×
27.01.2015
216.013.20bf

Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОДГОТОВКИ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР В ВИДЕ СФЕРОИДОВ ДЛЯ ФОРМИРОВАНИЯ БИОИНЖЕНЕРНОЙ КОНСТРУКЦИИ ПЕРЕДНИХ СЛОЕВ ИСКУССТВЕННОЙ РОГОВИЦЫ

Вид РИД

Изобретение

Аннотация: Изобретение относится к области медицины, офтальмологии и биотехнологии. Предложен способ подготовки клеточных культур в виде сфероидов для формирования передних слоев искусственной роговицы, включающий использование кусочков лимба. Изобретение может использоваться для конструирования передних слоев искусственной роговицы с целью компенсации поврежденных тканей роговицы глаза. 1 пр.
Основные результаты: Способ подготовки клеточных культур в виде сфероидов для формирования передних слоев искусственной роговицы, включающий изолирование кусочков лимба, перенос в чашки Петри в раствор Хенкса с антибиотиками, тщательное отмывание, механическое измельчение с помощью ножниц, ферментативную диссоциацию в 0,25% растворе трипсина, центрифугирование, высевание в пластиковые чашки Петри в плотности 100000 клеток/мл в среду, из расчета на 1000 мл раствора, следующего состава: DMEM 445 мл; F12 445 мл; L-глютамин 1,5 г; пенициллин 250000 международных единиц; стрептомицин 200,0 мг; инсулин-трансферрин-селенит ×100 10 мл; сыворотка крови эмбрионов коров 100 мл, культивирование со сменой среды каждые 2-3 дня, снятие с чашек Петри после второго пассажа клеток с помощью растворов версена и 0,25%-ного трипсина, центрифугирование, высевание в концентрации 300000 клеток/мл на агарозные планшеты, помещение в лунки 12-луночных культуральных планшетов в полной ростовой среде, культивирование в термостатируемой камере прибора Cell-IQ при температуре 37°C и 5% CO, заселение тканевых матриксов 7-дневными сфероидами из стволовых эпителиоидных и мезенхимальных клеток лимбальной зоны глазного яблока, снятие клеток с подложки с использованием растворов версена и 0,25%-ного трипсина, центрифугирование, ресуспендирование, доведение до концентрации 600000 клеток в 200 мкл среды и помещение на тканевые матриксы, помещение в термостатируемую камеру прибора Cell-IQ и культивирование при температуре 37°C и 5% CO.

Изобретение относится к области медицины, в частности к офтальмологии, и может быть использовано для формирования биоинженерной конструкции передних слоев искусственной роговицы на основе тканевого матрикса и культивированных клеток лимбальной зоны глазного яблока.

Разработки в области создания биоинженерных конструкций искусственной роговицы являются одними из самых перспективных для решения проблемы дефицита донорских роговиц. Материал для создания биоинженерных конструкций тканевых матриц искусственных роговиц должен обладать прозрачностью, биосовместимостью, биоинертностью, адгезивностью, заданной стабильностью к биодеградации, иметь определенную пористость, высокую прочность на разрыв и эластичность.

Помимо выбора каркасной биополимерной конструкции, существует проблема ее заполнения клеточными элементами. Лимбальная зона глазного яблока является источником стволовых/прогениторных эпителиоидных и мезенхимальных клеток роговицы. Однако они, при длительном культивировании в монослое, меняют свой фенотип, теряют функциональные характеристики и становятся неспособными к заселению трехмерного матрикса. В настоящее время клеточные технологии находятся на этапе перехода на 3D культивирование. Технология культивирования 3D сфероидов из клеток лимбальной зоны трупного глаза человека позволяет длительно и полноценно сохранять фенотип и функциональные свойства специализированных клеток роговицы и может быть использована для создания биоинженерной конструкции передних слоев искусственной роговицы на базе тканевого матрикса из спидроина.

Авторам не известны аналоги способов подготовки клеточных культур в виде сфероидов для формирования передних слоев искусственной роговицы.

Задачей изобретения является способ подготовки клеточных культур в виде сфероидов для формирования передних слоев искусственной роговицы, созданной на основе тканевого матрикса и функционально дифференцированных клеток.

Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является возможность использования технологии 3D культивирования стромальных и эпителиоидных клеток лимбальной зоны на основе сфероидных технологий для конструирования передних слоев искусственной роговицы, с целью полной или частичной компенсации поврежденных тканей роговицы.

Технический результат достигается тем, что в способе подготовки клеточных культур в виде сфероидов для формирования передних слоев искусственной роговицы, изолированные кусочки лимба переносятся в чашки Петри диаметром 100 мм в раствор Хенкса (NaCl 80,0 г/л, KCl 4,0 г/л, MgSO4×7H2O 1,0 г/л, MgCl2×6H2O 1,0 г/л, Na2HPO4×7H2O 0,9 г/л, KH2PO4 0,6 г/л, глюкоза 10,0 г/л, CaCl2 1,4 г/л, феноловый красный 2,0 г/л) с антибиотиками (пенициллин 250000 международных единиц и стрептомицин 200,0 мг), тщательно отмываются, механически измельчаются с помощью ножниц, ферментативно диссоциируются в 0,25% растворе трипсина, центрифугируются, высеваются в пластиковые чашки Петри в высокой плотности (100000 клеток/мл) в полную ростовую среду следующего состава: DMEM 445 мл; F12 445 мл; L-глютамин 1,5 г; пенициллин 250000 международных единиц; стрептомицин 200,0 мг; инсулин-трансферрин-селенит ×100 10 мл; сыворотка крови эмбрионов коров 100 мл (из расчета на 1000 мл раствора), культивируются со сменой среды каждые 2-3 дня, после второго пассажа клетки снимаются с чашек Петри с помощью растворов версена (натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты) и 0,25%-ного трипсина, центрифугируются, высеваются в концентрации 300000 клеток/мл на агарозные планшеты, помещенные в лунки 12-луночных культуральных планшетов в полной ростовой среде, культивируются в термостатируемой камере прибора Cell-IQ (Chip Man Technologies, Финляндия) в стандартных условиях (37°C, 5% CO2), тканевые матриксы заселяются 7-дневными сфероидами, сфероиды снимаются с агарозных планшетов полной ростовой средой, пассивно осаждаются в центрифужных пробирках по 15 мл, ресуспендируются в 200 мкл той же среды, переносятся по 300 единиц на тканевые матриксы, через 30 мин в лунки планшетов с клетками добавляется полная ростовая среда до 1 мл, накрываются планшеты специальной крышкой и помещаются в термостатируемую камеру прибора Cell-IQ (Chip Man Technologies, Финляндия) и культивируются в стандартных условиях (37°C, 5% CO2).

Изобретение поясняется следующим примером.

Пример

Первичные культуры эпителиоидных и стромальных клеток получали из тканевых сегментов лимба трупного глаза человека. Изолированные кусочки лимба переносили в 100 мм чашки Петри в раствор Хенкса (NaCl 80,0 г/л, KCl 4,0 г/л, MgSO4×7H2O 1,0 г/л, MgCl2×6H2O 1,0 г/л, Na2HPO4×7H2O 0,9 г/л, KH2PO4 0,6 г/л, глюкоза 10,0 г/л, CaCl2 1,4 г/л, феноловый красный 2,0 г/л) с антибиотиками (пенициллин 250000 международных единиц и стрептомицин 200,0 мг), тщательно отмывали, механически измельчали с помощью ножниц и ферментативно диссоциировали в 0,25% растворе трипсина (ПанЭко, Россия). После фильтрации клетки центрифугировали (8 мин, g=100 см2/с) и высевали в пластиковые чашки Петри в высокой плотности (100000 клеток/мл) в полную ростовую среду (на 1000 мл раствора: DMEM 445 мл; F12 445 мл; L-глютамин 1,5 г; пенициллин 250000 международных единиц; стрептомицин 200,0 мг; инсулин-трансферрин-селенит ×100 10 мл; сыворотка крови эмбрионов коров (HyClone, США) 100 мл). Культивировали в CO2 - инкубаторе при 5% CO2 и 37°C со сменой среды каждые 2-3 дня, после второго пассажа снимали с чашек Петри с помощью растворов версена (натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты) и 0,25%-ного трипсина, центрифугировали (7 мин, g=100 см2/с) и высевали в концентрации 300000 клеток/мл на агарозные планшеты (MicrotissuesTM, США), помещенные в лунки 12-луночных культуральных планшетов (Corning, США) в полной ростовой среде. Культивировали в термостатируемой камере прибора Cell-IQ (Chip Man Technologies, Финляндия) в стандартных условиях (37°C, 5% CO2).

Для подсчета количества клеток и их жизнеспособности использовали автоматический счетчик клеток Countess (Invitrogen, США).

Для заселения тканевых матриксов использовали 7-дневные сфероиды из стволовых/прогениторных эпителиоидных и мезенхимальных клеток лимбальной зоны глазного яблока. Сфероиды снимали с агарозных планшетов полной ростовой средой, пассивно осаждали в центрифужных пробирках по 15 мл, ресуспендировали в 200 мкл той же среды, переносили по 300 единиц на тканевые матриксы. Через 30 мин в лунки планшетов с клетками добавляли полную ростовую среду до 1 мл, накрывали планшеты специальной крышкой, помещали в термостатируемую камеру прибора Cell-IQ (Chip Man Technologies, Финляндия) и культивировали в стандартных условиях (37°C, 5% CO2).

Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет использовать технологию 3D культивирования стволовых/прогениторных эпителиоидных и мезенхимальных клеток лимбальной зоны глазного яблока на основе сфероидных технологий для конструирования передних слоев искусственной роговицы с целью полной или частичной компенсации поврежденных тканей роговицы.

Способ подготовки клеточных культур в виде сфероидов для формирования передних слоев искусственной роговицы, включающий изолирование кусочков лимба, перенос в чашки Петри в раствор Хенкса с антибиотиками, тщательное отмывание, механическое измельчение с помощью ножниц, ферментативную диссоциацию в 0,25% растворе трипсина, центрифугирование, высевание в пластиковые чашки Петри в плотности 100000 клеток/мл в среду, из расчета на 1000 мл раствора, следующего состава: DMEM 445 мл; F12 445 мл; L-глютамин 1,5 г; пенициллин 250000 международных единиц; стрептомицин 200,0 мг; инсулин-трансферрин-селенит ×100 10 мл; сыворотка крови эмбрионов коров 100 мл, культивирование со сменой среды каждые 2-3 дня, снятие с чашек Петри после второго пассажа клеток с помощью растворов версена и 0,25%-ного трипсина, центрифугирование, высевание в концентрации 300000 клеток/мл на агарозные планшеты, помещение в лунки 12-луночных культуральных планшетов в полной ростовой среде, культивирование в термостатируемой камере прибора Cell-IQ при температуре 37°C и 5% CO, заселение тканевых матриксов 7-дневными сфероидами из стволовых эпителиоидных и мезенхимальных клеток лимбальной зоны глазного яблока, снятие клеток с подложки с использованием растворов версена и 0,25%-ного трипсина, центрифугирование, ресуспендирование, доведение до концентрации 600000 клеток в 200 мкл среды и помещение на тканевые матриксы, помещение в термостатируемую камеру прибора Cell-IQ и культивирование при температуре 37°C и 5% CO.
Источник поступления информации: Роспатент

Показаны записи 141-150 из 198.
10.03.2016
№216.014.bee7

Способ прогнозирования перехода витреофовеолярного тракционного синдрома в сквозной макулярный разрыв

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и предназначено для прогнозирования перехода витреофовеолярного тракционного синдрома в сквозной макулярный разрыв. Для прогнозирования перехода витреофовеолярного тракционного синдрома в сквозной макулярный разрыв приняли коэффициент...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002576813
Дата охранного документа: 10.03.2016
10.03.2016
№216.014.bf0f

Способ получения органной культуры собственно сосудистой оболочки из глаза взрослого донора-трупа

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии и трансплантологии, и касается получения органной культуры собственно сосудистой оболочки глаза (ССО). Для этого удаляют из глазного яблока взрослого донора-трупа роговично-склеральный диск. Затем глазное яблоко осматривают на...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002576573
Дата охранного документа: 10.03.2016
10.03.2016
№216.014.bf22

Способ лазерного лечения первичной открытоугольной глаукомы после проведенной микроинвазивной непроникающей глубокой склерэктомии

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и касается лазерного лечения первичной открытоугольной оперированной глаукомы. Осуществляют воздействие на пигментные клетки и псевдоэксфолиации трабекулярной сети (ТС) глаза наносекундным Nd-YAG лазерным излучением длиной волны 532...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002576811
Дата охранного документа: 10.03.2016
10.03.2016
№216.014.c033

Способ диагностики друз диска зрительного нерва

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано для диагностики друз зрительного нерва. Измеряют площадь нейроретинального пояска зрительного нерва (Rim Aria), объема экскавации диска зрительного нерва. Диагностику проводят методом оптической когерентной...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002576810
Дата охранного документа: 10.03.2016
10.03.2016
№216.014.c124

Способ лазерного лечения гемангиомы хориоидеи

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для лечения гемангиомы хориоидеи (ГХ). Выявляют методом ангиографии с флюоресцеином или ангиографии с индоцианином зеленым фокусы новообразованных сосудов ГХ в хориоидальной и в ранней артериальной...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002576822
Дата охранного документа: 10.03.2016
27.03.2016
№216.014.c5f7

Способ диагностики состояния роговицы после проведенных на ней операций

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для определения состояния роговицы после проведенных на ней операций. После проведения операций на роговице на сроках наблюдения 2 недели, 1 месяц, 3 месяца проводят диагностику состояния роговицы. Определяют...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002578821
Дата охранного документа: 27.03.2016
27.03.2016
№216.014.c674

Способ получения органной культуры хороидально-пигментного комплекса из глаза взрослого донора-трупа

Изобретение относится к медицине. После удаления из глазного яблока взрослого донора-трупа роговично-склерального диска глазное яблоко при отсутствии сквозных повреждений радужной оболочки, цилиарного тела и видимой части собственно сосудистой оболочки (ССО) и выхода стекловидного тела за...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002578526
Дата охранного документа: 27.03.2016
27.03.2016
№216.014.c6f2

Способ комбинированного лазерного лечения диабетического макулярного отека

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и предназначено для наиболее эффективного и безопасного лечения диабетического макулярного отека. Дополнительно к СМЛВ проводят пороговую лазеркоагуляцию с нанесением коагулятов I степени по классификации L′Esperance в шахматном...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002578371
Дата охранного документа: 27.03.2016
20.02.2016
№216.014.ce33

Способ лечения рецидивирующих эрозий роговицы

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может применяться в лечении хронической и рецидивирующей эрозии роговицы различного генеза. Пациенту предварительно инсталлируют в конъюнктивальную полость глазные капли противомикробного действия, в качестве которых используют или...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002575590
Дата охранного документа: 20.02.2016
27.02.2016
№216.014.ce93

Способ лечения неоваскулярной глаукомы

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии, и касается лечения неоваскулярной глаукомы. Для этого сначала осуществляют введение ингибитора VEGF ранибизумаба в количестве 0,05 мл с помощью инъекционной иглы 30 G в проекции плоской части цилиарного тела в 3,5-4,0 мм от...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002575966
Дата охранного документа: 27.02.2016
Показаны записи 141-150 из 222.
20.09.2015
№216.013.7c6e

Устройство для субретинального дозированного введения стволовых клеток

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в офтальмологии для субретинального введения стволовых клеток. Устройство включает иглу 25g, внутри которой расположена канюля 41g, на выходе из иглы канюля изогнута под углом 90°, а ее конец заточен кнаружи под углом 60°, переходник...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002563451
Дата охранного документа: 20.09.2015
20.09.2015
№216.013.7c6f

Способ хирургического лечения сквозного идиопатического макулярного разрыва

Изобретение относится к офтальмологии и может быть использовано для хирургического лечения сквозного идиопатического макулярного разрыва. В 2,0-2,5 мм к нижневисочной аркаде от края разрыва отделяют кончик внутренней пограничной мембраны (ВПМ) от сетчатки. Захватив пинцетом кончик ВПМ, проводят...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002563452
Дата охранного документа: 20.09.2015
20.09.2015
№216.013.7dc8

Способ визуализации глазного дна

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмохирургии, и может применяться при выполнении витреоретинальных операций на артифакичных глазах. Проводят витрэктомию. На стадии тампонады стерильным воздухом в случае образования конденсата на задней поверхности ИОЛ с выполненным задним...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002563797
Дата охранного документа: 20.09.2015
20.10.2015
№216.013.855f

Способ оценки эффективности хирургического лечения птоза верхнего века

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, пластической хирургии и косметологии, и может быть использовано для оценки эффективности хирургического лечения птоза верхнего века. В проекции зрачка при помощи линейки измеряют ширину глазной щели парного глаза (ШГЩ ПГ), ширину...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002565746
Дата охранного документа: 20.10.2015
20.10.2015
№216.013.85af

Способ оценки стабильности монокулярной зрительной фиксации у пациентов с амблиопией

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано при оценке стабильности фиксации у пациентов с амблиопией. Определение стабильности фиксации проводят с помощью аппарата «МР-1» фирмы Nidek technologies. Пациент смотрит на фиксационную метку в виде креста....
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002565826
Дата охранного документа: 20.10.2015
20.11.2015
№216.013.92a8

Устройство для измерения подвижности и способ оценки подвижности парного глаза, опорно-двигательной культи и глазного косметического протеза

Группа изобретений относится к офтальмологии и может быть применима для оценки подвижности парного глаза (ПГ) и глазного косметического протеза (ГКП). Устройство состоит из приспособления в виде защитной маски с элементами для фиксации на лице пациента из полимерного эластичного материала с...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002569162
Дата охранного документа: 20.11.2015
27.11.2015
№216.013.93e6

Способ получения культуры клеток ретинального пигментного эпителия из глаза взрослого донора-трупа

Изобретение относится к медицине. Для получения культуры клеток ретинального пигментного эпителия (РПЭ) взрослого донора-трупа производят удаление из глазного яблока донора-трупа роговично-склерального диска. При целостности всех частей сосудистой оболочки, глазное яблоко без...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002569481
Дата охранного документа: 27.11.2015
20.12.2015
№216.013.9c95

Способ лечения больных с начальными признаками эпиретинальной мембраны

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и предназначено для лечения больных с начальными признаками эпиретинальной мембраны (ЭРМ). С помощью лазерной установки на область эпиретинальной мембраны в зонах ее контакта с сетчатой оболочкой наносят коагуляты. Длина волны...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002571710
Дата охранного документа: 20.12.2015
20.12.2015
№216.013.9c99

Способ подбора ортокератологических контактных линз у детей и подростков с миопией

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использовано при подборе ортокератологических контактных линз путем оценки течения их адаптационного периода у детей подростков с миопией. Перед подбором и после подбора ортокератологической контактной линзы проводят...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002571714
Дата охранного документа: 20.12.2015
27.01.2016
№216.014.bced

Способ пластики сквозного обширного или субтотального дефекта века, а также полностью утраченного века

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии и пластической хирургии, и может быть использовано для пластики сквозного обширного или субтотального дефекта века, а также для реконструкции при полной утрате века, обусловленной различными этиологическими факторами, такими как дефект...
Тип: Изобретение
Номер охранного документа: 0002573800
Дата охранного документа: 27.01.2016
+ добавить свой РИД