СПОСОБ ДЛИТЕЛЬНОГО ХРАНЕНИЯ ПРИХОТЛИВЫХ БАКТЕРИЙ В КОНСЕРВИРОВАННОЙ ЦЕЛЬНОЙ ДОНОРСКОЙ КРОВИ ПУТЕМ ЗАМОРАЖИВАНИЯ

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для длительного хранения прихотливых бактерий, например, таких как Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis.

S. pneumoniae не растет на простых питательных средах. К средам необходимо добавлять кровь или нормальную сыворотку животных. А хранение культур пневмококка затруднено из-за склонности последнего к аутолизу. Для этого рекомендуют засевать культуру в пробирку со скошенным кровяным агаром, но не инкубировать в термостате, а хранить при температуре 4-7°C в холодильнике. В таком состоянии возможна и транспортировка культур. Для работы засеянную среду инкубируют при 37°C в течение суток [Частная медицинская микробиология с техникой микробиологических исследований: учебное пособие. Под ред. Лабинской А.С., Блинковой Л.П., Ещиной А.С. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005 г., - 600 с., стр.56].

N. meningitidis относится к труднокультивируемым бактериям, он требует питательных сред, содержащих продукты триптического расщепления белка (казеина, мяса, рыбы, сои) - аминокислоты, а также многочисленные ростовые факторы и витамины, поэтому к высокопитательным основам (жидким, агаровым) добавляют 20% нормальной лошадиной или бычьей сыворотки или 5% крови [Частная медицинская микробиология с техникой микробиологических исследований: учебное пособие. Под ред. Лабинской А.С., Блинковой Л.П., Ещиной А.С. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005 г., - 600 с., стр.64].

Бактерии рода Haemophilus почти все виды нуждаются в готовых факторах роста, присутствующих в крови (поэтому их называют гемоглобинофильными бактериями, или гемофилами), особенно в факторе X и/или V [Частная медицинская микробиология с техникой микробиологических исследований: учебное пособие. Под ред. Лабинской А.С., Блинковой Л.П., Ещиной А.С. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005 г., - 600 с., стр.173].

Поэтому необходим универсальный, доступный и качественный способ длительного хранения прихотливых бактерий, который можно использовать в лабораториях клинической микробиологии любого уровня и научно-исследовательских институтах для длительного хранения музейных штаммов и/или бактерий из клинического материала.

Ближайшим аналогом является способ хранения бактерий путем замораживания в стерильной дефибринированной крови кролика, описанный в «Определителе нетривиальных патогенных грамоотрицательных бактерий (аэробных и факультативно анаэробных). Пер. с англ. Р. Вейант, У. Мосс, Р. Уивер, Д. Холлис, Дж. Джордан, Э. Кук, М. Дейншвар. - М.: Мир, 1999. - 791 с., стр.56].

В известном способе:

1. Культуры для замораживания выращивают на скошенном агаре с экстрактом сердечной мышцы 18-24 часа или до появления роста.

2. После того как культура вырастет, бактерии суспендируют в 7-8 каплях стерильной дефибринированной крови кролика, которую вносят капиллярной пипеткой в пробирку со скошенным агаром с экстрактом сердечной мышцы.

3. Суспензию отсасывают капиллярной пипеткой и переносят в пробирку из полипропилена диаметром 10 мм (объемом 5 мл) с плотными крышками для замораживания, заполняя ее на 2/3 объема.

4. Пробирки с культурами маркируют, наклеивая на них полоску водостойкой липкой ленты, на которой отпечатано название или номер культуры, и помещают в коробку из водостойкой фанеры толщиной 9 мм, с внутренними размерами 37,5×15×7,5 см. На дно коробки помещают блоки 2,5×1,5×37,5 см из полимерного материала с лунками диаметром 9 мм. Диаметр лунок должен быть немного меньше диаметра пробирок.

5. Пробирки с культурами замораживают, помещая в камеру глубокой заморозки, при температуре ниже -40°C.

6. Для высева замороженной культуры пробирки вращают, держа большим и указательным пальцами на уровне мениска крови, пока небольшая часть культуры не оттает. Затем отбирают одну каплю культуры пастеровской пипеткой и засевают на соответствующую среду.

7. Пробирку с замороженной культурой вновь помещают в морозильную камеру, чтобы она не оттаивала дальше.

Признаки, общие с ближайшим аналогом: 1) использование пробирок из полипропилена; 2) для замораживания используется 18-24-часовая культура.

Отличительные: 1) используется стерильная консервированная донорская человеческая цельная кровь, содержащая гемоконсервант ЦФДА-1; 2) культуры замораживаются в морозильной камере холодильника при -20°C; 3) культуры для замораживания выращивают на соответствующих питательных средах. Так, например, для S. pneumoniae, N. meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Moraxella catarrhalis использовали питательную среду для выделения, культивирования и определения гемолитических свойств бактерий из клинического материала - кровяно-сывороточный агар - с инкубацией в обычной атмосфере для пневмококка и в СО₂-инкубаторе для N. meningitidis и N. gonorrhoeae; Н. influenzae - шоколадный агар с инкубацией в СО₂-инкубаторе; Bordetella pertussis на казеиново-угольный агар. На эти же среды делается высев при необходимости разморозить культуры.

Технический результат заключается в обеспечении выживаемости и возобновления культивирования при использовании доступных компонентов без дефицитных препаратов для лабораторий клинической микробиологии любого уровня.

Заявляется способ длительного хранения прихотливых бактерий, в частности, таких как Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, в консервированной крови путем замораживания, с использованием 18-24-часовой культуры, в стерильных пробирках из полипропилена с плотными крышками, отличающийся тем, что используют стерильную консервированную донорскую человеческую цельную кровь, содержащую гемоконсервант ЦФДА-1, культуры замораживают в морозильной камере холодильника при -20°C, культуры для замораживания выращивают на соответствующих питательных средах: для S. pneumoniae, N. meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Moraxella catarrhalis используют питательную среду для выделения, культивирования и определения гемолитических свойств бактерий из клинического материала - кровяно-сывороточный агар - с инкубацией в обычной атмосфере для пневмококка и в CO₂-инкубаторе для N. meningitidis и N. gonorrhoeae; для Н. influenzae используют шоколадный агар с инкубацией в СО₂-инкубаторе; Bordetella pertussis на казеиново-угольный агар, на эти же среды делают высев при необходимости разморозить культуры.

Для предлагаемого способа используются:

1) Стерильная консервированная донорская человеческая цельная кровь, которая содержит 63 мл раствора гемоконсерванта ЦФДА-1 для взятия 450 мл крови человека. Каждые 100 мл раствора ЦФДА-1 содержат: натрия цитрат (дигидрат) - 2,630 г.; лимонная кислота (моногидрат) - 0,327 г.; натрия дигидрофосфат (дигидрат) - 0,231 г.; декстроза (безводная) - 2,900 г.; аденин - 0,0275 г.; вода для инъекций quantum satis (с латыни означает сколько нужно). Стерильная консервированная донорская человеческая цельная кровь хранится в холодильнике при температуре 4±2°C до 6 месяцев. А стерильная дефибринированная кровь кролика или другого животного является дорогим дефицитным препаратом и почти не доступна для практических лабораторий клинической микробиологии.

2) Пробирки типа Eppendorf 1,5 мл из полипропилена с открытыми крышками, завернутые в крафт-бумагу по 4 штуки в упаковке, стерилизуют автоклавированием при 120°C (1,1 кг/см² [ОСТ 42-21-2-85. «Стерилизация и дезинфекция изделий медицинского назначения. Методы, средства и режимы», стр.9) 45 минут. Срок хранения стерильных пробирок типа Eppendorf трое суток.

Способ осуществляется следующим образом.

1. Культуры для длительного хранения путем замораживания в стерильной консервированной донорской человеческой цельной крови, содержащей гемоконсервант ЦФДА-1, выращивают на соответствующей питательной среде в необходимых условиях 18-24 часа.

2. В стерильные пробирки типа Eppendorf 1,5 мл из полипропилена с плотными крышками (такие пробирки устойчивы к резким перепадам температуры, которым они подвергаются, и выдерживают автоклавирование) наливают с помощью пипетки в условиях бокса или в ламинарном шкафу 2 класса биологической защиты по 1 мл стерильной консервированной донорской человеческой цельной крови.

3. Затем полную бактериологическую петлю диаметром 1 мм бактерии суспендируют в стерильной консервированной донорской человеческой цельной крови, содержащей гемоконсервант ЦФДА-1, разлитой в пробирки типа Eppendorf.

4. Пробирки типа Eppendorf с культурами маркируют, наклеивая на них полоску лейкопластыря, на которой нанесено простым карандашом название или номер культуры (данная маркировка не стирается от влаги).

5. Пробирки типа Eppendorf с культурой замораживают, помещая их предварительно в штатив для эппендорфов и затем в морозильную камеру холодильника при -20°C (такие бытовые холодильники имеются в лабораториях клинической микробиологии любого уровня).

6. Для высева замороженной культуры пробирки типа Eppendorf размораживают при комнатной температуре до полного оттаивания.

7. Затем в условиях бокса или в ламинарном шкафу 2 класса биологической защиты по 0,1 мл культуры высевают дозатором на соответствующую среду. Культуру распределяют равномерно по среде с помощью шпателя и инкубируют при необходимых условиях 18-24 часа.

Было протестировано хранение предлагаемым способом музейных тест-штаммов. Результаты представлены в Таблице 1.

Также авторы провели сравнительное исследование заявляемого способа длительного хранения прихотливых бактерий в консервированной цельной донорской крови путем замораживания и способа хранения бактерий путем замораживания в стерильной дефибринированной крови кролика для чего использовались музейные тест-штаммы, приведенные в таблице 1. Результаты исследований показали, что все примененные музейные тест-штаммы одинаково выживали и давали рост при высеве на соответствующие питательные среды через 1, 3, 6 месяцев и год от момента замораживания обоими способами. Но предлагаемый способ в условиях практической лаборатории клинической микробиологии является простым и доступным для лабораторий любого уровня, так как культуры замораживаются в морозильной камере холодильника при -20°C (бытовые холодильники), не используются дорогие дефицитные препараты: стерильная дефибринированная кровь кролика и скошенный агар с экстрактом сердечной мышцы для выращивания культуры перед замораживанием.