СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ИСХОДА МЫШЕЧНО-ИНВАЗИВНОГО РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ ПОСЛЕ КОМБИНИРОВАННОГО ЛЕЧЕНИЯ

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, касается способов прогнозирования исходов мышечно-инвазивного рака мочевого пузыря и может быть использовано для определения прогрессирования заболевания в виде появления рецидивов опухоли после проведения трансуретральной резекции опухоли и полихимиотерапии по схеме M-VAC.

Используемые в настоящее время традиционные способы прогнозирования течения заболевания, в первую очередь, предполагают анализ параметров, характеризующих клинические особенности заболевания, а именно размеры новообразования, характер и степень распространенности процесса. По данным литературы имеются сведения о прогностической значимости таких параметров, как наличие микросателлитных последовательностей ДНК, мутаций проонкогенов, онкосупрессоров, регуляторов клеточного цикла, ангиогенных факторов [3, 4, 7] и молекул адгезии [5] относительно риска развития рецидивов заболевания. Однако эти данные носят противоречивый характер.

Наиболее близким к заявляемому является способ прогнозирования, включающий определение полиморфизма гена GSTP1 (глютатина S-трансферазы), который связан с метаболизмом ксенобиотиков (Патент РФ №2393772, опубл 23.03.2009). Полиморфные варианты гена ассоциированы с изменением активности фермента, что может влиять на риск развития рецидивов злокачественных новообразований. Из лимфоцитов периферической венозной крови выделяют ДНК, проводят ПЦР-анализ с последующей рестрикцией амплифицированных фрагментов полиморфного локуса Ile105Val гена GSTP1. При обнаружении у больных с поверхностными формами РМП гомозиготного генотипа Val/Val прогнозируют высокий риск развития рецидива рака мочевого пузыря (РМП). Гомозиготный генотип Ile/Ile связан с минимальным риском в отношении развития рецидивов РМП.

Недостатками данного способа являются низкая чувствительность, точность и информативность, а также ограниченная область применения способа, обусловленная - отсутствием связи полиморфных вариантов генов с активностью фермента, которая связана не только с ними, но и может быть изменена за счет посттрансляционных модификаций полипептидной цепочки, а также не учитывается биологическое поведение самой опухоли, которая может оказывать выраженное влияние на канцерогенез.

Новая техническая задача - повышение точности и информативности прогнозирования прогрессирования заболевания в отношении риска развития рецидивов.

Для решения поставленной задачи в способе прогнозирования исхода мышечно-инвазивного рака мочевого пузыря после комбинированного лечения путем исследования ферментов метаболизма определяют активность 26S протеасом и содержание NF-kВ p65 и p50 в ткани опухоли и при активности 26S протеасом более 18-1000 Ед /мг белка и при коэффициенте NF-kB p65/p50 более 1,0 прогнозируют низкую вероятность развития рецидива; при активности 26S протеасом менее 18-1000 Ед /мг белка и коэффициенте NF-kВ p65/p50 менее 1,0 прогнозируют высокую вероятность развития рецидива опухоли.

Способ осуществляют следующим образом.

Проводят флуорометрическое определение активности 26S протеасом, а также иммуноферментное определение экспрессии NF-kB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells - ядерный транскрипционный фактор kB) p65 и p50 в опухолевой ткани. Для этого из операционного материала берут образцы опухолевой ткани в течение 2-3 часов после операции, очищают от участков некроза, кровоизлияний и помещают в жидкий азот. Образцы тканей до определения активности ферментов хранят при температуре -70°C и размораживают не более 1 раза для исследования активности и содержания маркеров. Перед определением активности исследуемых ферментов замороженную опухолевую ткань гомогенизируют до порошкообразного состояния в жидком азоте. 26S протеасомы выделяют методом высаливания с помощью сульфата аммония до 40% насыщения [12]. Химотрипсинподобную активность 26S протеасом, осуществляющуюся химотрипсинподобными центрами протеасом, оценивают по гидролизу флуорогенного олигопептида Suc-LLVY-AMC (Sigma, США) [1]. Образовавшийся продукт регистрируют на флуориметре «Hitachi-850» (Япония) при длине волны возбуждения 380 нм и эмиссии 440 нм. Для оценки активности примесных протеаз в образцах применяют специфический ингибитор протеасом - MG132. За единицу активности протеасом принимают количество фермента, при котором гидролизуется 1 нмоль Suc-LLVY-AMC в течение 1 мин. Удельную активность протеасом выражают в единицах активности на 1 мг белка. Содержание белка определяют по методу Лоури.

Приготовление ядерных экстрактов для определения NF-kB (p50 и p65 форм) проводят в соответствии с рекомендациями фирмы производителя Caymanchem (США). Замороженную ткань (100 мг) гомогенизируют в жидком азоте, затем ресуспендируют. Гомогенат центрифугируют при 2400g и 4°C для получения осадка, который ресуспендируют в 50 мкл 50 mM Трис-HCl буфера (pH 7,5) и затем центрифугируют при 14000g и 4°C. Полученный супернатант используют для определения экспрессии транскрипционных факторов. Экспрессию активированных форм NF-kB p50, р65 определяют в ядерных экстрактах иммуноферментным методом. Результаты определения содержания транскрипционных факторов выражают в условных единицах на мг белка в лунке. И при активности 26S протеасом более 18-1000 Ед /мг белка и при коэффициенте NF-kВ p65/p50 более 1,0 прогнозируют низкую вероятность развития рецидива; при активности 26S протеасом менее 18-1000 Ед /мг белка и коэффициенте NF-kВ p65/p50 менее 1,0 прогнозируют высокую вероятность развития рецидива опухоли.

Такой подход к прогнозированию риска возникновения рецидивов при раке мочевого пузыря обусловлен рядом предпосылок.

Одним из патогенетических механизмов, лежащих в основе развития и прогрессирования рака мочевого пузыря, является изменение активности протеасомной системы и экспрессии регулируемых ими субстратов, в том числе NF-kB. Необходимо отметить, что регуляторным этапом многих физиологических и патологических процессов является внутриклеточная деградация белков в протеасомах. 26 протеасомы способны активировать NF-kB за счет быстрой деградации его собственного ингибитора IkB, что способствуют выработке p105 - предшественника p50 субъединицы NF-kB [5; 10]. Известно, что посттрансляционная модификация p105 - предшественника NF-kB p50 осуществляется с помощью 20S протеасом без процесса убиквитинирования [9]. Показано, что экспрессия NF-kB и продуктов его регуляции высока в случае переходно-клеточного рака мочевого пузыря. При этом уровень фактора связан с лимфогенным метастазированием опухоли [8; 11]. При этом большое значение придается соотношению NF-kB p65/p50 [2], что связано с наличием активных форм фактора.

Информативность отобранных критериев обоснована наличием связи активности 26S протеасом и экспрессии NF-kB p50 и p65 с возникновением рецидивов рака мочевого пузыря, которое проводилось у 54 больных РМП T_2-3N₀M₀ (средний возраст 61,8±1,5 лет), проходивших лечение в отделении общей онкологии ФГБУ НИИ онкологии СО РАМН с 2006 по 2012 год. У всех больных диагноз был морфологически верифицирован. Лечение включало в себя проведение 2 курсов системной полихимиотерапии в неоадъювантном режиме по стандартной схеме MVAC (метотрексат - 30 мг/м² внутривенно в 1-й, 15-й и 22-й день, винбластин - 4 мг/м² в 1-й, 15-й и 22-й день, внутривенно цисплатин - 70 мг/м² во 2-й день внутривенно, доксорубицин 30 мг/м² внутривенно во 2-й день), перерыв между курсами составил 4-6 недель. В последующем этим пациентам выполнялась трансуретральная резекция (ТУР) мочевого пузыря и еще 2 курса адъювантной химиотерапии по вышеуказанной схеме.

Опухолевая ткань забиралась из операционного материала не позднее чем через 2-3 часа после операции, замораживалась в жидком азоте. Затем в опухолевой ткани определялась активность 26S протеасом и экспрессия NF-kB p50 и p65.

Средний срок наблюдения за больными, включенными в исследование, составил 22 месяца. Прогрессирование процесса было отмечено у 19 больных (35%) за счет развития рецидивов опухоли.

Для оценки прогностической значимости активности 26S протеасом и экспрессии NF-kB р50 и р65 в опухолевой ткани при раке мочевого пузыря использовали однофакторный анализ прогностической значимости признаков (Survival Analysis, Statistica 6.0). Показатели 2-летней безрецидивной выживаемости анализировали с помощью построения кривых выживаемости по методу Каплана-Майера. Сравнение показателей выживаемости в группах проводили по критерию Гехана-Вилкоксона [13].

При оценке прогностической значимости активности ферментов систем внутриклеточного протеолиза в ткани опухоли при раке мочевого пузыря было выявлено, что статистически значимыми факторами в отношении безрецидивной выживаемости, являются активность 26S протеасом и экспрессии NF-kB p50 и p65. На фиг.1 представлены показатели 2-летней безрецидивной выживаемости в зависимости от активности 26S протеасом в опухоли, на фиг.2 - в зависимости от коэффициента NF-kB p65/р50 в опухоли, которые подтверждают высокую вероятность появления рецидивов заболевания в группе больных с активностью 26S протеасом более 18-1000 Ед /мг белка и при коэффициенте NF-kB p65/p50 более 1,0.

При активности 26S протеасом в опухоли более 18*1000 Ед/мг белка у 3 (13%) пациентов из 23 было выявлено рецидивирование процесса. Тогда, как при активности фермента менее 18*1000 Ед/мг белка, у 16 (51%) больных из 31 были диагностированы рецидивы. Безрецидивная выживаемость в первом случае составила 86,9%, что было значимо выше по сравнению со второй группой больных, где данный показатель был равен 49% (p<0,05). Чувствительность метода определения активности 26S протеасом для оценки риска возникновения рецидивов опухоли составила 84%, специфичность - 57%, прогностическая ценность положительного результата - 51%.

При соотношении NF-kB p65/p50 выше 1,0 у 3 (15%) пациентов из 20 были выявлены рецидивы рака мочевого пузыря, безрецидивная выживаемость была равна 84%. У 12 (60%) больных из 20 при коэффициенте NF-kB p65/p50 менее 1,0 были выявлены рецидивы опухоли после проведенного лечения. Безрецидивная выживаемость в этом случае составила 40%. При сравнении безрецидивной выживаемости в группах больных с разным пороговым уровнем соотношения NF-kB p65/p50 было выявлено статистически значимое различие по данному показателю (p<0,05). Чувствительность определения соотношения NF-kB p65/p50 относительно риска возникновения рецидивов опухоли составила 80%, специфичность - 68%, прогностическая ценность положительного результата - 60%.

Клинические примеры:

Пример 1. Больной Ж., 60 лет, обратился в ФГБУ НИИ онкологии СО РАМН, где по результатам комплексного обследования был поставлен диагноз: рак мочевого пузыря T₂N₀M₀. Проведено 2 курса системной полихимиотерапии в неоадъювантном режиме по стандартной схеме MVAC. В последующем этому пациенту выполнялась ТУР мочевого пузыря и еще 2 курса адъювантной химиотерапии по вышеуказанной схеме. При гистологическом исследовании операционного материала диагностирован переходно-клеточный рак мочевого пузыря умеренной степени дифференцировки. Активность 26S протеасом в опухолевой ткани составила 17-1000 МЕ/мг белка, коэффициент NF-kB p65/p50 был равен 0,9 единицы, что соответствовало неблагоприятному прогнозу в отношении риска развития рецидива опухоли. При динамическом наблюдении за больным через 14 месяцев после проведения лечения был выявлен рецидив, по поводу чего проводилось дальнейшее лечение. А через 20 месяцев после проведенного лечения был выявлен повторный рецидив заболевания, и больному была проведена цистэктомия. Общий срок наблюдения за больным составил 3 года.

Пример 2.

Больной И., 55 лет, обратился в ФГБУ НИИ онкологии СО РАМН, где по результатам комплексного обследования был поставлен диагноз: рак мочевого пузыря T₃N₀M₀. Проведено 2 курса системной полихимиотерапии в неоадъювантном режиме по стандартной схеме MVAC. Дальнейшее лечение заключалось в проведении ТУР мочевого пузыря и еще 2 курсов адъювантной химиотерапии по вышеуказанной схеме. При гистологическом исследовании операционного материала диагностирован переходно-клеточный рак мочевого пузыря умеренной степени дифференцировки. Активность 26S протеасом в опухолевой ткани составила 28-1000 МЕ/мг белка, коэффициент NF-kB р65/р50 был равен 1,2 единицы, что соответствовало благоприятному прогнозу в отношении риска развития рецидива опухоли. Период динамического наблюдения за больным составил 36 месяцев. Данных за прогрессирование заболевания не выявлено.

Таким образом, предлагаемый способ прогнозирования исхода мышечно-инвазивного рака мочевого пузыря совместно с основными клинико-морфологическими параметрами позволяет с большей точностью и информативностью предсказать появление рецидивов заболевания, что дает возможность скорректировать тактику ведения пациентов.

Источники информации

1. Ben-Shahar S., Komlosh A., Nadav E. et al. 26 S proteasome-mediated production of an authentic major histocompatibility class I-restricted epitope from an inlact protein substrate // The J of Biol. Chem. - 1999. - Vol.274. - No.31. - P.21963-21972.

2. Conner J.R., Smirnova I.I., Moseman A.P., Poltorak A. IRAK1BP1 inhibits inflammation by promoting nuclear translocation of NF-kappaB p50 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2010. - V.107(25). - P.11477-11482.

3. Garcia-Closas M., Malats N., Real F.X. et al. Large-scale evaluation of candidate genes identifies association between VEGF polymorphism and bladder cancer risk // PloS. Genet. 2007. Vol.3. P.287-293.

4. Goddard.J.C., Sutton C.D., Furness P.N. et al. Microvessel density at presentation predicts subsequent muscle invasion in superficial bladder cancer // Clin Cancer Res. 2003. Vol.9. P.2583-2586.

5. Goldberg A.L. Functions of the proteasome: from protein degradation and immune surveillance to cancer therapy // Biochemical Society Transactions 2007 Vol.35. - P.12-17.

6. Habuchi Т., Marberger M., Droller M.J., Hemstreet G.P. et al. Prognostic markers for bladder cancer: International Consensus Panel on bladder tumor markers. // Urology. - 2005. Vol.66(6). P.64-74.

7. Inoue К., Kamada M., Slaton J.W. et al. The prognostic value of angiogenesis and metastasis-related genes for progression oftarnsitional cell carcinoma of the renal pelvis and ureter // Clin. Cancer. Res. 2002. Vol.8. P.1863-1870.

8. Karashima T, Sweeney P, Kamat A, Huang S, Kim SJ, Bar-Eli M, McConkey DJ, Dmney CP. Nuclear factor-kappaB mediates angiogenesis and metastasis of human bladder cancer through the regulation of interleukin-8. // Clin Cancer Res. 2003. Vol.9(7). P.2786-2797.

9. Moorthy А.К., Savinova O.V., Ho J.Q., Wang V.Y., Vu D., Ghosh G. The 20S proteasome processes NF-kappaB1 p105 into p50 in a translation-independent manner. // EMBOJ. 2006. Vol.25(9). P.1945-56.

10. Shah S.A., Potter M.W., McDade T.P., Ricciardi R., Perugini R.A., Elliot P.J., Adams J., Gallery M.P. 26S proteasome inhibition induces apoptosis and limits growth of human pancreatic cancer. // J. Cell Biochem. - 2001. - Vol.82(1). P.110-122.

11. Xie DH. Tang XD. Xia SJ, Tan JM, Wang XH, Cai Y. Expression of NF-kappa В in human bladder cancer and its clinical significance // Ai Zheng. - 2002. - Vol.21(6). P.663-667.

12. Абрамова Е.Б., Астахова Т.М., Ерохов П.А., Шарова Н.П. Множественность форм протеасомы и некоторые подходы к их разделению // Изв. РАИ Сер. биол. - 2006. - №2. С.150-156.

13. Боровиков, В.П. STATISTICA - статистический анализ и обработка данных в среде Windows / В.П.Боровиков. П.П.Боровиков. - М.: Филин, 1998. - 608 с.