ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО С НЕФРОПРОТЕКТОРНЫМ ДЕЙСТВИЕМ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к области разработки новых эффективных фитопрепаратов нефропротекторного действия.

Уровень техники

В настоящее время количество больных с нефропатологией стремительно растет. Вместе с тем, в медицине практически отсутствуют лекарственные препараты, способные оказывать лечебное патогенетическое воздействие при данных заболеваниях. В особенности это касается гломерулонефритов, при которых лечение сводится к попыткам замедления патологического процесса при помощи иммунодепрессантов, и в итоге практически всегда данное заболевание фатально. Большое значение имеют при лечении почечных больных фитопрепараты, используемые обычно в виде водных отваров и настоев, реже в виде спиртовых экстрактов. Отвар листьев толокнянки или брусники обладает антимикробным действием на микрофлору мочевых путей за счет арбутина, мягким спазмолитическим действием и с успехом используется при пиелонефритах и почечнокаменной болезни. Отвары хвоща полевого, ортосифона тычиночного, цветов василька синего, березовых почек - стимулируют выделение мочи (диуретический эффект), что имеет терапевтическую ценность при отеках почечного происхождения. Леспенефрил (спиртовый экстракт леспедезы головчатой) и фларонин (препарат из астрагала серпоплодного) увеличивают диурез и при этом стимулируют азотовыделительную функцию почек, что позволяет их использовать в комплексе лечебных средств при хронической почечной недостаточности. Ряд фитопрепаратов эффективны при лечении почечнокаменной болезни - канефрон, цистон, препараты марены красильной, спорша и другие. Однако имеющиеся в арсенале медицины препараты оказывают преимущественно симптоматическое действие, не прекращающие развитие патологического процесса. Поэтому большое значение имеет разработка лекарственных препаратов, способных оказать лечебное воздействие на патологический процесс в паренхеме почки, в особенности при развитии гломерулонефрита - наиболее тяжелого и наиболее резистентного к терапии заболевания.

В медицине Монголии и Тибета для лечения болезней почек применяют настои широко известного касатика тонколистного (Iris teniufolia), произрастающего в южно-гобийских районах Монголии. ООО «Монос Фарма», Монголия (производитель ООО «Фармамед», РФ) предлагает на рынок спиртовый экстракт касатика тонколистного (http://www.farmamedspb.ru/component/content/article/21-bad.html) в качестве нефропротекторного средства. Кроме того, ветеринарный препарат «Фитодок-нефроспас», предлагаемый ООО « АгроВетЗащита» как нефропротекторное средство, в качестве действующего вещества содержит очищенный спиртовый экстракт подземной части касатика тонколистного (Iris tenuifolia) ( id=370)

Следует отметить, что известно применение препаратов из различных видов касатиков по всевозможным показаниям, например: для ослабления или снятия напряжения с кожных и/или подкожных тканей (W0 97/35556, 1997.10.02, RU 98119466, опубл. 27.08.2000), для стимулирования роста костей (2004121173, опубл. 10.01.2006), для биологической очистки воды от солей (RU 2094392, опубл. 27.10.1997), в качестве противоожогового средства (RU 2195307, опубл. 27.12.2002), для регулирования веса и профилактики ожирения у домашних животных (RU 2313228, опубл. 27.12.2007), в онкологической практике (Яковлев Г.П., Блинова К.Ф. Ботанико-фармакогностический словарь. - М.: Высшая школа, 1990, с.192.), в качестве отхаркивающих и болеутоляющих средств (Evans W.C. Trease aand Evans. Pharmacognosy. 14-th Edition. London, 1996, c.327 и 476). Кроме того, известен комплекс, предложенный в RU 2123349, опубл. 20.12.1998 с противовоспалительным, иммуномодулирующим и антигипоксическим действием, представляющий собой сухой экстракт касатика молочно-белого (Iris lactea Pallas). На его основе были предложены различные лекарственные формы: таблетки, пастилки, сиропы… (RU 2140277, опубл. 27.10.1999). В (дисс. канд. биол. наук Сивак К.В. Фармакологическое изучение ряда растительных нефропротекторов (экспериментальное исследование), Санкт-Петербург, 2007) было отмечено, что сухой экстракт касатика молочно-белого является перспективным для создания лекарственных препаратов нефропротекторного действия и для клинического изучения.

Однако описанные выше лекарственные формы - и жидкие, и сухой экстракты - требуют использования больших количеств пищевого спирта, что влечет известные экономические затраты и организационные трудности, в результате процедура становится не рентабельной. Хранение, перевозка и продажа ГЛФ, содержащих спирт, также связана с большими трудностями. В [RU 2140277 опубл. 27.10.1999] предложен сироп, содержащий 62-66% сахара, изготовление которого проводится из сухого экстракта касатика молочно-белого, применяемого в качестве иммуномодулятора. Хотя при этом решается ряд проблем, связанных с логистикой (т.к. препарат не содержит высоких концентраций этанола, не пожароопасен), однако эта форма имеет ряд недостатков:

- для растворения экстракта авторы, наряду с сахарным сиропом, добавляют этанол;

- сам сухой экстракт производится путем экстракции этанолом и с последующей отгонкой растворителя;

- сахар делает невозможным стандартизацию препарата по полисахаридам, которые считаются компонентом, в наибольшей степени ответственным за терапевтические эффекты фитопрепарата.

Таким образом, целью изобретения являлось решение двух проблем:

- разработка фитопрепарата с выраженным нефропротекторным действием и, в частности, пригодного для лечения гломерулонефритов;

- полное исключение использования пищевого спирта из технологического процесса.

Раскрытие изобретения

Изобретение реализовано тем, что предложено лекарственное средство с нефропротекторным действием, представляющее собой экстракт травы с корнями и корневищами касатика тонколистного [Iris tenuifolia] водным раствором многоатомного спирта, содержащий стабилизаторы и консерванты.

Неожиданным оказалось, что экстракция сухой травы с корнями и корневищами касатика тонколистного [Iris tenuifolia] 30-70%-ными водными растворами (при весовом соотношении экстрагент: сухая трава с корневищем =(4÷5):1) таких многоатомных спиртов, как 1,2-пропиленгликоль, и/или глицерин, и/или сорбит, и/или ксилит и другие, проходит более эффективно, нежели экстракция 30-70%-ным раствором этанола. При этом в экстракт переходят и полисахариды, предположительно в значительной мере определяющие основные эффекты препарата, в то время как экстракция концентрированными растворами этанола практически их не извлекает (см. таблицу 1).

Поскольку водные растворы многоатомных спиртов обладают повышенной вязкостью, оказалось целесообразным проводить экстракцию при умеренно повышенных температурах (60-90)°С; при температуре ниже 60°С раствор излишне вязкий и удерживается шротом, при температуре выше 90°С возможна деструкция компонентов (гликозидов, флавоноидов и ксантонов) экстракта. Изучение кинетики экстракции показало, что в этих условиях равновесные концентрации индикаторных компонентов (флавоноидов, полисахаридов, иридоидов) устанавливаются через 4-7,5 часов в зависимости от температуры и экстрагента, в то время как при использовании в качестве экстрагента 50%-го этанола при комнатной температуре равновесные концентрации индикаторных компонентов устанавливаются через 3 суток.

В экстракте могут быть использованы в качестве стабилизаторов аскорбиновая кислота в концентрации (0,1-1,0)%, являющаяся антиоксидантом и поддерживающая рН в области максимальной химической стабильности фитоэкстракта (от 3,5 до 5,0), и в качестве консервантов - бензойная кислота или ее фармацевтически приемлемые соли в концентрации (0,01-0,5)% и/или сорбиновая кислота или ее фармацевтически приемлемые соли в концентрации (0,01-0,6)%. При концентрации консервантов меньше 0,01% лекарственное средство не выдерживает заявленного срока годности (2 года) по микробиологической чистоте. В то же время использовать консерванты в количествах, больших, чем заявлено (для бензойной кислоты и ее солей - 0,5%, для сорбиновой кислоты и ее солей - 0,6%), нецелесообразно. Предлагаемые в качестве бактериостатиков-стабилизаторов для «сиропов» эфиры п-оксибензойной кислоты («парабены») также могут быть использованы, но менее приемлемы ввиду известных побочных эффектов.

Полученные таким образом сиропы стабильны при хранении (пример 1, 2, 6, 7), обладают выраженным и достоверным эффектом при лечении почечной патологии, при этом терапевтический эффект значительно превышает эффект известного нефропротекторного препарата - «Леспефрил» (пример 14).

Высокоактивные экстракты с нефропротекторным действием могут быть получены при однократной экстракции травы с корнями и корневищами касатика тонколистного (Iris tenuifolia) водными растворами многоатомных спиртов с указанными выше концентрациями и в указанных условиях. Однако в этом случае значительное количество экстракта удерживается шротом и теряется: до 600-700 г с загрузки сухой травы в 500 г. Для исключения потерь экстрактивных веществ, увеличения степени экстракции, снижения непроизводительных потерь многоатомного спирта экстракцию выгодно проводить в три этапа. Каждую порцию травы касатика тонколистного с корневищем экстрагируют трижды, при этом экстрагент для сухой травы готовят смешением многоатомного спирта и экстракта, полученного при второй экстракции, в качестве экстрагента для второй экстракции используют экстракт, полученный при заключительной третьей экстракции, а в качестве экстрагента для третьей экстракции используют воду.

При этом в шроте практически не остается ценных экстрактивных веществ и отсутствуют потери многоатомного спирта. Таким образом, предложенный способ получения лекарственного препарата позволяет максимально извлечь из шрота биологически активные вещества при минимальной потере ценных компонентов.

Чтобы уменьшить деструкцию гликозидов, флаваноидов и ксантонов при термическом воздействии в процессе экстракции, а также исключить рост микроорганизмов во влажном шроте (между первой и второй; второй и третьей экстракциями), стабилизаторы и консерванты целесообразно загружать в экстрагент для сухой травы. В случае, если концентрация аскорбиновой кислоты или консервантов в «продукте» меньше нижнего предела (для аскорбиновой кислоты - 0,1%, для консервантов - 0,01%), расчетное количество необходимых компонентов добавляют в конечный сироп.

Количество многоатомного спирта, взятое при приготовлении экстрагента для сухой травы, составляет в весовом соотношении к сухой траве (1,2÷2,8):1, а количество воды, взятое для заключительной третьей экстракции, составляет в весовом отношении к сухой траве (1,2÷3):1.

Полученный сироп был протестирован на фармакологическую (нефропротекторную) активность, была определена его острая и хроническая токсичность, проведено изучение его аллергенности и иммунотоксичности, эмбриотоксичности, мутагенного и канцерогенного действия, влияние на репродуктивную функцию (отчет об экспериментальном доклиническом изучении безопасности и фармакологической активности препарата «Нефромон сироп для приема внутрь» производства ООО «Фармамед», ФГБУН ИТ ФМБА России, г.Санкт-Петербург, 2012) из расчета его применения по 5-10 мл 3 раза в день. В результате проведенных исследований препарат «Нефромон сироп для приема внутрь» был рекомендован для клинических исследований при патологии почек в качестве малотоксичного и эффективного лекарственного средства.

Результаты изучения острой токсичности и токсикометрии препарата «Нефромон сироп для приема внутрь» (см. пример 12) позволяют отнести его к V классу практически нетоксичных лекарственных веществ (Н.Hodge et al. Clinical Toxicology of Commercial Products. Acute Poisoning. Ed. IV, Baltimore, 1975, 427 p.) и малоопасным веществам (IV класс опасности по ГОСТ 12.1.007-76).

По результатам исследований подострой и хронической токсичности препарата «Нефромон сироп для приема внутрь» (см. пример 13) применение его при внутрижелудочном введении один раз в сутки в течение 90 дней в дозах 500, 5000 и 10000 мг/кг у крыс обоих полов не вызывает изменений внешнего вида, общего состояния и поведения животных, не оказывает негативного влияния на биохимические параметры крови и основные физиологические функции организма, не вызывает патоморфологических изменений, что свидетельствует о хорошей переносимости и безвредности лекарственной формы препарата.

Разработанное лекарственное средство позволяет осуществлять эффективное лечение тяжелого, считавшегося практически неизлечимым, заболевания почек с фатальным исходом - хронического гломерулонефрита, при этом восстанавливается как выделительная функция почек, так нормализуются и иммунные факторы с затуханием аутоиммунного процесса разрушения структуры почки (пример 14). Предложенный способ лечения хронического гломерулонефрита заключается в длительном, до нормализации почечных функций, перроральном введении разработанного лекарственного препарата, при этом оптимальная доза и схема приема - трижды в день по 5-10 мл экстракта. Предложенный способ лечения может быть использован как в виде монотерапии, так и сопровождаться использованием других терапевтических агентов - антибиотиков, иммуномодуляторов и т.д., применение которых сочтет необходимым лечащий врач.

Краткое описание чертежей

Фиг.1. Жировая дистрофия нефроэпителия извитых канальцев почки отравленной крысы. Окраска судан. Увеличение 40×7.

Фиг.2. Белковая дистрофия нефроэпителия проксимальных канальцев коркового вещества почки отравленной крысы. Неразличимость клеточных границ, пикноз ядер, слущенные клетки в просвете канальцев. Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение 40×7.

Фиг.3. Практически нормальное строение коркового вещества почки отравленной крысы после лечения «Нефромоном сиропом для приема внутрь». Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение 40×7.

Осуществление изобретения

Пример 1 (сорбит, 90°С, трехступенчат, экстракция)

Первая экстракция

В стеклянный реактор помещают 500 г травы (с незначительным уплотнением) с корнями и корневищами касатика тонколистного.

В стеклянный стакан объемом 2 л помещают экстракт, полученный при второй экстракции предыдущей загрузки, подогревают до 30°С и при перемешивании стеклянной палочкой вносят 1 кг сорбита; при снижении температуры стакан с экстрагентом подогревают. После полного растворения сорбита в стакан добавляют 10 г фармакопейной аскорбиновой кислоты и 5 г сорбата калия; перемешивают до полного растворения и загружают в реактор с травой. Нагревают содержимое реактора до 90°С и выдерживают при этой температуре; через 3 часа выдержки определяют суммарное содержание флавоноидов в экстракте СФ-методом (фотометрирование в виде алюминиевого комплекса), анализ повторяют через 1 час; при совпадении результатов анализа процесс экстракции завершают, при увеличении концентрации флавоноидов выдержку удлиняют на 1 час и повторно определяют содержание флавоноидов.

После завершения экстракции горячий экстракт сливают (самотеком) на стеклянную воронку и фильтруют. Получают 1250 г темно-коричневого фильтрата с приятным характерным запахом - экстракта травы с корнями и корневищами касатика тонколистного. Параметры экстракта следующие:

- рН 4,5

- плотность 1,26 г/см³ (при 20°С)

- суммарное содержание флавоноидов в пересчете на апигенин (УФ спектрофотометрия) 1,9 мг/мл

- содержание полифенолов в пересчете на галловую кислоту 5,0 мг/мл

- содержание полисахаридов 77,0 мг/мл

- содержание иридоидов в пересчете на гарпагида ацетат 1,1 мг/мл

- микробиологическая чистота:

- общее число аэробных бактерий в 1 г 1,0×10³ (норма не более 10⁴)

- общее число грибов в 1 г - отсутствует

- Е. coli в 1 г - отсутствуют

- Salmonella в 10 г - отсутствует

- энтеробактерий в 1 г - менее 10 (норма - не более 10²)

- St. Aureus в 1 г - отсутствует

Вторая экстракция

К шроту в реакторе приливают экстракт, полученный при третьей экстракции предыдущей загрузки, подогревают до 90°С и выдерживают до установления равновесной концентрации индикаторных компонентов (суммы флавоноидов) в жидкой фазе; затем фильтруют. Получают экстракт №2, который используют для приготовления экстрагента на первой экстракции последующей загрузки.

Третья экстракция

К оставшемуся в реакторе шроту приливают 1500 мл воды очищенной, выдерживают при 90°С до установления равновесной концентрации индикаторных компонентов (суммы флавоноидов) в жидкой фазе и фильтруют. Полученный при этом экстракт №1 используют для второй экстракции последующей загрузки. Получают 1358 г влажного шрота (65,5% влаги), практически не содержащего в определяемых количествах флавоноиды, полисахариды, иридоиды.

После двух лет хранения параметры полученного экстракта травы с корнями и корневищами касатика тонколистного следующие:

- рН 4,48 - плотность 1,22 г/см³ (при 20°С)

- суммарное содержание флавоноидов в пересчете на апигенин 1,6 мг/мл

- содержание полифенолов в пересчете на галловую кислоту 4,5 мг/мл

- содержание полисахаридов 73,0 мг/мл

- содержание иридоидов 0,9 мг/мл

- микробиологическая чистота:

- общее число аэробных бактерий в 1 г 1,6×10³ (норма не более 10⁴)

- общее число грибов в 1 г - отсутствует

- Е. coli в 1 г - отсутствуют

- Salmonella в 10 г - отсутствует

- энтеробактерий в 1 г - менее 10 (норма - не более 10²)

- St. Aureus в 1 г - отсутствует

Таким образом, полученный сироп - экстракт травы с корнями и корневищами касатика тонколистного (Iris teniufolia), стабилен при хранении в течение 2-х лет.

Пример 2 (одноступенчатая экстракции, 90°С, 50%-ный сорбит)

В стеклянный реактор объемом 2000 мл помещают 500 г травы с корнями и корневищами касатика тонколистного (Iris teniufolia). Отдельно в стеклянном стакане растворяют 1 кг сорбита в 1 л воды при перемешивании и подогреве до 30-40°С (сорбит растворяется со значительным понижением температуры). В теплый раствор сорбита вносят 5 г сорбата калия и 10 г аскорбиновой кислоты фармакопейного качества. Полученный раствор приливают в реактор, массу подогревают до 90°С и выдерживают при этой температуре, через 3 часа выдержки определяют суммарное содержание флавоноидов в экстракте СФ-методом (фотометрирование в виде алюминиевого комплекса), анализ повторяют через 1 час; при совпадении результатов анализа процесс экстракции завершают, при увеличении концентрации флавоноидов выдержку удлиняют на 1 час и повторно определяют содержание флавоноидов.

Раствор самотеком выгружают из реактора на стеклянную воронку, фильтруют под вакуумом. Получают 765 г темно-коричневого экстракта травы с корнями и корневищами касатика тонколистного со следующими параметрами:

- темно-коричневый сироп с небольшим осадком, мутноватый, имеет характерный приятный запах

- рН - 4,6

- плотность - 1,12 г/см³

- суммарное содержание флавоноидов в пересчете на апигенин 1,7 мг/мл

- содержание полисахаридов 65.9 мг/мл

- содержание иридоидов 1,0 мг/мл

- содержание полифенолов 3,5 мг/мл

- микробиологическая чистота:

- общее число аэробных бактерий в 1 г 1,5×10³ (норма не более 10⁴)

- общее число грибов в 1 г - менее 10 (норма не более 10²)

- Е. coli в 1 г - отсутствуют

- Salmonella в 10 г - отсутствует

- энтеробактерий в 1 г - менее 10 (норма - не более 10²)

- St. Aureus в 1 г - отсутствует

После двух лет хранения параметры «продукта» следующие:

- темно-коричневый прозрачный сироп с пленкой осадка на дне, имеет характерный приятный запах

- рН - 4,5

- плотность - 1,09 г/см³

- суммарное содержание флавоноидов в пересчете на апигенин 1,68 мг/мл

- содержание полисахаридов 64,0 мг/мл

- содержание иридоидов 0,9 мг/мл

- содержание полифенолов 3,45 мг/мл

- микробиологическая чистота:

- общее число аэробных бактерий в 1 г 1,8×10³ (норма не более 10⁴)

- общее число грибов в 1 г - отсутствует

- E. coli в 1 г - отсутствуют

- Salmonella в 10 г - отсутствует

- энтеробактерий в 1 г - менее 10 (норма - не более 10²)

- St. Aureus в 1 г - отсутствует

Таким образом, полученный сироп - экстракт касатика тонколистного (Iris teniufolia), стабилен при хранении в течение 2-х лет.

Пример 3 (сорбит, 60°С)

Первая экстракция

В стеклянный реактор, размещенный в бане термостата, помещают 500 г травы с корнями и корневищами касатика тонколистного (Iris teniufolia). В 2-литровый стакан помещают экстракт, полученный при второй экстракции предыдущей загрузки, в количестве 1470 г (1210 мл) и 1000 г сорбита пищевого; содержимое стакана медленно подогревают до 40°С при перемешивании, объем массы 1960 мл. В стакан добавляют 5 г сорбата калия и 10 г аскорбиновой кислоты, перемешивают до растворения. Полученный темно-коричневый сироп приливают в реактор. Содержимое реактора нагревают до 60°С и выдерживают до достижения равновесной концентрации индикаторных компонентов (флавоноидов) в жидкой фазе; процесс экстракции занимает 6,0 часов. Затем горячий раствор сливают на стеклянный фильтр с пористой пластиной, фильтруют и получают 1320 г раствора темно-коричневого цвета, с характерным приятным запахом - экстракт травы с корнями и корневищами касатика тонколистного («продукт»).

Вторая экстракция

К шроту в реакторе приливают экстракт, полученный при третьей экстракции предыдущей загрузки; количество этого экстракта 1620 г. Шрот в реакторе с экстрактом нагревают до 60°С и выдерживают при этой температуре до достижения равновесной концентрации индикаторных компонентов (флавоноидов) в жидкой фазе; затем сливают экстракт самотеком на воронку и фильтруют. Получают 1470 г экстракта №2, который используют для приготовления экстрагента на первой экстракции следующей загрузки.

Третья экстракция

К шроту в реакторе добавляют 1500 мл дистиллированной воды, нагревают до 60°С в массе и выдерживают при этой температуре до достижения равновесной концентрации индикаторных компонентов (флавоноидов) в жидкой фазе, после чего фильтруют так, как описано выше. Получают 1620 г экстракта №1, который используют для второй экстракции последующей загрузки.

Количество влажного шрота 1520 г; после сушки до постоянного веса количество сухого шрота 486 г; экстракция 70%-ным этанолом сухого шрота и последующий анализ полученного экстракта свидетельствует о практическом отсутствии в конечном шроте экстрактивных веществ.

Параметры экстракта травы с корнями и корневищами касатика тонколистного («продукта») на момент фасовки следующие:

- темно-коричневый мутноватый, пенящийся сироп с характерным приятным запахом

- рН - 4,51

- плотность - 1,28 г/см³

- суммарное содержание флавоноидов в пересчете на апигенин 2,0 мг/мл

- содержание иридоидов 1,2 мг/мл

- содержание полисахаридов 72,0 мг/мл

- содержание полифенолов 3,5 мг/мл

После двух лет хранения в естественных условиях:

- прозрачный темно-коричневый, пенящийся сироп с характерным приятным запахом

- рН - 4,51

- плотность - 1,23 г/см³

- суммарное содержание флавоноидов в пересчете на апигенин 1,8 мг/мл

- содержание иридоидов 1,1 мг/мл

- содержание полисахаридов 70,0 мг/мл

- содержание полифенолов 3,46 мг/мл

Пример 4 (ксилит, 60°С)

Процесс проводят по примеру 3, но в качестве многоатомного спирта используют ксилит в количестве 1 кг. Получают 1411 г экстракта со следующими параметрами:

- темно-коричневый мутноватый пенящийся сироп с приятным характерным запахом

- рН - 4,4

- плотность - 1,24 г/см³

- суммарное содержание флавоноидов в пересчете на апигенин 1,4 мг/мл

- содержание иридоидов 1,6 мг/мл

- содержание полисахаридов 57,0 мг/мл

- содержание полифенолов 7,1 мг/мл

- микробиологическая чистота:

- общее число аэробных бактерий в 1 мл 6×10² (норма не более 10⁴)

- общее число грибов в 1 мл - менее 10 (норма не более 10²)

- Е. coli в 1 мл - отсутствуют

- Salmonella в 10 мл - отсутствует

- энтеробактерий в 1 мл - менее 10 (норма - не более 10²)

- St. Aureus в 1 мл - отсутствует

Пример 5 (1,2-пропиленгликоль, 60°С)

Процесс проводят по примеру 3, но в качестве многоатомного спирта используют 1,2-пропиленгликоль в количестве 1 кг. Получают 1502 г экстракта со следующими параметрами:

- темно-коричневый мутноватый пенящийся сироп с приятным характерным запахом

- рН - 4,9

- плотность - 1,1 г/см³

- суммарное содержание флавоноидов в пересчете на апигенин 3,0 мг/мл

- содержание иридоидов 0,8 мг/мл

- содержание полисахаридов 82,0 мг/мл

- содержание полифенолов 6,1 мг/мл

- микробиологическая чистота:

- общее число аэробных бактерий в 1 мл 2×10³ (норма не более 10⁴)

- общее число грибов в 1 мл - менее 10 (норма не более 10²)

- Е. coli в 1 мл - отсутствуют

- Salmonella в 10 мл - отсутствует

- энтеробактерий в 1 мл - менее 10 (норма - не более 10²)

- St. Aureus в 1 мл - отсутствует

Пример 6 (глицерин)

В стеклянный реактор объемом 2000 мл помещают 500 г травы с корнями и корневищами касатика тонколистного. Отдельно в стеклянный стакан помещают 1400 г сухого глицерина (х.ч.), добавляют 20 г аскорбиновой кислоты, 12 г сорбата калия и 10 г бензоата натрия, затем добавляют воду до 2 кг и перемешивают магнитной мешалкой до полного растворения компонентов. Полученным раствором заливают траву в реакторе, массу подогревают при помощи термостата до 80±5°С и выдерживают, периодически определяя суммарное содержание флавоноидов (СФ-метод) до установления их равновесной концентрации; процесс экстракции занимает 7,5 часов. Раствор самотеком сливают с реактора на стеклянную воронку, фильтруют под вакуумом. Получают 954 г мутного оранжевого сиропа - экстракта травы с корнями и корневищами касатика тонколистного, с характерным приятным запахом, с небольшим светлым осадком.

Параметры экстракта следующие:

- плотность 1,19 г/см³

- рН - 4,7

- содержание флавоноидов в пересчете на апигенин 1,9 мг/мл

- содержание полифенолов в пересчете на галловую кислоту 9,0 мг/мл

- содержание полисахаридов 58,2 мг/мл

- содержание иридоидов 1,2 мг/мл

После двух лет хранения:

- мутноватый, коричневый, пенящийся сироп с приятным характерным (фруктовым) запахом, сладковато-горького вкуса, с небольшим светлым осадком

- плотность 1,19 г/см³

- рН - 4,6

- содержание флавоноидов в пересчете на апигенин 1,8 мг/мл

- содержание полифенолов в пересчете на галловую кислоту 8,5 мг/мл

- содержание полисахаридов 57,8 мг/мл

- содержание иридоидов 1,0 мг/мл

Пример 7 (ксилит, 1,2-пропиленгликоль, рН 3,5)

В стеклянный реактор объемом 2000 мл помещают 500 г травы с корнями и корневищами касатика тонколистного. Отдельно в стеклянный стакан помещают 670 г ксилита, 670 г 1,2-пропиленгликоля, добавляют 2 г аскорбиновой кислоты и воду до 2 кг; массу перемешивают до полного растворения компонентов. Т.к. растворение сопровождается снижением температуры раствора, стакан подогревают на водяной бане. Полученным раствором заливают траву в реакторе, массу подогревают при помощи термостата до (80±5)°С и выдерживают, периодически определяя суммарное содержание флавоноидов, до прекращения роста их концентрации в жидкой фазе; процесс экстракции занимает 7,5 часов. Раствор самотеком сливают с реактора на стеклянную воронку, фильтруют под вакуумом. Получают 1015 г светло-коричневого экстракта с характерным приятным запахом - экстракта травы с корнями и корневищами касатика тонколистного. К сиропу фильтрату добавляют 0,2 г сорбиновой кислоты и 0,2 г бензойной кислоты, перемешивают стеклянной палочкой, при этом интенсивность окраски экстракта снижается.

Параметры экстракта следующие:

- плотность 1,21 г/см³

- рН - 3,5

- содержание флавоноидов в пересчете на апигенин 2,1 мг/мл

- содержание полифенолов в пересчете на галловую кислоту 5,4 мг/мл

- содержание полисахаридов 63,7 мг/мл

- содержание иридоидов 0,4 мг/мл

После двух лет хранения образца экстракта в нормальных условиях:

- светло-коричневый прозрачный сироп с приятным запахом, горьковато-сладкого вкуса, с незначительным темным осадком

- плотность 1,21 г/см³

- рН 3,5

- содержание флавоноидов в пересчете на апигенин 2,05 мг/мл

- содержание полифенолов в пересчете на галловую кислоту 5,2 мг/мл

- содержание полисахаридов 63,5 мг/мл

- содержание иридоидов 0,4 мг/мл

- микробиологическая чистота:

- общее число аэробных бактерий 1 г 1,4×10³ (норма не более 10⁴) КОЕ

- общее число грибов в 1 г - менее 10 КОЕ

- Salmonella в 10 г - отсутствует

- энтеробактерии в 1 г - отсутствуют

- St.Aureus в 1 г - отсутствует

Таким образом, концентрация стабилизатора аскорбиновой кислоты 0,1% и консерванта сорбиновой кислоты 0,01% достаточна для стабилизации продукта.

Пример 8 (70%-ный 1,2-пропиленгликоль, 70°С)

В стеклянном стакане, снабженном магнитной мешалкой, смешивают 700 г 1 2-пропиленгликоля, 5 г аскорбиновой кислоты и 2,5 г сорбата натрия, добавляют воду до 1 кг и перемешивают до полного растворения компонентов.

В другой стакан помещают 100 г травы с корнями и корневищами касатика тонколистного, добавляют 400 г приготовленного экстрагента и выдерживают на водяной бане при 70°С до прекращения роста концентрации флавоноидов в жидкой фазе, это занимает 6,5 часов. Горячий раствор сливают, фильтруют. Получают 274 г экстракта травы с корнями и корневищами касатика тонколистного с характерным приятным запахом, горьковатого вкуса, со следующими параметрами:

- плотность при 20°С 1,04 г/см³

- рН - 5,0

- суммарное содержание флавоноидов в пересчете на апигенин 2,3 мг/мл

- содержание полифенолов в пересчете на галловую кислоту 5,7 мг/мл

- содержание полисахаридов 69,1 мг/мл

- содержание иридоидов 1,2 мг/мл

Пример 9 (30%-ный 1,2-пропиленгликоль, 70°С)

Опыт проводят аналогично примеру 8, но для приготовления экстрагента используют 300 г 1,2-пропиленгликоля, 4 г аскорбиновой кислоты, 2,0 г бензоата калия и воду до 1 кг. Для экстракции 100 г травы с корнями и корневищами берут 400 г приготовленного экстрагента. В результате экстракции получают 236 г темно-коричневого экстракта с характерным приятным запахом, имеющего следующие параметры:

- плотность при 20°С 1,03 г/см³

- рН - 4,7

- содержание флавоноидов в пересчете на апигенин 1,1 мг/мл

- содержание полифенолов в пересчете на галловую кислоту 4,0 мг/мл

- содержание полисахаридов 59,7 мг/мл

- содержание иридоидов 0,4 мг/мл

Пример 10 (Сравнительный опыт)

Опыт проводят по примеру 2, но в качестве экстрагента используют 70% этиловый спирт, стабилизаторы и консерванты не добавляют. Экстракцию проводят при 20-25°С до прекращения роста концентрации флавоноидов в жидкой фазе, процесс длится в течение 3,5 суток. Жидкую фазу сливают и фильтруют. Получают 1315 г спиртового экстракта темно-коричневого цвета, имеющего следующие параметры:

- плотность при 20°С 0,97 г/см³

- содержание флавоноидов в пересчете на апигенин 0,2 мг/мл

- содержание полифенолов в пересчете на галловую кислоту 0,7 мг/мл

- содержание полисахаридов 4,7 мг/мл

- содержание иридоидов 0,5 мг/мл

Таким образом, этиловый спирт - значительно менее эффективный экстрагент нежели многоатомные спирты.

Пример 11 (Промышленный пример)

Первая экстракция: В эмалированный перколятор объемом 100 л, снабженный рубашкой и «ложным» дном, загружают 25,0 кг травы с корнями и корневищами касатика тонколистного. В полимерный барабан объемом 200 л помещают 73,5 кг (60,5 л) экстракта, полученного при второй экстракции предыдущей загрузки, и 50,0 кг сорбита (пищевого), 0,25 кг сорбата калия (пищевого) и 0,5 кг аскорбиновой кислоты (ФС 42-2668-95). Смесь перемешивают штоком, затем при помощи вакуума забирают в перколятор. Включают термостат, установленный на 90°С; начало выдержки отсчитывают от момента, когда температура массы в верхней части перколятора достигает 60°С. В этих условиях выдерживают до прекращения роста концентрации флавоноидов в жидкой фазе. Затем на верхний фланец перколятора устанавливают эмалированную решетку и фильтр-пакет из двух политерефталатных фильтрующих полотен, между которыми помещен слой медицинской (стерильной) ваты толщиной 5 см. Перколятор переворачивают и создают давление 3 атм подачей инертного газа. Горячий фильтрат собирают в полимерный барабан объемом 200 л, предварительно обработанный 70%-ным раствором этилового спирта. Получают 62,5 кг (50,0 л) экстракта травы с корнями и корневищами касатика тонколистного («продукта»).

Вторая экстракция: Перколятор возвращают в прежнее положение, снимают фильтрующий пакет. К шроту приливают экстракт, полученный при третьей экстракции предыдущей загрузки, в количестве 81,0 кг и выдерживают при температуре в реакционной массе (60-90)°С до прекращения роста концентрации флавоноидов в жидкой фазе. После этого устанавливают фильтр-пакет, экстракт отфильтровывают в полимерный барабан под давлением инертного газа. Получают экстракт №2 (в количестве 73,5 кг), который используют для приготовления экстрагента на первой экстракции следующей загрузки.

Третья экстракция: В перколятор вакуумом загружают 75,0 л воды очищенной и проводят экстракцию шрота при (60-90)° до прекращения роста концентрации флавоноидов в жидкой фазе. Полученный при этом экстракт №1 (в количестве 81,0 кг) используют для второй экстракции последующей загрузки. На термостате отключают нагрев и подают воду для охлаждения системы; после остывания до (25-30)°С шрот выгружают и передают на утилизацию.

Полученный в количестве 62,5 кг экстракт («продукт») имеет следующие параметры:

ЗАКЛЮЧЕНИЕ: ОБРАЗЕЦ СООТВЕТСТВУЕТ ТРЕБОВАНИЯМ ТУ.

Пример 12 (Исследование острой токсичности)

Определение показателей острой токсичности включало эксперименты на грызунах (мышах, крысах).

Регистрируемые показатели: летальность, время гибели животных, симптоматика отравления, ежедневное наблюдение общего состояния и поведения, взвешивание, потребление корма и воды, вскрытие и макроскопическое описание погибавших и всех выживших животных в конце исследования (эвтаназия осуществлялась передозировкой эфира), оценка местно-раздражающего действия, определение массовых коэффициентов внутренних органов.

Препарат вводили белым крысам и мышам обоего пола (по 6 животных одного пола) внутрижелудочно (в/ж) через атравматичныйй зонд в возрастающих дозах по Литчфилду-Уилкоксону. Период последующего наблюдения составлял 14 суток.

Исследованный диапазон доз составил 5000, 10000 и 15000 мг/кг (мкл/кг). Высокие дозы достигались повторными введениями препарата с интервалом 30 минут. Контрольные животные получили аналогичные объемы дистиллированной воды с интервалом 30 минут (максимальный объем растворителя).

Ни в одной из экспериментальных групп, ни у мышей, ни у крыс, гибели не отмечалось. Общее состояние и поведение животных соответствовало обычному.

В таблицах 3-4 приведены массовые коэффициенты внутренних органов мышей и крыс, усредненные по группам. Каких-либо достоверных различий между группами не выявлено.

Таким образом, по данным некропсии острое внутрижелудочное введение препарата «Нефромон сироп для приема внутрь» не вызывает макроскопических изменений внутренних органов, органов эндокринной системы и головного мозга подопытных белых крыс, а также не сопровождается воспалительными изменениями или раздражением слизистых оболочек желудка и кишечника.

Результаты токсикометрии - данные некропсии позволяют отнести лекарственную форму препарата «Нефромон сироп для приема внутрь» к V классу практически нетоксичных лекарственных веществ (Н. Hodge et al. Clinical Toxicology of Commercial Products. Acute Poisoning. Ed. IV, Baltimore, 1975, 427 p). Состояние животных после острого введения препарата свидетельствует о хорошей переносимости и безвредности препарата в дозах, превышающих максимальные терапевтические (порядка 0.5 мл/кг (500 мкл/кг, 500 мг/кг), исходя из 30 мл в сутки для человека средней массой 60 кг) в десятки раз.

Кроме этого, результаты токсикометрии позволяют отнести препарат «Нефромон сироп для приема внутрь» как химическое соединение к малоопасным веществам (IV класс опасности по ГОСТ 12.1.007-76).

Пример 13 (Исследование подострой и хронической токсичности)

Учитывая малую токсичность препарата, показанную в остром эксперименте, рекомендации нормативных документов МЗ СР РФ и правил GLP и величины максимальной терапевтической дозы (500 мг/кг), для оценки подострой токсичности был выбран срок 1 месяц, а хроническое введение осуществляли на протяжении 3 месяцев.

Животные: Крысы обоего пола, нелинейные, масса 180-190 г.

Беспородные собаки обоего пола, массой 10-16 кг.

Путь введения: Внутрижелудочно (Крысы - через атравматичный зонд; собаки - в глотку через роторасширитель с помощью резинового зонда через большой шприц Жане).

Дозы:

1 доза - 500 мг/кг - максимальная суточная человеческая доза;

2 доза - 5000 мг/кг (в 10 раз большая);

3 доза - 10000 мг/кг (в 20 раз большая). Ввести еще большую дозу технически затруднительно. На этой дозе каждая крыса получала более 2 мл препарата, что является почти предельным для крыс при в/ж введении.

Число животных. Крысы: по 15 животных каждого пола в группе:

1 доза - 15 самцов, 15 самок;

2 доза - 15 самцов, 15 самок;

3 доза - 15 самцов, 15 самок;

Контроль - 15 самцов, 15 самок.

Общее количество - 120, из них 30 - контрольная группа.

Собаки: по 3 животных каждого пола в группе:

1 доза - 3 самца, 3 самок;

2 доза - 3 самца, 3 самок;

3 доза - 3 самца, 3 самок;

Контроль - 3 самца, 3 самок.

Общее количество - 24, из них 6 - контрольная группа.

Длительность наблюдений: Общая продолжительность наблюдения - 90 дней.

После окончания введения животные всех групп были умерщвлены и подвергнуты вскрытию и патоморфологическому исследованию.

Регистрация показателей: Общее состояние оценивалось при ежедневном осмотре животных. Взвешивание, измерение ректальной температуры, потребления воды и корма выполнялось раз в неделю в первый месяц, затем - 1 раз в месяц и после окончания введения.

Физиологические, гематологические и биохимические исследования проводились до начала опыта, через 30 и 90 дней после начала исследования.

Исследования костного мозга, макроскопическое и гистологическое исследование внутренних органов проводилось после окончания введения и последующем умерщвлении.

В результате исследований было выявлено, что препарат не обладает кумулятивным эффектом, не вызывает изменений частоты сердечно-сосудистых сокращений и характера ЭКГ, не изменяет продолжительность гексеналового сна (т.е. не оказывает отрицательного влияния на детоксицирующую функцию печени), не оказывает влияния на морфологические показатели периферической крови, на активность ферментов и электролитный состав плазмы крови, на миелограмму крови (на органы кроветворения). Нагрузочные пробы с феноловым красным не выявили нарушений секреторной функции почек.

По результатам некропсии и гистологического исследования ежедневное внутрижелудочное введение препарата «Нефромон сироп для приема внутрь» в дозах 500, 5000 и 10000 мг/кг в течение 90 дней крысам и собакам обоего пола не вызывает раздражения, воспаления или деструкции тканей, а также не сопровождается развитием дистрофических, деструктивных, очаговых склеротических изменений в паренхиматозных клетках и строме внутренних органов.

Доказательства этих утверждений приведены в отчете об экспериментальном доклиническом изучении безопасности и фармакологической активности препарата «Нефромон сироп для приема внутрь» производства ООО «Фармамед», ФГБУН ИТ ФМБА России, г.Санкт-Петербург, 2012. В рамках заявки не представляется возможным привести такой большой массив данных.

При определении биохимических показателей периферической крови было отмечено достоверное снижение уровня глюкозы (см. таблицу 3, 4).

Пример 14 (Изучение фармакологической активности)

Материалы и методы исследования

Для моделирования токсического нефрозонефрита использовали этиленгликоль, который вводили однократно в/ж в дозе 2.5 г/кг крысам-самцам стандартной массы (160-170 г) через металлический атравматичный зонд.

«Нефромон сироп для приема внутрь» начинали вводить в/ж с 3-го дня в дозе 5000 мг/кг на протяжении 10 дней.

Препарат сравнения Леспефрил вводили в дозе 3 мл/кг (3000 мг/кг) в/ж 2 раза в день утром и вечером (в рекомендуемых производителем дозах). «Нефромон» и Леспефрил вводили животным perse.

Препарат «Леспефрил» представляет собой водно-спиртовый раствор очищенного экстракта леспедецы двуцветной (Lespedeza Bicolor), который применяется при лечении хронической почечной недостаточности различного происхождения. Он производится ЗАО «Вифитех» (Московская область, п.Оболенск). Серия 050610, годен до 01.2013 г.

Этиленгликоль был выбран, так как известно, что он вызывает классическое поражение почек с почечной недостаточностью и олигурическим синдромом [Рябов С.И. Болезни почек. Л., «Медицина», 1982, с.432].

Всего было сформировано 4 экспериментальные группы (каждая экспериментальная группа включала по 10 животных):

1. Интактные животные.

2. Животные с интоксикацией без лечения.

3. Животные с интоксикацией и лечением Леспефрилом.

4. Животные с интоксикацией и лечением «Нефромоном сиропом для приема внутрь»

Динамику веса крыс и относительной массы почек к весу тела определяли на весах ВЛР-500. Почки животных взвешивали на электронных весах 1602 МР немецкой фирмы «Sartorius».

Суточную мочу собирали, помещая животных в обменные клетки итальянской фирмы «Texnoplast». Анализ мочи осуществляли общепринятыми методами [Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник под ред. В.В. Меньшикова. М., «Медицина», 1987, с.365].

Кровь для биохимических исследований получали пункцией хвостовой вены крыс.

Активность клубочковой фильтрации (КФ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), содержание мочевины и креатинина в сыворотке крови, содержание белка в моче определяли с помощью наборов Био-Лат-Тест Чешской фирмы «Лахема», содержание церулоплазмина - по Бабенко [Клиническая оценка лабораторных тестов. Под ред. Н.У. Тица, М., «Медицина», 1986, с.480].

Умерщвленные декапитацией животные подвергались патологоанатомическому вскрытию и гистологическому исследованию.

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили по Стьюденту-Фишеру.

Результаты исследования

Эффективность «Нефромона сиропа для приема внутрь» и препарата сравнения оценивалась по нескольким группам показателей: морфометрическим, биохимическим, функциональным. Прежде всего, наблюдали клиническую картину интоксикации. Клиническая картина в группе крыс, получивших этиленгликоль без лечения, характеризовалась гиподинамией, заторможенностью, взъерошенностью шерсти, неопрятностью животных. Они хуже набирали вес, чем остальные крысы. На 2-й день у них развивалась макрогематурия, а с 4-го дня нарастала олигурия (таблица 7).

У всех животных без лечения развивались выраженные симптомы поражения почек: в анализе мочи определялись эритроциты, белок, цилиндры, кристаллы щавелевокислого кальция, клетки почечного эпителия. Страдали все функции почек: выделительная, экскреторная, секреторная; в крови нарастали продукты азотистого обмена, показатели цитолиза. Без лечения у животных была нарушена концентрационная функция почек (олигурия, моча щелочная, удельный вес, хлориды снижены); нарушена фильтрационная функция почек (глюкоза, белок, мочевина, креатинин повышены); снижена секреторная функция почек (снижена секреция фенолового красного); развивалась дистрофия нефрона (цилиндры, эритроциты, лейкоциты). Четверо животных без лечения к концу срока исследования погибли.

При морфологическом обследовании в почках обнаруживались дегенеративные изменения и мелкие кровоизлияния в паренхиму органов. На препаратах, окрашенных Суданом, наблюдалась жировая дистрофия нефроэпителия, в цитоплазме клеток извитых канальцев были видны мелкие капли жира (Фиг.1). На гистологических препаратах, окрашенных гематоксилин-эозином, были видны признаки белковой дистрофии эпителия проскимальных канальцев. Клеточные границы были неразличимы, цитоплазма интенсивно окрашивалась эозином, ядра были пикнотичными (Фиг.2).

Применение «Нефромона сиропа для приема внутрь» и препарата сравнения оказывало выраженное лечебное действие. Нормализовались морфометрические, биохимические и функциональные показатели почек, о чем свидетельствуют данные таблицы 7. Это подтверждалось и при гистологическом исследовании, где практически отсутствовали признаки дистрофических изменений нефроэпителия (Фиг.3).

Применение Леспефрила было менее эффективным, чем «Нефромона сиропа для приема внутрь».

Полученные результаты показали, что «Нефромон сироп для приема внутрь» восстанавливает функцию почек при тяжелом нефрозонефрите, вызванном этиленгликолем. «Нефромон сироп для приема внутрь» оказался эффективнее зарегистрированного МЗСР РФ средства Леспефрил, применяемого при почечной недостаточности различного генеза.