СПОСОБ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ВИНОГРАДА IN VITRO

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к способам размножения растений, и может быть использовано в виноградарстве для ускоренного размножения перспективных сортов винограда.

Известны различные способы с использованием, в основном, природных биологически активных соединений, таких как гиберреллины, цитокинины, ауксины, брассиностероиды. Однако одни из них являются дорогостоящими, другие не нашли широкого применения из-за недостаточной стабильности, нерастворимости в воде или высокой токсичности (ауксины). Поэтому создание способов получения посадочного материала с использованием дешевых, нетоксичных, хорошо растворимых в воде химических препаратов, действующих, как и фитогормоны в сверхмалых концентрациях, является актуальной задачей.

Известен способ клонального микроразмножения растений, включающий введение в питательную среду цитокининов [Методические рекомендации по клональному микроразмножению винограда. Ялта, 1986, с.25-29]. Недостатком его является большая трудоемкость процессов, связанная с частой пересадкой эксплантов, слабой их укореняемостью, возможностью нарушения генетической стабильности размножаемых растений.

Известен способ клонального микроразмножения винограда in vitro, включающий микрочеренкование пробирочных растений и высадку их на питательную среду Мурасиге и Скуга [Клональное микроразмножение и оздоровление посадочного материала винограда для создания из него сортовых маточников интенсивного типа. Рекомендации. М., 1992, с.12-13]. Недостатком этого метода является его ограниченная эффективность вследствие стрессовых условий для микрочеренков in vitro, ингибирования ростовых процессов эксплантов токсическими веществами, выделяемыми ими в питательную среду. Повторное субкультивирование ухудшает их состояние, снижает выход микрочеренков.

Известен способ оптимизации клонального микроразмножения винограда in vitro [RU 2264706 C2, опубл. 27.11.2005, Бюл. №33] - прототип. Способ включает микрочеренкование пробирочных растений и высадку их на жидкую питательную среду с уменьшенным количеством микроэлементов и витаминов с добавлением в ее состав индолилуксусной кислоты 0,1-0,3 мг/л и препарата Эмистим в концентрации 10^-7-10^-10%. Недостатком прототипа является использование дорогого препарата Эмистим, представляющего собой композицию ростовых веществ цитокининовой и гиббереллиновой природы, выделенных из корней женьшеня. Препарат используется вместе с индолилуксусной кислотой, также являющейся росторегулирующим препаратом.

Использование жидкой питательной среды так же усложняет процесс и снижает скорость высадки и приживаемость микрочеренков. Кроме того, при появлении бактериальной инфекции на жидкой питательной среде её трудно заметить, пока она не разовьётся в значительной степени и не приведет к гибели микрочеренка или даже растения.

Для получения хорошего, устойчивого посадочного материала элитных сортов винограда, необходимо использование высокоэффективных и дешевых регуляторов роста растений.

Задача изобретения - расширение арсенала известных способов клонального микроразмножения винограда in vitro, позволяющих улучшить приживаемость микрочеренков, регенерацию растений и их качественные показатели.

Технический результат заключается в действии синтетического росторегулирующего препарата Мелафена при клональном микроразмножении винограда in vitro.

Технический результат достигается заявляемым способом клонального микроразмножения винограда in vitro, включающим микрочеренкование пробирочных растений, высадку их на питательную среду в присутствии росторегулирующих веществ, в качестве которых используют препарат Мелафен в концентрации 10^-7-10^-11%.

Мелафен представляет собой меламиновую соль бис(оксиметил)фосфиновой кислоты общей формулы:

Препарат растворим в воде, малотоксичен (его LД₅₀ 2000 мг/кг - для мышей и 6000 мг/кг - для крыс). Растворы Мелафена стабильны при хранении годами.

Полученные на разнообразных культурах (зерновых, кормовых и овощных) экспериментальные данные позволили заключить, что Мелафен, как и фитогормоны, обладает полифункциональностью действия. Направленность физиолого-биохимических изменений в растениях под влиянием препарата подобна действию цитокининов на энергетический и метаболический обмен растений [Фаттахов С.Г., Лосева Н.Л., Коновалов А.И., и др. Влияние мелафена на рост и энергетические процессы растительной клетки // ДАН. 2004, Т.394, №1, С.127-129; Костин В.И., Костин О.В., Исайчев В.А. Состояние исследований и перспективы применения регулятора роста «Мелафен» в сельском хозяйстве и биотехнологии. Казань, 2006, С.26-34].

Мелафен, как и цитокинины, участвует в регуляции физиологических процессов в течение всего онтогенеза, в регуляции обмена веществ закончивших рост органов, повышает содержание пигментов, увеличивает интенсивность фотосинтеза, повышает скорость фотофосфорилирования, улучшает энергетический обмен растения [RU 2158735 C1, опубл. 10.11.2000 г. Бюл. №31].

Мелафен действует в чрезвычайно малых концентрациях, что делает его экологически безвредным. Его синтез прост, что обуславливает его дешевизну по сравнению с препаратами подобного назначения.

Известно влияние Мелафена на энергию прорастания и всхожесть семян, повышение урожайности и качества продукции зерновых [RU 2158735 C1, опубл. 10.11.2000 г. Бюл. №31; RU 2390984 C1, опубл. 10.06.2010, Бюл. №16; RU 2354106 C2, опубл. 10.05.2009, Бюл. №13].

Известно применение Мелафена в биотехнологии, а именно в способах получения алкалоидов при выращивании культуры клеток ткани, например, Раувольфии змеиной Rauwolfia Serpentina Benth [RU 2394100 C2, опубл. 10.07.2010, Бюл. №19; RU 2174555 C1, опубл. 10.10.2001 г.; RU 2323972 C1, опубл. 10.05.2008, Бюл. №13].

Однако возможность использования Мелафена при клональном микроразмножении винограда на этапе микрочеренкования неизвестна.

Новым в заявляемом способе является, то, что микрочеренки высаживают на питательную среду, содержащую синтетический росторегулирующий препарат Мелафен.

Заявляемый способ осуществляют следующим образом.

Готовят питательную среду Мурасиге и Скуга следующего состава:

Макроэлементы, мг/л:

Микроэлементы, мг/л:

Витамины, мг/л

а также

В состав среды добавляют препарат Мелафен в концентрациях 10^-7-10^-11%.

pH среды перед автоклавированием - 5.7-5.9.

Пробирки с питательной средой закрывают фольгой, помещают в штатив, который закрывают целлофаном, обвязывают шпагатом и автоклавируют в автоклаве ГК-100-3.

Отбирают растения винограда, регенерированные из апикальных меристем размером 0,1-0,2 мм и размноженные в культуре in vitro. Микрочеренкование осуществляют в операционной комнате в ламинарном боксе «Фортран». Побеги, имеющие 8-10 междоузлий, помещают на стерильную чашку Петри, разрезают на микрочеренки, имеющие глазок с листом. Длина микрочеренка - 10-12 мм, 2 мм над глазком, остальные - под глазком, Полученные микрочеренки высаживают в пробирки на твердую питательную среду.

Культивирование осуществляют в культуральной комнате при освещенности 2,0-3,0 тыс. люксов, фотопериоде - 16 часов, температуре 25-27±2°C, влажности воздуха 70-75%.

Наблюдение за ростом растений проводили при клональном микроразмножении сортов винограда Цимладар, Пухляковский и Варюшкин с использованием Мелафена в концентрациях 10^-7, 10^-9, 10^-11% в течение 3-х месяцев. Концентрации Мелафена определены ранее опытным путем для каждого размножаемого сорта.

Состав питательной среды, условия высадки и культивирование микрочеренков как в контроле, так и в опытных вариантах были одинаковыми за исключением того, что в контроле в питательной среде отсутствовал препарат Мелафен.

Получены четкие данные о положительном влиянии препарата Мелафен на клональное микроразмножение винограда сорта Цимладар (таблица 1). При концентрациях 10^-7, 10^-9, 10^-11% отмечено улучшение всех качественных показателей растений уже через 23 дня культивирования. Лучшие результаты получены при концентрации 10^-7%. Несколько хуже показатели в варианте с концентрацией 10^-9%. Дальнейшее уменьшение положительного эффекта отмечено при минимальной концентрации препарата. Особо следует отметить увеличение скорости роста в 1,6 раза по сравнению с контролем, а также корнеобразования, роста и облиственности растений, благодаря чему повышается готовность растений к адаптации в нестерильных условиях, эффективность клонального микроразмножения и конечный выход растений.

При дальнейшем культивировании (48 дней) скорость роста замедляется, но превосходит контрольный вариант в 1,2 раза; сохраняются преимущества препарата Мелафен по всем показателям роста при концентрациях 10^-7, 10^-9, 10^-11%.

При изучении действия препарата Мелафен на сортах Пухляковский и Варюшкин (таблицы 2, 3) таких четких данных не получено, но прослеживается тенденция улучшения качественных характеристик оздоровленных растений под влиянием регулятора роста Мелафен.

Результаты, представленные в таблице 2, полученные при культивировании в течение 30 и 60 дней сорта Пухляковский, демонстрируют улучшение приживаемости растений при всех исследуемых концентрациях, увеличение длины корней при концентрациях 10^-9, 10^-11%, ризогенной зоны при концентрации 10^-11%, высоты и облиствленности при концентрациях 10^-7, 10^-11% (30 дней культивирования), а при более продолжительном культивировании (60 дней) - увеличение высоты и длины корней при всех концентрациях, ризогенной зоны при концентрации 10^-11%, облиственности при концентрациях 10^-9, 10^-11%.

Данные таблицы 3 - сорт - Варюшкин демонстрируют увеличение длины корней и ризогенной зоны при всех концентрациях через 20 дней культивирования, через 54 дня культивирования увеличение облиствленности, числа корней и ризогенной зоны при концентрациях 10^-7, 10^-9%, а также улучшение приживаемости по сравнению с контролем при концентрации 10^-9%.

Результаты окончательного учета, проведенного через 3 месяца после посева на сорте Пухляковский, подтвердили положительное влияние препарата Мелафен на ростовые процессы полученных мериклонов (таблица 4) при концентрации 10^-11%. Увеличение длины (47,0 см против 41,1 см в контроле) и числа (4,7 шт., в контроле 3,8 шт.) корней, ризогенной зоны (220, 9 см, в контроле 156,2 см), длины (15,9 см, в контроле 15,4 см) и веса (0,06 мг, в контроле 0,05 мг) побегов, числа листьев (15,9 шт., в контроле 12,1 шт.) свидетельствует об эффективности указанной концентрации. Высокий коэффициент полярности указывает на преимущественное развитие корневой системы при этой концентрации.

Результаты таблиц 1-4 демонстрируют, что применение препарата Мелафен в качестве регулятора роста способствует улучшению морфогенеза растений в культуре in vitro и повышению эффективности клонального микроразмножения винограда за счет улучшения скорости роста на первом этапе культивирования и качественных характеристик растений.

Сравнение влияния препаратов Эмистим (прототип) и Мелафен, взятых в концентрации 10^-7% на эффективность клонального микроразмножения винограда in vitro на 50-й день культивирования на примере сорта Цимладар приведены в таблице 5. Из результатов таблицы видно, что основные качественные показатели растений, в частности длина корней, величина ризогенной зоны, скорость роста, коэффициент полярности, высота растений и выход растений при использовании препарата Мелафен значительно лучше.

Таким образом, применение препарата Мелафен в качестве регулятора роста позволило увеличить приживаемость и развитие микрочеренков, сократить в среднем в 1,5-3 раза цикл развития микрочеренков, регенерацию их в растения; у регенерированных растений улучшить корнеобразование и развитие ризогенной зоны, рост и облиственность побегов, готовность растений к адаптации в нестерильные условия, выход растений с улучшенными качественными показателями и, в целом, повысить эффективность клонального микроразмножения винограда.

Необходимо отметить, что Мелафен проявляет неожиданное, неочевидное действие, выражающееся в улучшении качественных показателей растений при повторном субкультивировании, то есть имеет место «последействие» Мелафена. Оно выражается в том, что растения, выращенные на питательной среде с добавлением препарата Мелафен, которые были вновь расчеренкованы и высажены на питательную среду без Мелафена (осуществлено второе субкультивирование), также проявляют улучшенные качественные показатели. Проверка последействия Мелафена дала неожиданный четко выраженный результат (таблица 6). У растений, которые были выращены на питательной среде с Мелафеном в концентрациях 10^-7, 10^-9%, при повторной пересадке на свежую питательную среду без Мелафена отмечено улучшение корнеобразования и ростовых процессов. Длина ризогенной зоны увеличилась в 1,4-2,5 раза, высота растений в 1,3 раза, увеличилась скорость роста. Всё это способствовало тому, что растения через 47 дней по своим параметрам были готовы к адаптации, то есть имело место ускорение микроразмножения и, в целом, повышение эффективности клонального микроразмножения. Это делает возможным применение Мелафена не при каждом субкультивировании, а через раз: первое субкультивирование - питательная среда (ПС) + Мелафен, второе субкультивирование - ПС без Мелафена и т.д. Улучшение качественных характеристик растений способствует процессу адаптации (более высокий выход адаптированных растений) с хорошим состоянием растений. Крепкие, прямостоячие, хорошо облиственные побеги с темно-зелеными листьями способствуют быстрой адаптации растений к условиям открытого грунта при закладке базисных маточников.

Также было проведено исследование клонального микроразмножения винограда in vitro на примере сорта Баклановский с использованием питательной среды Мурасига и Скуга, содержащей препарат Мелафен в концентрациях 10^-5, 10^-7, 10^-8, 10^-9 без индолилуксусной кислоты (ИУК), где препарат Мелафен в вышеуказанных концентрациях был использован в качестве единственного росторегулирующего вещества. Индолилуксусная кислота в концентрации 0,1 мг/л без добавления препарата Мелафена в составе питательной среды Мурасига и Скуга являлась контролем. Результаты показали, что в контроле ризогенная зона достигает 7,7 см, а с Мелафеном в качестве единственного росторегулирующего вещества, - 9,0 см. Учет осуществляли через 40 дней. Через 70 дней учета ризогенная зона растений составила 12,1 см в присутствии Мелафена и 10,7 см в контроле. Высота и облиственность растений в обоих случаях были одинаковыми.

Это свидетельствует о возможности применения препарата Мелафен при клональном микроразмножении винограда in vitro и без индолилуксусной кислоты в питательной среде.

Таким образом, предложен новый способ клонального микроразмножения винограда in vitro с использованием нетоксичного, устойчивого во времени, водорастворимого, синтетического росторегулирующего препарата Мелафен, эффективного в концентрации 10^-7-10^-11%.

Использование предлагаемого способа позволяет увеличить выход растений за счет более эффективной приживаемости микрочеренков, регенерации растений и улучшения их качественных показателей. Учитывая низкую себестоимость препарата и высокий оказываемый эффект, применение заявляемого способа экономически обосновано.