получения изображений с использованием масочного фильтра в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения.

[0010] На фиг.3 представлено изображение автоматизированной системы, способной определять местоположение образца ткани на твердом носителе.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0011] Нижеследующее подробное описание изобретения является иллюстративным и не имеет целью ограничить изобретение в части различных вариантов его применения. Более того, изобретение не ограничено какой бы то ни было теорией, представленной в ранее описанных предпосылках к созданию изобретения, равно как и не сводится только к последующему подробному описанию фигур.

[0012] В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения предлагается способ определения местоположения образца ткани по существу круглой формы на твердом носителе с использованием автофлуоресценции. Предлагаемый способ предполагает освещение образца ткани ближним ультрафиолетовым светом, в результате чего возникает автофлуоресценция. Автофлуоресценция связана с энергией и амплитудой излучения фотонов, испущенных эндогенными соединениями в ткани или образце ткани под воздействием внешнего источника фотонов, когда отсутствует введение или присоединение какого бы то ни было экзогенного флуоресцентного соединения. Тем самым автофлуоресценция отличается от излучения, вызванного введением или присоединением такого флуоресцентного соединения и облучением внешним источником фотонов. Энергия фотона находится в ультрафиолетовом или видимом диапазоне.

[0013] Макроизображение образца ткани, в которой происходит автофлуоресценция, получается при использовании стандартного фотографического объектива с целью захвата всего твердого носителя, включая любую идентификационную маркировку, и получения единого изображения. В качестве идентификационной маркировки обычно используют индикаторы на твердом носителе, такие как перекрестная штриховка на гранях или углах твердого носителя.

[0014] В качестве твердого носителя может использоваться, но не ограничивается этим, предметное стекло микроскопа, предметное стекло тканевой микроматрицы или микротитровальный планшет. Освещение образца производится до начала флуоресцентного маркирования. Как только изображение образца получено, оно обрабатывается для идентификации положения образца ткани на твердом носителе.

[0015] Фиг.1 иллюстрирует пример методики, которая может применяться для получения изображений в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения. На фиг.1 показана схема многоэтапного способа получения и анализа изображений, включающего подачу света заданной длины волны на образец ткани, в котором этот свет вызывает автофлуоресценцию, идентификацию положения центра образца ткани на основе использования автофлуоресцентного света, корреляцию положений центра с существующим шаблоном образца ткани для создания вторичного цифрового изображения, которое присваивает пиксельные значения каждому участку цифрового изображения, создание двумерной системы координат и на основе пиксельных значений формирование карты координат образца ткани на твердом носителе для различения областей, содержащих образец ткани, и незаполненных областей на данном твердом носителе.

[0016] Первый этап способа включает освещение образца ткани по существу круглой формы на твердом носителе ближним ультрафиолетовым светом, в результате чего возникает автофлуоресценция. В одном варианте в качестве источника света используется стандартная галогенная ртутная лампа. Выражение «по существу круглой формы» относится к образцу ткани, для которого расстояния от точек на внешней границе образца до центроидной точки внутри образца имеют близкую величину, и в результате полученное изображение признается круглым. Центроидная точка соответствует положению центра образца ткани. Такие круглые изображения описываются в журнале «Proc. Natl. Acad. Sci. USA», том 95, стр.12783-12786, октябрь 1998.

[0017] В качестве образца ткани по существу круглой формы может использоваться любой материал ткани, например тканевые микроматрицы (tissue micro-array, TMA), образец ткани, полученный биопсией, или биологический образец. Образец ткани может быть заморожен или зафиксирован с помощью консерванта, такого как формалин, или обработан иным образом. Образец ткани может быть неокрашенным или окрашенным для улучшения контрастности в диапазоне видимого света. Образец ткани может включать набор однородных клеток, полученных из биологического образца, которые могут выполнять сходную функцию. В некоторых вариантах образец ткани может включать набор однородных клеток, полученных из ткани человека. Приемлемыми примерами ткани человека являются, но не ограничиваются этим, (1) эпителий; (2) соединительные ткани, включая кровеносные сосуды, костную ткань и хрящевую ткань; (3) мышечная ткань и (4) нервная ткань. Источником образца ткани может выступить твердая ткань, полученная из свежего, замороженного и/или законсервированного органа или образца ткани или полученная в результате биопсии или аспирации кровь или ее составляющие; жидкости, присутствующие в теле человека, такие как спинномозговая жидкость, амниотическая жидкость, перитональная жидкость или внутритканевая жидкость; или клетки, полученные на любом этапе беременности или развития человека. В некоторых вариантах образец ткани содержит эмбриональные клетки, или культивируемые клетки, или клеточные линии.

[0018] В некоторых вариантах образец ткани содержит тканевые срезы здоровой или больной ткани (например, тканевые срезы толстой кишки, легких, простаты). Образец ткани может содержать отдельную часть или фрагмент какого-либо тканевого среза, например, тонкий срез ткани или клеточный срез из тканевого среза. В некоторых вариантах один и тот же образец ткани может быть подвергнут как морфологическому, так и молекулярному анализу.

[0019] Образец ткани может быть постоянно или временно зафиксирован на твердом носителе, что обеспечивает его анализ, перенос или передвижение во время процесса подготовки и получения изображения. В качестве твердого носителя могут использоваться предметное стекло, микротитровальный планшет, диск, чашка Петри, гелевая пластина или блок-кассета. Твердый носитель может быть изготовлен из стекла, пластика или другого материала.

[0020] Образец ткани может быть частью тканевой микроматрицы (ТМА). В таком качестве образец ткани является одним из множества образцов, содержащихся в тестовых лунках, выполненных на едином стекле микроматрицы. Количество тестовых лунок, а значит и количество индивидуальных образцов ткани на едином стекле варьируется в зависимости от конструкции матрицы. Например, ТМА может быть спроектирована таким образом, что каждый индивидуальный образец ткани включает круглую тестовую лунку диаметром 0,6 мм на расстоянии 0,7-0,8 мм друг от друга, в результате чего площадь поверхности каждого образца составляет 0,282 мм².

[0021] На втором этапе автофлуоресцентный свет используется для захвата цифрового изображения образца. В некоторых вариантах может оказаться желаемым захватить полное изображение образца ткани на твердом носителе в виде единого изображения, используя стандартный фотографический объектив с низким увеличением. В некоторых других вариантах может быть зафиксирована только часть твердого носителя. Единое изображение может также содержать идентификационную маркировку на твердом носителе, такую как наклейка или маркировка штриховкой.

[0022] Образец может быть освещен до того, как происходит какая-либо флуоресцентная маркировка образца. Могут использоваться не флуоресцентные красители и индикаторы, такие как DAPI, до начала процесса захвата изображения, при условии, что эти красители не влияют на автофлуоресценцию образца. Процесс захвата изображения может производиться с помощью камеры, с использованием процессора и объектива. Процессор позволяет получать свет от объектива и соответственно формировать цифровое изображение.

[0023] На третьем этапе цифровое изображение образца ткани, полученное с помощью камеры, обрабатывают с целью сравнения данного изображения с изображением шаблона, содержащим упрощенное представление величины и формы образца ткани. Когда образец ткани является частью тканевой микроматрицы, изображение шаблона представляет номер и местоположение каждого индивидуального образца ткани, размещенной в тестовых лунках.

[0024] В одном варианте осуществления производится сравнение цифрового изображения с изображением шаблона. Процесс сравнения фактического изображения образца и изображения шаблона дает на выходе двумерное пиксельное изображение, которое масштабируется и регистрируется, и включает определение положения центра образца ткани. Процесс сравнения цифрового изображения и изображения шаблона в пространственной области может включать использование взаимной корреляции с нулевым средним, взаимной корреляции нормализованной спектральной плотности мощности (power spectral density, PSD) или их комбинации.

[0025] Если образец ткани является тканевой микроматрицей (ТМА), содержащей тестовые лунки, то результирующее двумерное сравнительное пиксельное изображение может выдавать яркое световое пятно, локализованное по центру каждой тестовой лунки ТМА. Положения центров ярких пятен могут быть преобразованы в двумерную сетку в координатном пространстве, заданном предметным стеклом. Двумерная сетка может представлять собой декартову систему координат с двумя осями под прямым углом друг к другу, задающими плоскость (плоскость ху).

[0026] Как показано далее на фиг.1, в одном варианте процесс сравнения на четвертом этапе формирует изображение двухцветного согласованного фильтра, которое соответствует пиксельному размеру образца ткани на твердом носителе. Двухцветный согласованный фильтр является двумерным цифровым конструктивным элементом, спроектированным так, чтобы представлять идеализированный вариант (в пространственных или спектральных координатах) объекта, который должен быть идентифицирован или извлечен из другого цифрового изображения. В случае, когда образец ткани является частью ТМА, состоящей из тестовых лунок, согласованный фильтр может быть использован для обработки изображения тканевой микроматрицы с созданием макроизображения каждого образца ткани.

[0027] Двухцветный согласованный фильтр может быть белым изображением на черном фоне, где размер белого изображения в пикселях соответствует размеру образца ткани в пикселях. В некоторых вариантах макроизображение образца ткани создается с использованием взаимной корреляции с нулевым средним, при этом пространственные пиксельные значения цифрового изображения образца ткани оценивают в зависимости от интенсивности и преобразуют в изображение в спектральной области. В качестве подходящего спектрального преобразования может выступать преобразование Фурье, вейвлет-преобразование, дискретное косинусное преобразование, вычисление нормализованной спектральной плотности мощности или аналогичное представление в виде ряда.

[0028] В некоторых вариантах функция преобразования изображения, такая как, например, быстрое преобразование Фурье, выполняется как над согласованным фильтром, так и над изображением тестового образца. Может быть сформировано новое изображение, где каждому пикселю присваивается значение интенсивности на основе анализа наилучшего соответствия изображению согласованного фильтра.

[0029] Зная размеры и количество тестовых лунок ТМА, оператор может определить число захватов изображения или зон обзора, необходимых для захвата всей тканевой микроматрицы. В результате на пятом этапе, как показано на фиг.1, может быть создан план сканирования, который дает последовательность координат для захвата для каждого из захватов изображения. Например, для тканевой микроматрицы требуется набор захватов изображения два на два, центральная точка рассматривается в качестве начала отсчета при расчете координат каждого из четырех захватов изображения. Исходя из того, что (х, у) - это центр ТМА, a w является шириной одного захвата, выходные координаты будут равны (х-w/2, у-w/2), (х+w/2, у-w/2), (х+w/2, у+w/2) и (х-w/2, у+w/2). Сетка в координатном пространстве ТМА может использоваться для получения изображения тканевой микроматрицы для проведения количественного или качественного анализа.

[0030] На фиг.2 представлен схематический вид тканевой микроматрицы с указанием направления получения изображения в координатах х-у с использованием плана сканирования, построенного в прямоугольной системе координат, где х и у являются двумя перпендикулярными линиями, определяющими плоскость х, у.

[0031] В одном варианте план сканирования может быть создан на основе первоначального определения некоторого порогового значения для различения светлых пятен, интенсивность которых достаточна для центров тестовых лунок ТМА, и других пятен с недостаточной для этого интенсивностью. Начиная с пятна с максимальной интенсивностью, используется алгоритм многократного выбора области и назначения ее в качестве центральной точки каждой тестовой лунки. Область, окружающая центральную точку и соответствующая расчетному диаметру тестовой лунки, затемняется. Целью затемнения области, прилегающей к светлому пятну, является недопущение выбора нескольких «центров» для одного пятна. Затем производится выбор области со следующей по убывающей пиксельной интенсивностью и процесс повторяется до тех пор, пока все предметное стекло не будет проанализировано для выявления светлых пятен.

[0032] На основе ввода размера захвата изображения из микроскопа, а также размера и числа светлых пятен алгоритм позволяет получить на выходе координаты каждой из расчетных тестовых лунок ТМА. Эти координаты упорядочивают, создавая план сканирования, который минимизирует движение предметного столика. Например, план сканирования может стартовать с тестовой лунки, размещенной в левом нижнем углу ТМА (если смотреть на предметное стекло сверху вниз), и двигаться по извилистой линии назад и вперед по рядам тестовых лунок в направлении верха предметного стекла ТМА. Для каждой тестовой лунки используется подобная траектория движения в виде серпантина с целью экономии движения.

[0033] Как показано на фиг.2, предметный столик может двигаться в прямоугольной системе координат (плоскость х, у) для получения сканированного изображения ТМА 30, начиная с тестовой лунки в левом нижнем углу 32 и двигаясь назад и вперед по рядам в направлении к верху ТМА 34 по образцу серпантина 36. Получение изображений происходит на основе плана сканирования, что показано сплошной линией.

[0034] Как показано на фиг.3, для осуществления способов, описанных выше, может использоваться автоматизированная система 10. Система 10, как показано, может содержать микроскоп 12 для формирования изображений с источником возбуждения 14, устройство формирования цифрового изображения 16, устройство памяти 18 для хранения, хотя бы временного, одного или нескольких изображений и процессор 20, который распределяет изображения по категориям и формирует один или более согласованных фильтров на основе коэффициента корреляции.

[0035] Микроскоп 12 для формирования изображений может иметь по меньшей мере один объектив 13 для получения изображений с различным увеличением и предметный столик 15 для размещения образца ткани, расположенного на твердом носителе. Предметный столик используется для размещения образца таким образом, чтобы он мог быть виден в конкретном месте на твердом носителе. Источник возбуждения 14 является источником света, испускающим ближнее ультрафиолетовое излучение, которое направлено на образец ткани на твердом носителе, что вызывает в образце автофлуоресценцию.

[0036] Устройство формирования цифрового изображения 16 может содержать цифровую камеру (не показана) для получения изображений образца ткани при автофлуоресценции. Устройство 16 обладает свойством автофокусировки и способно поддерживать данную функцию и регулировать фокус по мере необходимости в процессе работы.

[0037] Устройство памяти 18 может содержать, но не обязательно ограничено этим, любой накопитель на жестких дисках, связанный с процессором 20, например ПЗУ (постоянное запоминающее устройство, read only memory, ROM), ОЗУ (оперативное запоминающее устройство, random access memory, RAM) или динамическое ОЗУ (dynamic random access memory, DRAM), а также любое подходящее устройство памяти на дисках, такое как цифровой универсальный диск (DVD), или компакт-диск (CD), или zip-дисковод, или карта памяти. Данное устройство памяти может быть дистанционным по отношению к процессору 20, но доступным посредством любого подходящего соединительного устройства или коммуникационной сети, включая, но не ограничиваясь этим, локальные сети, кабельные сети, спутниковые сети, а также Интернет, независимо от того, проводная или беспроводная связь при этом используется. В качестве процессора 20 может применяться центральный процессор (central processing unit, CPU), а также он может содержать микропроцессор, микроконтроллер и цифровой сигнальный процессор (digital signal processor, DSP).

[0038] Система 10 может также содержать дисплейное устройство 22 для отображения одного или более изображений и передающее устройство (не показано) для передачи цифровой информации. В качестве дисплейного устройства 22 может использоваться любое подходящее устройство, способное отображать цифровое изображение, например такие устройства, которые имеют в своем составе жидкокристаллический дисплей или электронно-лучевую трубку. Передающее устройство может содержать любое подходящее средство передачи цифровой информации по системе связи, включая, но не ограничиваясь этим, проводную или беспроводную системы связи.

[0039] В одном из вариантов эта система может быть включена в качестве элемента в состав аналитического устройства, такого как автоматизированная система с высокой пропускной способностью, которое может заполнять тканевые микроматрицы образцами и получать их изображения в одной системе и далее анализировать эти изображения. В одном варианте система позволяет производить освещение образца и захватывать цифровые изображения с использованием различных оптических систем, включая такие, которые работают за пределами области автофлуоресценции, например систему для получения изображений по методу светлого поля. В другом варианте автоматизированная система может включать машиночитаемый носитель с командами для выполнения автоматического анализа автофлуоресценции.

[0040] Хотя выше были проиллюстрированы и описаны только определенные признаки изобретения, специалисты в данной области техники могут предложить многие модификации и изменения. Таким образом, следует понимать, что последующие пункты формулы изобретения предусматривают включение всех таких модификаций и изменений, которые входят в рамки изобретения.