Результат интеллектуальной деятельности: СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ

Изобретение относится к ветеринарной биотехнологии, а именно к культивированию клеток животных и вирусов, и может быть использовано для оптимизации репродукции вирусов в культуре клеток и получения средств специфической иммунизации животных против бешенства.

Известен способ получения антирабической вакцины (патент RU №2134590, 1999), включающий выращивание вируса бешенства в суспензионной культуре перевиваемых клеток ВНК-21 в течение 96-144 ч, внесение в вируссодержащую суспензию сначала стабилизатора белковых вирусных антигенов (полиакриловая кислота или ее железная соль в концентрации 0,7-1,0%), затем инактиванта вирусного генома (димер этиленимин в концентрации 0,1-0,3%) с дальнейшим инкубированием при 37°C в течение 20-24 ч. Полученный вируссодержащий материал используют в качестве жидкой или сухой вакцины. Однако указанный способ не обеспечивает достаточно выраженный эффект стабилизации протективных вирусных антигенов и требует большой продолжительности производственного цикла (5-7 дней).

Известен способ получения антирабической вакцины (Патент RU №2191600, 2002), включающий репродукцию вируса бешенства в монослойной культуре перевиваемых клеток ВНК-21 на роллерных установках при температуре 37-38°C в течение 140-160 ч. Этот вирусный материал с низкой удельной инфекционной активностью в пределах 0,001-0,0001 ММЛД₅₀/кл используется для заражения производственной роллерной расплодки клеток, которые культивируются в тех же условиях, периодически рассеваются в отношении 1:4 с использованием свежей поддерживающей среды в течение 5-6 суток и при этом трижды производится сбор вируссодержащей культуральной жидкости. Полученный в результате материал пригоден для изготовления сухих и жидких антирабических вакцин с характеристиками иммуногенности по NIH на уровне 2,3-2,5 МЕ/мл.

Недостатком данного способа является то, что его промышленная реализация сопровождается многочисленными трудоемкими операциями, связанными с раздельным получением вирусного и клеточного производственного посевного материала в роллерных бутылях, а также с мойкой и подготовкой большого количества сосудов культивирования и индивидуальной боксовой работы с каждым из них. Кроме того, полученный таким способом вирусный материал содержит недостаточно стабилизированный антиген с деструктурированным гликопротеином, что снижает эффективность вакцины. Данный способ изготовления вакцины приводит к удорожанию конечного продукта и затрудняет производство препарата на должном качественном уровне, в необходимых для ветеринарной практики количествах.

Известен способ получения антирабической вакцины, включающий культивирование культуры перевиваемых клеток ВНК-21, инфицирование их вирусом бешенства, репликацию вируса и инактивацию вируссодержащей суспензии β-пропиолактоном с последующим получением целевого продукта (Патент RU №2287343, МПК A61K 39/205, опубл. 20.11.2006), причем инфицирование культуры перевиваемых клеток ВНК-21 проводят вирусом бешенства штамм ″Щелково-51″ из расчета 0,01-0,001 МЛД₅₀/кл, культивирование проводят в течение 36-70 ч во взвешенном состоянии и 5-6 суток на микроносителях с ежесуточным сбором вируссодержащего материала, инактивацию вируса с последующим приготовлением целевого продукта в жидкой или лиофилизированной форме.

Указанный способ трудоемок в связи с необходимостью проведения сложных процедур подготовки микроносителей к посеву клеток, снятия клеток с микроносителей и последующего отделения клеточно-вирусной суспензии от микроносителей. Эти технологические процедуры ухудшают воспроизводимость результатов, занимают много времени и не позволяют гарантировать качество целевого продукта. Кроме того, полученный таким способом антиген недостаточно стабилен, а поверхностный белок (гликопротеин) значительно деструктиризирован.

Задачей изобретения является повышение качества целевого продукта за счет увеличения выхода вирусного антигена, обладающего более высокой иммуногенной активностью.

Поставленная задача решается в способе получения антирабической вакцины, включающем культивирование культуры перевиваемых клеток ВНК, инфицирование их вирусом бешенства, репликацию вируса и инактивацию вируссодержащей суспензии β-пропиолактоном с последующим получением целевого продукта тем, что культивирование культуры перевиваемых клеток ВНК осуществляют в течение 48-72 часов до концентрации (2,5-3,0)×10⁶ кл./мл с последующим инфицированием клеток вирусом бешенства в дозе 0,01-0,1 МЛД₅₀/кл., выдерживанием при температуре 38,5-39,5°C в течение 60-90 минут с последующим разбавлением ростовой средой до концентрации сублинии клеток (0,5-0,6)×10⁶ кл./мл и продолжением культивирования полученной суспензии в течение 48-72 часов при температуре 37-38°C и pH 7,1-7,3, после чего вируссодержащую суспензию охлаждают до температуры 4-8°C при pH 7,8-8,0 и добавляют трис(гидроксиметил)аминометан и соль динатриевая этилендиаминтетрауксусной кислоты, взятых в конечных концентрациях 0,7-0,9% и 0,006-0,01% соответственно.

Поставленная задача решается также в способе получения антирабической вакцины тем, что целевой продукт получают адсорбцией инактивированного вирусного материала на 4-6%-ном геле гидроокиси алюминия с размером частиц 2,6-2,8 мкм до конечной концентрации геля 10-25 мас.%.

Поставленная задача решается также в способе получения антирабической вакцины тем, что целевой продукт получают сублимационным высушиванием, причем перед высушиванием вируссодержащий материал смешивают в соотношении 1:1-0,9 с защитной средой с pH 7,7-7,9, содержащей желатин, пептон и сахарозу при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Поставленная задача решается также в способе получения антирабической вакцины тем, что для инфицирования культуры перевиваемых клеток ВНК в качестве вируса бешенства используют штамм вируса бешенства штаммов «Щелково-51», или «ERA G333», или «РВ-97», или «ТС-80».

Поставленная задача решается также в способе получения антирабической вакцины тем, что в качестве культуры перевиваемых клеток ВНК используют культуры перевиваемых клеток ВНК-21, или ВНК-21/13, или ВНК 21/13, или ВНК-21/13-02.

Известно использование для репликации вируса бешенства культуры перевиваемых клеток ВНК - родительской линии, созданной из почек пяти однодневных хомячков в 1961 году (Alves PM, Moreira JL, Rodrigues JM, Aunins JG, Carrondo MJT (1996), Two dimensional versus three dimensional cultures systems: effects on growth and productivity of BHK cells, Biotechnol. Bio-eng. 52: 429-432).

В последующем в нашей стране были зарегистрированы следующие культуры перевиваемых клеток ВНК /С.Г. Юрков, В.В. Зуев и др. «Каталог коллекции клеточных культур Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии» - Покров. - 2000 г., - с.59-63/, в частности: ВНК-21 (сублиния, поступившая из Англии, Франции, Мексики, США, Швеции и полученные в отечественных профильных учреждениях), ВНК-21/13 (сублиния перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хомячка, полученная в Институте полиомиелита).

Известна также перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК 21/13 (Гринь Светлана Анатольевна «Современные биотехнологические процессы и иммунологические методы при промышленном производстве ветеринарных препаратов», автореферат на соискание доктора биологических наук, Щелково - 2008 г., стр.5).

Кроме того, также известна перевиваемая монослойно-суспензионная сублиния клеток почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/13-02 (патент №2300562, МПК C12N 5/06, Бюл. №16, опубл. 10.06.2007).

Известно использование штаммов «Щелково-51» (Патент РФ №2191600, МКИ А61К 39/205, 27.10.2002), «ERA G333», «РВ-97» (Патент РФ №2440139, МКИ А61К 39/205, A61P 31/12, 03.11.2010) и штамм «ТС-80» (Патент РФ №2157700, МПК А61К 39/205, 10.20.2000) для вакцин против бешенства плотоядных животных.

Использование ростовых сред в предлагаемом изобретении известно /минимальная среда Игла MEMS с 7% сыворотки КРС и модифицированный солевой раствор Хенкса - с увеличенным до 0,15 г/л содержанием натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного, содержащей 10% сыворотки крови крупного рогатого скота, проверенной на отсутствие антител к вирусу бешенства и ростовые свойства, в концентрации 2,5 мас.%; D-глюкозу (1,0 г/л), D-фруктозу (1,0 г/л), l-глутамин (0,3 г/л); ферментативный мышечный гидролизат крупного рогатого скота (0,35% в пересчете на сухое вещество); l-аргинин, l-метионин, l-цистин, myo-инозитол и водорастворимые витамины, согласно прописи среды Игла/ (Живая клетка в культуре, под. ред. Л.П. Дьяконова, М., изд. «Спутник+», 2009, с.55-94).

Трис(гидроксиметил)аминометан (синонимы: 1,1,1-трис(гидроксиметил)-метанамин; 1,1,1-трис(гидроксиметил)-метиламин; 1,1,1-трис(гидроксиметил)метиламин; 1,3-Пропандиол,2-амино-2-(гидроксиметил)-; 2-амино-2-(гидроксиметил)-3-пропандиол; 2-Амино-2-гидроксиметилпропандиол; 2-Амино-2-метилол-1,3-пропандиол; 3-Пропандиол, 2-амино-2-(гидроксиметил)-1). Применение: применяется как фармацевтический интермедиат, биохимический реагент, промежуточный продукт для фосфомицина, вулканизирующих ускорителей, косметики (крема, лосьоны), минеральных масел, парафиновый эмульсификатор /Каталог химических реактивов и высокочистых химических веществ, Изд. »Химия», М., 1971, стр.483/.

Соль динатриевая этилендиаминтетрауксусной кислоты - (синонимы: комплексон-III, трилон Б, хелатон III, ЭДТА - C₁₀H₁₄O₈N₂Na₂*2H₂O). Используется в промышленности для промывки теплоэнергетического оборудования, труб, котлов; водоподготовки в котельных и теплосетях; в виде стабилизатора в процессах полимеризации; в целлюлозно-бумажной промышленности; при производстве каучука; в аналитической химии и во многих других областях /ГОСТ 10652-73/.

Для изготовления антирабических вакцин необходимы биоматериалы с высоким удельным содержанием вирусных частиц, на поверхности которых тримеры молекул гликопротеина должны быть стабилизированы в напряженной нативной конформации, обеспечивающей высокопротективные свойства антигена.

В процессе производства антигенного материала и изготовления препаратов на его основе вирусный гликопротеин, ответственный за иммуногенность, подвержен влиянию различных факторов (химических инактивантов, сублимационной сушке, сдвигам pH и ионного состава), нарушающих его нативную конформацию при выходе сформированных вирусных частиц во внеклеточную среду. В этой связи, для повышения выхода высокоиммуногенного вируса требуется стабилизация структуры протективных антигенов в процессе производства антирабических препаратов. Нами впервые установлено, что если производить культивирование культуры перевиваемых клеток ВНК при определенных режимах с последующим добавлением трис(гидроксиметил)аминометана и соли динатриевой этилендиаминтетрауксусной кислоты при определенных концентрациях и определенных значениях pH, то появляется новый технический результат, заключающийся в повышении накопления вирусных частиц и, соответственно, гликопротеина, ответственного за выработку вируснейтрализующих антител, а также стабилизации антигенных свойств вирусного гликопротеина.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1. В биореактор вместимостью 2000 л вносят 300 л ростовой среды /модифицированный солевой раствор Хенкса - с увеличенным до 0,15 г/л содержанием натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного, содержащей 10% сыворотки крови крупного рогатого скота, проверенной на отсутствие антител к вирусу бешенства и ростовые свойства, в концентрации 2,5 мас.%; D-глюкозу (1,0 г/л), D-фруктозу (1,0 г/л), l-глутамин (0,3 г/л); ферментативный мышечный гидролизат крупного рогатого скота (0,35% в пересчете на сухое вещество); l-аргинин, l-метионин, l-цистин, myo-инозитол и водорастворимые витамины, согласно прописи среды Игла/ с культурой перевиваемых клеток ВНК-21, культивирование осуществляют в течение 48 часов до концентрации 2,5×10⁶ кл./мл при температуре суспензии 37°C.

Далее, в биореактор вносят вирус бешенства, штамм «Щелково-51», выращенный в аналогичной системе репродукции, в дозе 0,01 МЛД₅₀/кл. (рассчитанной с учетом имеющейся в биореакторе концентрации клеток), поднимают температуру инкубирования суспензии клеток и вируса до 39,5°C и выдерживают 60 мин при перемешивании (40 об/мин), в целях активной сорбции вируса рецепторами клеток;

- затем в биореактор, не прерывая перемешивания, вносят 1500 л подогретой до 37°C ростовой среды до концентрации клеток 0,5×10⁶ кл./мл и продолжением культивирования полученной суспензии в течение 48 часов при температуре 37°C и pH 7,1;

- завершая процесс накопления вируса, корректируют pH вируссодержащей суспензии до значения 7,8, медленно подавая при перемешивании необходимое количество 3%-ного раствора гидроксида натрия или 2%-ного раствора соляной кислоты, после чего вируссодержащую суспензию охлаждают до температуры 4°C и вносят в нее, продолжая перемешивание, трис(гидроксиметил)аминометан и соль динатриевую этилендиаминтетрауксусной кислоты, взятых в конечных концентрациях в вируссодержащем материале 0,9% и 0,01% соответственно;

- для инактивации вируса, в биореактор со стабилизированным вирусным материалом вносят β-пропиолактон в конечной концентрации 0,025% и выдерживают в течение 2 часов при непрерывном перемешивании.

Полученный таким образом полупродукт используют далее для приготовления:

а) сухой антирабической вакцины /вакцина 1/ путем сублимационного высушивания, причем перед высушиванием вируссодержащий материал смешивают в соотношении 1:0,9 с защитной средой с pH 7,7, содержащей желатин, пептон и сахарозу при следующем соотношении компонентов, мас.%:

б) жидкой антирабической вакцины /вакцина 2/ путем адсорбции инактивированного вирусного материала на 4%-ном геле гидроокиси алюминия с размером частиц 2,6-2,8 мкм до конечной концентрации его 10 мас.%.

Пример 2. В биореактор вместимостью 2000 л вносят 300 л ростовой среды /модифицированный солевой раствор Хенкса - с увеличенным до 0,15 г/л содержанием натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного, содержащей 10% сыворотки крови крупного рогатого скота, проверенной на отсутствие антител к вирусу бешенства и ростовые свойства, в концентрации 2,5 мас.%; D-глюкозу (1,0 г/л), D-фруктозу (1,0 г/л), l-глутамин (0,3 г/л); ферментативный мышечный гидролизат крупного рогатого скота (0,35% в пересчете на сухое вещество); l-аргинин, l-метионин, l-цистин, myo-инозитол и водорастворимые витамины, согласно прописи среды Игла/ с культурой перевиваемых клеток ВНК-21, культивирование осуществляют в течение 72 часов до концентрации 3,0×10⁶ кл./мл при температуре суспензии 36,5°C.

Далее, в биореактор вносят вирус бешенства, штамм «Щелково-51», выращенный в аналогичной системе репродукции, в дозе 0,1 МЛД₅₀/кл. (рассчитанной с учетом имеющейся в биореакторе концентрации клеток), поднимают температуру инкубирования суспензии клеток и вируса до 38,5°C и выдерживают 90 мин при перемешивании (60 об/мин), в целях активной сорбции вируса рецепторами клеток;

- затем в биореактор, не прерывая перемешивания, вносят 1500 л подогретой до 37°C ростовой среды до концентрации клеток 0,6×10⁶ кл./мл и продолжением культивирования полученной суспензии в течение 72 часов при температуре 38°C и pH 7,3;

- завершая процесс накопления вируса, корректируют pH вируссодержащей суспензии до значения 7,8, медленно подавая при перемешивании необходимое количество 3%-ного раствора гидроксида натрия или 2%-ного раствора соляной кислоты, после чего вируссодержащую суспензию охлаждают до температуры 8°C и вносят в нее, продолжая перемешивание, трис(гидроксиметил)аминометан и динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, взятых в конечных концентрациях в вируссодержащем материале 0,7% и 0,006% соответственно;

- для инактивации вируса, в биореактор со стабилизированным вирусным материалом вносят β-пропиолактон в конечной концентрации 0,03% и выдерживают в течение 3 часов при непрерывном перемешивании.

Полученный таким образом полупродукт используют далее для приготовления:

а) сухой антирабической вакцины /вакцина 3/ путем сублимационного высушивания, причем перед высушиванием вируссодержащий материал смешивают в соотношении 1:0,9 с защитной средой с pH 7,7, содержащей желатин, пептон и сахарозу при следующем соотношении компонентов, мас.%:

б) жидкой антирабической вакцины /вакцина 4/ путем адсорбции инактивированного вирусного материала на 6%-ном геле гидроокиси алюминия с размером частиц 2,6-2,8 мкм до конечной концентрации его 25 мас.%.

Пример 3. В биореактор вместимостью 2000 л вносят 300 л ростовой среды /минимальная среда Игла MEMS с 7% сыворотки КРС/ с культурой перевиваемых клеток ВНК-21/13, культивирование осуществляют в течение 48 часов до концентрации 2,5×10⁶ кл./мл при температуре суспензии 37°C.

Далее, в биореактор вносят вирус бешенства, штамм «ERA G333», выращенный в аналогичной системе репродукции, в дозе 0,01 МЛД₅₀/кл. (рассчитанной с учетом имеющейся в биореакторе концентрации клеток), поднимают температуру инкубирования суспензии клеток и вируса до 39,5°C и выдерживают 60 мин при перемешивании (40 об/мин), в целях активной сорбции вируса рецепторами клеток;

- затем в биореактор, не прерывая перемешивания, вносят 1500 л подогретой до 37°C ростовой среды до концентрации клеток 0,5×10⁶ кл./мл и продолжением культивирования полученной суспензии в течение 48 часов при температуре 37°C и pH 7,1;

- завершая процесс накопления вируса, корректируют pH вируссодержащей суспензии до значения 7,8, медленно подавая при перемешивании необходимое количество 3%-ного раствора гидроксида натрия или 2%-ного раствора соляной кислоты, после чего вируссодержащую суспензию охлаждают до температуры 4°C и вносят в нее, продолжая перемешивание, трис(гидроксиметил)аминометан и соль динатриевую этилендиаминтетрауксусной кислоты, взятых в конечных концентрациях в вируссодержащем материале 0,9% и 0,01% соответственно;

- для инактивации вируса, в биореактор со стабилизированным вирусным материалом вносят β-пропиолактон в конечной концентрации 0,025% и выдерживают в течение 2 часов при непрерывном перемешивании.

Полученный таким образом полупродукт используют далее для приготовления:

а) сухой антирабической вакцины /вакцина 5/ путем сублимационного высушивания, причем перед высушиванием вируссодержащий материал смешивают в соотношении 1:0,9 с защитной средой с pH 7,7, содержащей желатин, пептон и сахарозу при следующем соотношении компонентов, мас.%:

б) жидкой антирабической вакцины /вакцина 6/ путем адсорбции инактивированного вирусного материала на 4%-ном геле гидроокиси алюминия с размером частиц 2,6-2,8 мкм до конечной концентрации его 10 мас.%.

Пример 4. В биореактор вместимостью 2000 л вносят 300 л ростовой среды /минимальная среда Игла MEMS с 7% сыворотки КРС/ с культурой перевиваемых клеток ВНК-21/13, культивирование осуществляют в течение 72 часов до концентрации 3,0×10⁶ кл./мл при температуре суспензии 36,5°C.

Далее, в биореактор вносят вирус бешенства, штамм «ERA G333», выращенный в аналогичной системе репродукции, в дозе 0,1 МЛД₅₀/кл. (рассчитанной с учетом имеющейся в биореакторе концентрации клеток), поднимают температуру инкубирования суспензии клеток и вируса до 38,5°C и выдерживают 90 мин при перемешивании (60 об/мин), в целях активной сорбции вируса рецепторами клеток;

- затем в биореактор, не прерывая перемешивания, вносят 1500 л подогретой до 37°C ростовой среды до концентрации клеток 0,6×10⁶ кл./мл и продолжением культивирования полученной суспензии в течение 72 часов при температуре 38°C и pH 7,3;

- завершая процесс накопления вируса, корректируют pH вируссодержащей суспензии до значения 7,8, медленно подавая при перемешивании необходимое количество 3%-ного раствора гидроксида натрия или 2%-ного раствора соляной кислоты, после чего вируссодержащую суспензию охлаждают до температуры 8°C и вносят в нее, продолжая перемешивание, трис(гидроксиметил)аминометан и динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, взятых в конечных концентрациях в вируссодержащем материале 0,7% и 0,006% соответственно;

- для инактивации вируса, в биореактор со стабилизированным вирусным материалом вносят β-пропиолактон в конечной концентрации 0,03% и выдерживают в течение 3 часов при непрерывном перемешивании.

Полученный таким образом полупродукт используют далее для приготовления:

а) сухой антирабической вакцины /вакцина 7/ путем сублимационного высушивания, причем перед высушиванием вируссодержащий материал смешивают в соотношении 1:0,9 с защитной средой с pH 7,7, содержащей желатин, пептон и сахарозу при следующем соотношении компонентов, мас.%:

б) жидкой антирабической вакцины /вакцина 8/ путем адсорбции инактивированного вирусного материала на 6%-ном геле гидроокиси алюминия с размером частиц 2,6-2,8 мкм до конечной концентрации его 25 мас.%.

Пример 5. В биореактор вместимостью 2000 л вносят 300 л ростовой среды /модифицированный солевой раствор Хенкса - с увеличенным до 0,15 г/л содержанием натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного, содержащей 10% сыворотки крови крупного рогатого скота, проверенной на отсутствие антител к вирусу бешенства и ростовые свойства, в концентрации 2,5 мас.%; D-глюкозу (1,0 г/л), D-фруктозу (1,0 г/л), l-глутамин (0,3 г/л); ферментативный мышечный гидролизат крупного рогатого скота (0,35% в пересчете на сухое вещество); l-аргинин, l-метионин, l-цистин, myo-инозитол и водорастворимые витамины, согласно прописи среды Игла/ с культурой перевиваемых клеток ВНК-21/13-02, культивирование осуществляют в течение 48 часов до концентрации 2,5×10⁶ кл./мл, температурой суспензии 37°C.

Далее, в биореактор вносят вирус бешенства, штамм «РВ-97», выращенный в аналогичной системе репродукции, в дозе 0,01 МЛД₅₀/кл. (рассчитанной с учетом имеющейся в биореакторе концентрации клеток), поднимают температуру инкубирования суспензии клеток и вируса до 39,5°C и выдерживают 60 мин при перемешивании (40 об/мин), в целях активной сорбции вируса рецепторами клеток;

- затем в биореактор, не прерывая перемешивания, вносят 1500 л подогретой до 37°C ростовой среды до концентрации клеток 0,5×10⁶ кл./мл и продолжением культивирования полученной суспензии в течение 48 часов при температуре 37°C и pH 7,1;

- завершая процесс накопления вируса, корректируют pH вируссодержащей суспензии до значения 7,8, медленно подавая при перемешивании необходимое количество 3%-ного раствора гидроксида натрия или 2%-ного раствора соляной кислоты, после чего вируссодержащую суспензию охлаждают до температуры 4°C и вносят в нее, продолжая перемешивание, трис(гидроксиметил)аминометан и соль динатриевую этилендиаминтетрауксусной кислоты, взятых в конечных концентрациях в вируссодержащем материале 0,9% и 0,01% соответственно;

- для инактивации вируса, в биореактор со стабилизированным вирусным материалом вносят β-пропиолактон в конечной концентрации 0,025% и выдерживают в течение 2 часов при непрерывном перемешивании.

Полученный таким образом полупродукт используют далее для приготовления:

а) сухой антирабической вакцины /вакцина 9/ путем сублимационного высушивания, причем перед высушиванием вируссодержащий материал смешивают в соотношении 1:0,9 с защитной средой с pH 7,7, содержащей желатин, пептон и сахарозу при следующем соотношении компонентов, мас.%:

б) жидкой антирабической вакцины /вакцина 10/ путем адсорбции инактивированного вирусного материала на 4%-ном геле гидроокиси алюминия с размером частиц 2,6-2,8 мкм до конечной концентрации его 10 мас.%.

Пример 6. В биореактор вместимостью 2000 л вносят 300 л ростовой среды /модифицированный солевой раствор Хенкса - с увеличенным до 0,15 г/л содержанием натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного, содержащей 10% сыворотки крови крупного рогатого скота, проверенной на отсутствие антител к вирусу бешенства и ростовые свойства, в концентрации 2,5 мас.%; D-глюкозу (1,0 г/л), D-фруктозу (1,0 г/л), l-глутамин (0,3 г/л); ферментативный мышечный гидролизат крупного рогатого скота (0,35% в пересчете на сухое вещество); l-аргинин, l-метионин, l-цистин, myo-инозитол и водорастворимые витамины, согласно прописи среды Игла/ с культурой перевиваемых клеток ВНК-21/13-02, культивирование осуществляют в течение 72 часов до концентрации 3,0×10⁶ кл./мл при температуре суспензии 36,5°C.

Далее, в биореактор вносят вирус бешенства, штамм «РВ-97», выращенный в аналогичной системе репродукции, в дозе 0,1 МЛД₅₀/кл. (рассчитанной с учетом имеющейся в биореакторе концентрации клеток), поднимают температуру инкубирования суспензии клеток и вируса до 38,5°C и выдерживают 90 мин при перемешивании (60 об/мин), в целях активной сорбции вируса рецепторами клеток;

- затем в биореактор, не прерывая перемешивания, вносят 1500 л подогретой до 37°C ростовой среды до концентрации клеток 0,6×10⁶ кл./мл и продолжением культивирования полученной суспензии в течение 72 часов при температуре 38°C и pH 7,3;

- завершая процесс накопления вируса, корректируют pH вируссодержащей суспензии до значения 7,8, медленно подавая при перемешивании необходимое количество 3%-ного раствора гидроксида натрия или 2%-ного раствора соляной кислоты, после чего вируссодержащую суспензию охлаждают до температуры 8°C и вносят в нее, продолжая перемешивание, трис(гидроксиметил)аминометан и динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, взятых в конечных концентрациях в вируссодержащем материале 0,7% и 0,006% соответственно;

- для инактивации вируса, в биореактор со стабилизированным вирусным материалом вносят β-пропиолактон в конечной концентрации 0,03% и выдерживают в течение 3 часов при непрерывном перемешивании.

Полученный таким образом полупродукт используют далее для приготовления:

а) сухой антирабической вакцины /вакцина 11/ путем сублимационного высушивания, причем перед высушиванием вируссодержащий материал смешивают в соотношении 1:0,9 с защитной средой с pH 7,7, содержащей желатин, пептон и сахарозу при следующем соотношении компонентов, мас.%:

б) жидкой антирабической вакцины /вакцина 12/ путем адсорбции инактивированного вирусного материала на 6%-ном геле гидроокиси алюминия с размером частиц 2,6-2,8 мкм до конечной концентрации его 25 мас.%.

Пример 7. В биореактор вместимостью 2000 л вносят 300 л ростовой среды /модифицированный солевой раствор Хенкса - с увеличенным до 0,15 г/л содержанием натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного, содержащей 10% сыворотки крови крупного рогатого скота, проверенной на отсутствие антител к вирусу бешенства и ростовые свойства, в концентрации 2,5 мас.%; D-глюкозу (1,0 г/л), D-фруктозу (1,0 г/л), l-глутамин (0,3 г/л); ферментативный мышечный гидролизат крупного рогатого скота (0,35% в пересчете на сухое вещество); l-аргинин, l-метионин, l-цистин, myo-инозитол и водорастворимые витамины, согласно прописи среды Игла/ с культурой перевиваемых клеток ВНК 21/13, культивирование осуществляют в течение 48 часов до концентрации 2,5×10⁶ кл./мл, температурой суспензии 37°C.

Далее, в биореактор вносят вирус бешенства, штамм «ТС-80», выращенный в аналогичной системе репродукции, в дозе 0,01 МЛД₅₀/кл. (рассчитанной с учетом имеющейся в биореакторе концентрации клеток), поднимают температуру инкубирования суспензии клеток и вируса до 39,5°C и выдерживают 60 мин при перемешивании (40 об/мин), в целях активной сорбции вируса рецепторами клеток;

- затем в биореактор, не прерывая перемешивания, вносят 1500 л подогретой до 37°C ростовой среды до концентрации клеток 0,5×10⁶ кл./мл и продолжением культивирования полученной суспензии в течение 48 часов при температуре 37°C и pH 7,1;

- завершая процесс накопления вируса, корректируют pH вируссодержащей суспензии до значения 7,8, медленно подавая при перемешивании необходимое количество 3%-ного раствора гидроксида натрия или 2%-ного раствора соляной кислоты, после чего вируссодержащую суспензию охлаждают до температуры 4°C и вносят в нее, продолжая перемешивание, трис(гидроксиметил)аминометан и соль динатриевую этилендиаминтетрауксусной кислоты, взятых в конечных концентрациях в вируссодержащем материале 0,9% и 0,01% соответственно;

- для инактивации вируса, в биореактор со стабилизированным вирусным материалом вносят β-пропиолактон в конечной концентрации 0,025% и выдерживают в течение 2 часов при непрерывном перемешивании.

Полученный таким образом полупродукт используют далее для приготовления:

а) сухой антирабической вакцины /вакцина 13/ путем сублимационного высушивания, причем перед высушиванием вируссодержащий материал смешивают в соотношении 1:0,9 с защитной средой с pH 7,7, содержащей желатин, пептон и сахарозу при следующем соотношении компонентов, мас.%:

б) жидкой антирабической вакцины /вакцина 14/ путем адсорбции инактивированного вирусного материала на 4%-ном геле гидроокиси алюминия с размером частиц 2,6-2,8 мкм до конечной концентрации его 10 мас.%.

Пример 8. В биореактор вместимостью 2000 л вносят 300 л ростовой среды /модифицированный солевой раствор Хенкса - с увеличенным до 0,15 г/л содержанием натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного, содержащей 10% сыворотки крови крупного рогатого скота, проверенной на отсутствие антител к вирусу бешенства и ростовые свойства, в концентрации 2,5 мас.%; D-глюкозу (1,0 г/л), D-фруктозу (1,0 г/л), l-глутамин (0,3 г/л); ферментативный мышечный гидролизат крупного рогатого скота (0,35% в пересчете на сухое вещество); l-аргинин, l-метионин, l-цистин, myo-инозитол и водорастворимые витамины, согласно прописи среды Игла/ с культурой перевиваемых клеток ВНК 21/13, культивирование осуществляют в течение 72 часов до концентрации 3,0×10⁶ кл./мл при температуре суспензии 36,5°C.

Далее, в биореактор вносят вирус бешенства, штамм «ТС-80», выращенный в аналогичной системе репродукции, в дозе 0,1 МЛД₅₀/кл. (рассчитанной с учетом имеющейся в биореакторе концентрации клеток), поднимают температуру инкубирования суспензии клеток и вируса до 38,5°C и выдерживают 90 мин при перемешивании (60 об/мин), в целях активной сорбции вируса рецепторами клеток;

- затем в биореактор, не прерывая перемешивания, вносят 1500 л подогретой до 37°C ростовой среды до концентрации клеток 0,6×10⁶ кл./мл и продолжением культивирования полученной суспензии в течение 72 часов при температуре 38°C и pH 7,3;

- завершая процесс накопления вируса, корректируют pH вируссодержащей суспензии до значения 7,8, медленно подавая при перемешивании необходимое количество 3%-ного раствора гидроксида натрия или 2%-ного раствора соляной кислоты, после чего вируссодержащую суспензию охлаждают до температуры 8°C и вносят в нее, продолжая перемешивание, трис(гидроксиметил)аминометан и динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, взятых в конечных концентрациях в вируссодержащем материале 0,7% и 0,006% соответственно;

- для инактивации вируса, в биореактор со стабилизированным вирусным материалом вносят β-пропиолактон в конечной концентрации 0,03% и выдерживают в течение 3 часов при непрерывном перемешивании.

Полученный таким образом полупродукт используют далее для приготовления:

а) сухой антирабической вакцины /вакцина 15/ путем сублимационного высушивания, причем перед высушиванием вируссодержащий материал смешивают в соотношении 1:0,9 с защитной средой с pH 7,7, содержащей желатин, пептон и сахарозу при следующем соотношении компонентов, мас.%:

б) жидкой антирабической вакцины /вакцина 16/ путем адсорбции инактивированного вирусного материала на 4%-ном геле гидроокиси алюминия с размером частиц 2,6-2,8 мкм до конечной концентрации его 10 мас.%.

Пример 9. Из представленной таблицы видно, что вакцины 1-16, полученные согласно примерам 1-8, обладают большей иммуногенностью при более производительном и технологичном способе изготовления.

Из представленного выше следует, что предложенный способ получения антирабической вакцины при использовании вирусов бешенства штаммов «Щелково-51», «ERA G333», «РВ-97» и «ТС-80» для инфицирования культуры перевиваемых клеток ВНК, при укороченном цикле инкубации, обеспечивает повышение удельной иммуногенной активности антигенных материалов и, как результат, - увеличение количества вакцинных доз:

- за счет увеличения накопления антигена, обеспеченного созданием оптимальных условий в системе клетка-вирус, для активизации адсорбции вируса путем введения в технологический процесс стадии инкубирования концентрата клеток и вируса при повышенной температуре;

- последующей репродукции вируса в клеточной системе, переведенной в фазу пролиферативного роста, и стабилизации нативной конформации вирусного гликопротеина, сохранения структуры его молекул в ходе выделения вируса на заключительном этапе репродукции вируса и при его сорбции на гидроокиси алюминия или сублимационном высушивании;

- благодаря максимальному сохранению антигенных и иммуногенных свойств вируссодержащего материала на промежуточных стадиях производственного цикла.